In vitro Differenziazione delle cellule dendritiche umane e dei loro marcatori nell'infezione da Leishmania

Sommario

Le cellule dendritiche (DC) sono componenti essenziali dell'immunità innata contro l'infezione da Leishmania. I meccanismi alla base della complessa interazione tra DC e Leishmania rimangono poco compresi. Qui, descriviamo i metodi per valutare come l'infezione da Leishmania influisce sulla funzione immunobiologica delle DC umane, come l'espressione di molecole costimolatorie e correlate alla migrazione.

Abstract

La leishmaniosi comprende un insieme di manifestazioni cliniche associate all'infezione dei protozoi intracellulari obbligati, la Leishmania. Il ciclo di vita dei parassiti Leishmania consiste in due fasi di vita alternate (amastigoti e promastigoti), durante le quali i parassiti risiedono rispettivamente all'interno di vettori artropodi o di ospiti vertebrati. In particolare, le complesse interazioni tra i parassiti della Leishmania e diverse cellule del sistema immunitario influenzano in gran parte l'esito dell'infezione. È importante sottolineare che, sebbene i macrofagi siano noti per essere la principale nicchia ospite per la replicazione della Leishmania , i parassiti vengono fagocitati anche da altre cellule immunitarie innate, come i neutrofili e le cellule dendritiche (DC).

Le DC svolgono un ruolo importante nel collegare i rami innato e adattativo dell'immunità e quindi orchestrano le risposte immunitarie contro un'ampia gamma di patogeni. I meccanismi attraverso i quali la Leishmania e le DC interagiscono rimangono poco chiari e coinvolgono aspetti della cattura del patogeno, le dinamiche di maturazione e attivazione delle DC, la migrazione delle DC ai linfonodi drenanti (dLN) e la presentazione dell'antigene alle cellule T. Sebbene un ampio numero di studi sostenga l'idea che le DC svolgano un duplice ruolo nella modulazione delle risposte immunitarie contro la Leishmania, la partecipazione di queste cellule alla suscettibilità o alla resistenza alla Leishmania rimane poco conosciuta. Dopo l'infezione, le DC subiscono un processo di maturazione associato alla sovraregolazione del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) II di superficie, oltre che alle molecole costimolatorie (CD40, CD80 e CD86).

Comprendere il ruolo delle DC nell'esito dell'infezione è fondamentale per lo sviluppo di strategie terapeutiche e profilattiche per modulare la risposta immunitaria contro la Leishmania. Questo articolo descrive un metodo per la caratterizzazione dell'interazione Leishmania-DC. Questo protocollo dettagliato fornisce una guida durante le fasi della differenziazione delle DC, la caratterizzazione delle molecole della superficie cellulare e i protocolli di infezione, consentendo agli scienziati di studiare la risposta delle DC all'infezione da Leishmania e di ottenere informazioni sui ruoli svolti da queste cellule nel corso dell'infezione.

Introduzione

La leishmaniosi è un complesso di malattie trascurate causate da diverse specie del genere Leishmania ¹. La Leishmania è un protozoo intracellulare della famiglia dei Trypanosomatidae che infetta l'uomo e altri mammiferi, causando uno spettro di malattie che vanno dalle lesioni cutanee alle forme viscerali². Le principali manifestazioni cliniche di questa malattia sono la leishmaniosi tegumentaria (TL) e la leishmaniosi viscerale (VL). L'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) stima che ogni anno si verifichino da 700.000 a 1 milione di nuovi casi, causando 70.000 decessi ogni anno². In tutto il mondo, la leishmaniosi colpisce circa 12-15 milioni di persone e 350 milioni sono a rischio di contrarre la malattia³.

Il genere Leishmania presenta due forme evolutive: il promastigote e l'amastigote⁴. I promastigoti di Leishmania sono caratterizzati dalla presenza di flagelli e da un'elevata motilità. Queste forme si trovano nel tratto digestivo del flebotomo, dove subiscono la differenziazione nella forma infettiva (promastigoti metaciclici)⁵. Al contrario, gli amastigoti si trovano nell'ambiente intracellulare delle cellule di mammifero infette. Questa forma evolutiva, a sua volta, si replica nei fagolisosomi delle cellule fagocitiche⁶.

