Method Article

Coltivazione microbica automatizzata ed evoluzione adattiva utilizzando il sistema di coltura microbica di microgoccioline (MMC)

DOI:

10.3791/62800

⸱

February 18th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Institute of Biochemical Engineering, Tsinghua University, 2Key Laboratory of Industrial Biocatalysis, Ministry of Education, Tsinghua University, 3Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd., 4Biochemical Engineering Research Group, School of Chemical Engineering and Technology, Xi’an Jiaotong University, 5Center for Synthetic & Systems Biology, Tsinghua University, 6School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive come utilizzare il sistema di coltura microbica di microgoccioline (MMC) per condurre la coltivazione microbica automatizzata e l'evoluzione adattativa. MMC può coltivare e sub-coltivare microrganismi automaticamente e continuamente e monitorare online la loro crescita con una produttività relativamente elevata e una buona parallelizzazione, riducendo il consumo di manodopera e reagenti.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I metodi di coltivazione microbica convenzionali di solito hanno operazioni ingombranti, bassa produttività, bassa efficienza e grande consumo di manodopera e reagenti. Inoltre, i metodi di coltivazione ad alto rendimento basati su micropiastre sviluppati negli ultimi anni hanno uno scarso stato di crescita microbica e sperimentano la parallelizzazione a causa del loro basso livello di ossigeno disciolto, della scarsa miscela e della grave evaporazione e dell'effetto termico. A causa dei numerosi vantaggi delle micro-goccioline, come il piccolo volume, l'elevata produttività e la forte controllabilità, la tecnologia microfluidica a base di goccioline può superare questi problemi, che è stata utilizzata in molti tipi di ricerca di coltivazione, screening ed evoluzione microbica ad alto rendimento. Tuttavia, la maggior parte degli studi precedenti rimane nella fase di costruzione e applicazione del laboratorio. Alcune questioni chiave, come gli elevati requisiti operativi, l'elevata difficoltà di costruzione e la mancanza di tecnologia di integrazione automatizzata, limitano l'ampia applicazione della tecnologia microfluidica a goccioline nella ricerca microbica. Qui, un sistema automatizzato di coltura microbica a microgoccioline (MMC) è stato sviluppato con successo basato sulla tecnologia microfluidica delle goccioline, ottenendo l'integrazione di funzioni come l'inoculazione, la coltivazione, il monitoraggio online, la sottocoltivazione, lo smistamento e il campionamento richiesti dal processo di coltivazione microbica delle goccioline. In questo protocollo, l'Escherichia coli (E. coli) MG1655 wild-type e un ceppo di E. coli essenziale per il metanolo (MeSV2.2) sono stati presi come esempi per introdurre come utilizzare l'MMC per condurre in dettaglio la coltivazione microbica automatizzata e relativamente ad alto rendimento e l'evoluzione adattativa. Questo metodo è facile da usare, consuma meno manodopera e reagenti e ha un'elevata produttività sperimentale e una buona parallelità dei dati, che presenta grandi vantaggi rispetto ai metodi di coltivazione convenzionali. Fornisce una piattaforma sperimentale a basso costo, favorevole alle operazioni e affidabile in termini di risultati per i ricercatori scientifici per condurre ricerche microbiche correlate.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La coltivazione microbica è una base importante per la ricerca scientifica microbiologica e le applicazioni industriali, che è ampiamente utilizzata nell'isolamento, identificazione, ricostruzione, screening ed evoluzione dei microrganismi 1,2,3. I metodi di coltivazione microbica convenzionali utilizzano principalmente provette, fiaschi