Il ciclo di trasmissione di Leishmania spp. inizia durante l'alimentazione del sangue, quando i flebotomi inoculano i promastigoti metaciclici nella pelle dell'ospite¹. Poco dopo l'inoculazione della Leishmania , le cellule immunitarie innate, compresi i neutrofili e i macrofagi residenti nei tessuti, fagocitano i parassiti. All'interno dei vacuoli parassitofori, la Leishmania si differenzia in amastigoti e si replica, culminando nella rottura della membrana cellulare ospite, che consente l'infezione delle cellule vicine e la diffusione del parassita⁴. Il ciclo si completa quando le flebotomine ingeriscono fagociti contenenti amastigoti, che si differenziano in promastigoti prociclici e successivamente in promastigoti metaciclici nel tratto intestinale dell'insetto⁷.

Le cellule dendritiche, cellule professionali che presentano l'antigene presenti nei tessuti e nei linfonodi, fungono da sentinella per il sistema immunitario⁸. Queste cellule si trovano nei tessuti periferici in stadi immaturi, principalmente coinvolte nella cattura e nell'elaborazione dell'antigene. Dopo il contatto con i patogeni, le DC subiscono un processo di maturazione che culmina nella loro migrazione verso i linfonodi, presentando successivamente gli antigeni alle cellule T CD4⁺ naive. Queste cellule sono anche essenziali nell'orchestrare le risposte immunitarie innate e adattative che generano tolleranza o infiammazione⁹. Il processo di maturazione delle DC coinvolge diversi aspetti, tra cui l'aumento dell'espressione di MHC e delle molecole costimolatorie, come CD40 e CD86, nonché l'aumento della secrezione di citochine. Le DC esprimono diversi marcatori, tra cui CD11b e CD11c, e, nell'uomo, le DC che originano dai monociti CD14⁺ (moDC) esprimono CD1a¹⁰. CCR7 è altamente espresso sulle DC e indica il complesso processo migratorio di queste cellule¹². CD209 e CD80 svolgono anche un ruolo importante nel contatto iniziale con DC e linfociti¹³.

Nella leishmaniosi, gli studi suggeriscono che le moDC fagocitano i parassiti e li consegnano ai linfonodi drenanti (dLN), dove presentano antigeni alle cellule T¹³. Il meccanismo di cattura del parassita è associato alla riorganizzazione del citoscheletro da parte dei filamenti di actina durante la fagocitosi, che promuove l'internalizzazione del parassita¹⁴. La maggior parte degli studi riguardanti i ruoli esercitati dalle DC nella leishmaniosi si sono concentrati su L. major, L. amazonensis e L. braziliensis¹⁵. È interessante notare che studi in vivo sull'infezione da Leishmania hanno dimostrato che la compromissione della funzione DC si verifica in modo specifico per il ceppo parassita.

È stato dimostrato che durante le prime fasi dell'infezione da L. amazonensis , le DC mostrano una ridotta capacità di limitare l'infezione da parassiti. Al contrario, in un modello sperimentale di infezione da L. braziliensis , è stato dimostrato che le DC montano risposte immunitarie appropriate che limitano la sopravvivenza alla Leishmania¹⁶. Gli aspetti principali noti per essere associati alle risposte differenziali all'infezione da Leishmania spp. sono il grado di maturazione e attivazione delle DC. Questo articolo descrive un metodo per studiare il ruolo che le DC umane svolgono nell'infezione da Leishmania per comprendere ulteriormente come queste cellule influenzano gli esiti della malattia.

Protocollo

NOTA: Le cellule sono state ottenute da donatori volontari sani. La procedura qui descritta è stata approvata dal Comitato Etico Nazionale (numero 2.751.345)-Fiocruz, Bahia, Brasile).

1. Differenziamento di cellule dendritiche umane

1. Pipettare 10 mL di miscela di polisaccarosio-triazoato di sodio in provette coniche da 50 mL.
2. Etichettare le provette coniche da 50 mL rispettivamente per ciascun donatore.
3. Raccogliere 30 mL di sangue da donatori sani ed eseguire tutti i passaggi successivi nella cappa a flusso laminare.
4. Trasferire con cautela il sangue nelle provette coniche e diluire il sangue in soluzione salina (cloruro di sodio allo 0,9%) in un rapporto di 1:1 a temperatura ambiente.
5. Sovrapporre il sangue diluito lentamente alla miscela di triazoato di polisaccarosio e sodio nelle provette (passaggio 1.1). Centrifugare le provette una volta a 400 × g per 30 minuti a 25 °C.
   NOTA: Chiudere il freno prima della centrifugazione per evitare la miscelazione degli strati di gradiente. Dopo la prima centrifugazione, diminuire la temperatura a 4 °C nella centrifuga.
6. Estrarre con cautela le provette dalla centrifuga.
7. Cercare l'anello formato dalle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) nel campione (buffy coat); Aspirare accuratamente il plasma residuo con una pipetta.
   NOTA: La centrifugazione porta alla formazione dei seguenti strati di gradiente: eritrociti, mezzo di gradiente di densità, anello PBMC e plasma. L'anello PBMC si trova tra il mezzo del gradiente di densità e gli strati di plasma.
8. Trasferire lo strato torbido di PBMC in un'altra provetta e aggiungere soluzione fisiologica fino a un volume finale di 30 ml.
9. Centrifugare le provette contenenti le sospensioni cellulari a 250 × g per 10 minuti a 4 °C. Eliminare il surnatante e aggiungere 1 mL di soluzione fisiologica per risospendere il pellet.
10. Raccogliere un'aliquota per il conteggio delle cellule e diluirla 1:1.000. Utilizzare 10 μl di cellule diluite per contare le cellule con il metodo di esclusione del blu di tripano utilizzando una camera Neubauer per determinare la vitalità cellulare.
11. Far girare nuovamente la sospensione a 200 × g per 10 min sotto i 4 °C.
12. Risospendere il pellet in un tampone di smistamento cellulare attivato magneticamente (MACS). Utilizzare 80 μl di tampone per 1 × 10⁷ celle.
    NOTA: Vedere la Tabella 1 per la composizione del buffer MACS. Mantenere il tampone freddo e conservarlo a 2-8 °C.
13. Aggiungere microsfere CD14 alla sospensione cellulare preparata al punto 1.9. Utilizzare 20 μl di microsfere CD14 per 1 × 10⁷ cellule.
    NOTA: Le microsfere CD14 vengono utilizzate per selezionare positivamente i monociti umani dalle PBMC, poiché le microsfere contenenti anti-CD14 umano si legano alle cellule CD14⁺ espresse sulla superficie della maggior parte dei monociti.
14. Pipettare su e giù per risospendere uniformemente i pellet e le microsfere. Conservare in ghiaccio per 15 minuti.
15. Centrifugare la sospensione a 300 × g per 10 minuti a 4 °C.
16. Risospendere le celle nel buffer MACS. Utilizzare 1-2 ml per 1 × 10⁷ cellule nella miscela di microsfere cellulari.
17. Centrifugare la sospensione a 300 × g per 10 minuti a 4 °C.
18. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 500 μL di tampone MACS.
    NOTA: Questo è il volume massimo della sospensione cellulare da elaborare in una colonna.
19. Assemblare la colonna magnetica.
20. Lavare la colonna una volta con 500 μL di tampone MACS e lasciare che il tampone fluisca per gravità attraverso la colonna.
    NOTA: Fare attenzione a non lasciare che la colonna si asciughi, poiché l'aria può ostruire la colonna.
21. Aggiungere 500 μl della sospensione cellula-perlina (passaggio 1.19) per colonna. Lasciare che la sospensione della cella fluisca per gravità attraverso la colonna.
22. Lavare la colonna con 500 μL di tampone MACS (2x). Aggiungere un nuovo buffer solo quando il serbatoio della colonna è vuoto. Non lasciare asciugare la colonna.
23. Posizionare una nuova provetta sotto la colonna, pipettare 1 mL di tampone MACS sulla colonna ed espellere immediatamente le cellule marcate magneticamente dalla colonna spingendo con decisione lo stantuffo.
24. Centrifugare le cellule arricchite di CD14 a 300 × g per 10 minuti a 4 °C.
25. Contare le celle utilizzando una camera Neubauer.
26. Risospendere le cellule in 1 mL di RPMI completo con 100 μL/mL di interleuchina-4 (IL-4) ( (50 ng/mL) + fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF) (50 ng/mL).
27. Seminare le cellule su una piastra a 24 pozzetti a una concentrazione di 2 × 10⁵ cellule per pozzetto in 500 μL di terreno RPMI completo contenente le citochine di cui sopra e incubare per 7 giorni a 37 °C.

2. Cultura della Leishmania

NOTA: In questo test sono stati utilizzati parassiti L. amazonensis (MHOM/BR88/Ba-125).

1. Mantenere i promastigoti su terreno di agar ematico Novy-Nicolle-MacNeal (NNN) con 5 mL di terreno completo di Schneider o di terreno minimo essenziale (MEM) in un flacone di coltura da 25 cm² in un incubatore a domanda di bioossigeno (BOD) a 24 °C.
   NOTA: Per coltivare la forma promastigote della specie L. amazonensis , sono stati utilizzati 5 ml di terreno completo di Schneider (Schneider's Insect Medium contenente il 10% di siero fetale bovino inattivato (FBS) e gentamicina a una concentrazione di 50 μg/mL).
2. Incubare per 7 giorni a 24 °C nell'incubatore BOD.
3. Pipettare 100 μl di coltura di promastigote in un nuovo matraccio per colture cellulari da 25 cm² .
4. Aggiungere 5 ml del MEM integrato.
5. Incubare a 24 °C nell'incubatore BOD e contare periodicamente i promastigoti trasferendo un'aliquota di sospensione di cellule parassitarie diluite in soluzione salina in una camera di Neubauer (cioè emocitometro) fino al raggiungimento della fase stazionaria.
   NOTA: Non utilizzare il primo passaggio post-NNN Medium per esperimenti.
6. Trasferire 1 × 10⁵ di promastigoti stazionari in fase di crescita di Leishmania in un nuovo pallone di coltura cellulare da 25 cm² e aggiungere 5 ml di MEM integrato.
7. Monitorare periodicamente la crescita delle colture utilizzando una camera Neubauer fino al raggiungimento della fase stazionaria.
   NOTA: Utilizzare colture di promastigote per un massimo di 7 passaggi in vitro per evitare la perdita di virulenza.

3. Infezione da leishmania

1. Dopo aver verificato la crescita in fase stazionaria dei parassiti coltivati, rimuovere tutto il contenuto dai flaconi di coltura e metterli in provette coniche da 50 mL. Aggiungere una soluzione salina fredda per ottenere un volume finale di 30 mL.
2. Centrifugare per 10 minuti a 4 °C a 1.600 × g tre volte. Scartare il surnatante dopo la centrifugazione e risospendere il pellet in una soluzione salina fredda.
3. Lavare le celle per rimuovere eventuali parassiti non vitali e risospendere il pellet in 1 mL di soluzione salina fredda. Passare la sospensione 5 volte lentamente attraverso una siringa da 1 mL dotata di un ago da 16 G per separare i gruppi di parassiti.
4. Rimuovere un'aliquota dal campione per contare la concentrazione di parassiti in un emocitometro utilizzando l'Eq (1).
   Concentrazione di parassiti = media dei parassiti in 4 quadranti × fattore di diluizione × 10⁴ (1)
5. Calcola la quantità di Leishmania sp. Necessario per il numero di cellule ospiti da placcare per mantenere un rapporto parassita/cellula ospite di 10:1 (passaggio 1.27).
6. Lavare le DC aggiungendo 1 mL di soluzione salina e centrifugando le cellule tre volte a 300 × g per 10 minuti a temperatura ambiente.
7. Collocare il volume richiesto di Leishmania in ciascun pozzetto della piastra di coltura cellulare a 24 pozzetti (vedere il passaggio 3.5).
8. Incubare le DC con parassiti per 4 ore in un incubatore a 37 °C in un'atmosfera di CO₂ al 5%.

4. Immunocolorazione per analisi di citometria a flusso

1. Dopo l'infezione, lavare le cellule due volte con 1 ml di soluzione salina per rimuovere eventuali parassiti non internalizzati.
   NOTA: Il pannello con cloni di anticorpi e fluorocromi è elencato nella Tabella dei Materiali.
2. Diluire gli anticorpi (1:50) in tampone di selezione cellulare attivata da fluorescenza (FACS) (1x PBS con 1% BSA) a un volume finale di 50 μl per condizione sperimentale.
   NOTA: È importante titolare gli anticorpi prima della sperimentazione per garantire concentrazioni ottimali di colorazione. In questo protocollo, è stato utilizzato 1:50 dopo gli esperimenti di titolazione.
3. Preparare una master mix (1x PBS con 1% BSA + miscela di anticorpi). Vortice e pipettare 50 μl della miscela in pozzetti contenenti cellule.
4. Incubare brevemente le DC con la miscela di anticorpi (anti-umano CD1a, anti-umano CCR7, anti-umano CD83, anti-CD11c, anti-anti-umano CD209, anti-HLA-DR umano) su ghiaccio per 30 minuti, al riparo dalla luce.
5. Lavare le celle due volte con 1 mL di tampone di colorazione a freddo (1% FBS in 1x PBS) e centrifugare a 300 × g per 5 minuti a 4 °C.
6. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 200 μl di tampone di colorazione a freddo.
7. Procedere con l'acquisizione dei dati su citometro a flusso.
   NOTA: Per garantire le condizioni ottimali per l'analisi FACS, l'acquisizione dei dati deve essere eseguita entro 48 ore dalla colorazione del campione. I dati sono stati analizzati utilizzando il software FlowJo.
   1. Apri il programma software FlowJo e crea una nuova area di lavoro. Aggiungere i file di citometria a flusso da analizzare trascinandoli nella finestra dell'area di lavoro.
   2. Fare clic sul nome del tubo per selezionare i parametri di dispersione laterale (SSC) e di dispersione diretta (FSC).
      NOTA: L'analisi citofluorimetrica della maturazione delle DC si è basata sull'espressione di CD1a, CD11c, CD80, CCR7, CD209 e HLA-DR.
   3. Utilizzando lo strumento di controllo poligonale , disegna un cancello attorno ai DC. Fai doppio clic sulle celle di controllo selezionate per visualizzare una nuova finestra. Eseguire la pulizia del doppietto selezionando i parametri FSC-A e FSC-H. Utilizzando lo strumento poligono , disegna un nuovo grafico attorno alle singole celle.
   4. Fare doppio clic sulle celle gate e selezionare i parametri SSC e CD11c per generare un gate contenente le celle CD11c⁺ .
   5. Esporta il gate della cella CD11c⁺ pulito selezionandolo. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul cancello e selezionare l'opzione Seleziona nodi equivalenti . Fare clic con il pulsante destro del mouse ed esportare il cancello insieme a tutti i parametri compensati salvandolo in una cartella creata di recente.
   6. Creare una nuova area di lavoro aprendo i file salvati di recente. Fai clic su Workspace e seleziona i plug-in | Downsampling | da 30.000 a 50.000 eventi; premere OK.
      NOTA: poiché TSNE è un processo che richiede tempo e computazionalmente, si consiglia di eseguire questo passaggio per ridurre il numero totale di eventi analizzati.
   7. Fare clic con il pulsante destro del mouse su un file sottocampionato e selezionare i nodi equivalenti.
   8. Fare clic con il pulsante destro del mouse su un file sottocampionato e selezionare Esporta/concatena.
   9. Fare clic sulla finestra di concatenazione e selezionare tutti i parametri compensati. Seleziona i file concatenati e fai clic su workspace | plugin | tSNE.
   10. Selezionare i parametri desiderati (CD1a, HLA-DR, CCR7, CD80, CD209 e CD11c) per creare i cluster. Premere OK.
   11. Fare clic sul file concatenato per visualizzare i parametri tSNE1 e tSNE2.

5. Immunocolorazione dell'actina

1. DC infetti da piastra su vetrini coprioggetti posti in piastre a 24 pozzetti. Centrifugare le piastre a 300 × g a 4 °C per 10 min. Lavare le cellule 3 volte con soluzione fisiologica sterile dopo l'infezione a temperatura ambiente per rimuovere eventuali parassiti extracellulari.
2. Incubare le DC con 500 μL di paraformaldeide al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere la paraformaldeide e aggiungere 1 mL di soluzione fisiologica (vedere Tabella 1).

6. Immunomarcatura

NOTA: Eseguire i seguenti passaggi in agitazione.

1. Lavare i vetrini coprioggetti con 1x PBS per 5 minuti; Ripeti 3 volte. Aggiungere 500 μl di soluzione di cloruro di ammonio per pozzetto; Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
2. Lavare i vetrini coprioggetti con 1x PBS per 5 minuti; Ripeti 3 volte.
3. Permeabilizzare la membrana con lo 0,15% di saponina per 15 min.
4. Bloccare per 1 ora con 1x PBS 1x/3% BSA/0,15% saponina. Lavare i vetrini coprioggetti con 1x PBS/0,15% saponina per 5 minuti; Ripeti 3 volte.
5. Incubare le cellule per 1 ora con falloidina (1:1.200] diluita in 1x PBS/1% BSA/0,15% saponina. Lavare i vetrini coprioggetti con 1x PBS/0,15% saponina per 5 minuti; Ripeti 3 volte.
6. Posizionare i vetrini coprioggetti con le cellule rivolte verso il basso sul terreno di montaggio con 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI). Copri le diapositive con un foglio di alluminio per proteggerle dalla luce.
7. Acquisizione di immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza confocale con obiettivo 63x/1,4.

7. Acquisizione al microscopio confocale e quantificazione delle Figi

1. Acquisisci immagini in immunofluorescenza utilizzando un microscopio a scansione laser confocale (vedi la Tabella dei materiali).
   NOTA: Per una risoluzione ottimale, utilizzare una lente a immersione in olio per obiettivo 63x.
2. Proteggere i vetrini coprioggetti dalla luce e lasciarli a temperatura ambiente per almeno 30 minuti prima dell'acquisizione.
3. Utilizzare un panno assorbente per pulire i vetrini. Aggiungere una goccia di olio da immersione all'obiettivo e posizionare il vetrino sul tavolino del microscopio. Selezionare l'obiettivo 63x con olio, sollevare la piattaforma fino a quando l'olio tocca il vetrino e regolare la messa a fuoco sul microscopio.
4. Aprire il programma e attivare le lunghezze d'onda del laser di 488, 552 e 405 nm.
5. Impostare la risoluzione dell'immagine su 1024 x 1024 pixel.
6. Fare clic su live bottom, impostare la pila Z e premere Inizia. Ripetere questo processo e quindi premere il pulsante Fine .
7. Attendere il completamento dell'acquisizione dell'immagine, quindi selezionare l'opzione Proiezione massima negli strumenti.
8. Salvare l'esperimento ed esportare le immagini in formato .lif in un computer.
9. Aprire il programma FIJI, aprire l'esperimento in FIJI e impostare lo stack di visualizzazioni su Hyperstack.
10. Seleziona i file immagine aperti singolarmente | cuci le tessere.
11. Seleziona lo strumento mano libera nella barra degli strumenti delle Figi e traccia attentamente ogni cella a mano. Premi analizza | misura per visualizzare l'intensità della fluorescenza. Ripeti questo processo per ogni tipo di cella per gruppo.
12. Salva le misure ed esportale in un foglio di calcolo. Aprire il file contenente i dati utilizzando un software di analisi statistica (vedere la Tabella dei materiali) per eseguire l'analisi statistica.

8. Analisi statistica

1. Apri un nuovo progetto nel software.
2. Per i dati con distribuzione normale, utilizzare il t-test di Student; per i dati non parametrici, utilizzare il test U di Mann-Whitney.
3. Incolla i valori ottenuti dai risultati sperimentali nella tabella.
4. Seleziona le statistiche descrittive e scegli l'opzione statistiche della colonna [tutti i test] per analizzare la distribuzione dei dati.
   NOTA: Se i dati seguono la distribuzione gaussiana, scegliere il test t per esaminare i campioni confrontando due coppie. Se la distribuzione non è gaussiana, analizzare i dati utilizzando il test U di Mann-Whitney con misure di tendenza centrale (medie o mediane) e misure di variazione.
5. Scegli l'opzione grafica migliore per una rappresentazione ottimale dei dati.

Risultati

Questo rapporto indaga il ruolo delle DC nell'infezione da Leishmania utilizzando la citometria a flusso e la microscopia confocale. Inizialmente, è stato stabilito il profilo fenotipico della DC umana derivata dai monociti. In particolare, le popolazioni di cellule dendritiche CD11c⁺ ottenute erano positive per CCR7, CD209, CD80, CD1a e HLA-DR. I risultati indicano che l'espressione di questi marcatori nelle popolazioni di DC è profondamente influenzata dall'infezione da Leishmania. Le DC in...

Discussione

La leishmaniosi è un grave problema di salute pubblica in tutto il mondo. La patogenesi di questa malattia è piuttosto complessa e i meccanismi che favoriscono la sopravvivenza del parassita negli ospiti vertebrati rimangono sfuggenti¹⁷. Le DC sono cellule professionali che presentano l'antigene che si trovano in tutto il corpo, compresi gli organi filtranti e linfoidi. Dopo la cattura e l'elaborazione dell'antigene, le DC immature subiscono un complesso processo ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
anti CCR7	Thermo
anti CD209	Isofarma
anti CD83	Leica SP8
anti HLA-DR	Gibco
Albumina sierica bovina	Thermo	A2153-100G	Sigma
Ciprofloxacina	Gibco
microscopio confocale	Thermo Fisher Scientific
Siero fetale bovino	Gibco
Flow Jo	Thermo Fisher Scientific
Gentamicina	Thermo Fisher Scientific
Glutamin	Gibco
HEPES	Thermo Fisher Scientific
falloidina	Thermo Fisher Scientific
Soluzione tampone fosfato	Peprotech
prolong gold antifade kit	BD pharmigen
RPMI	BD pharmigen
Saponina	BD pharmigen	47036 - 50G - F	Sigma
Schneider's insect medium	software BD biosciences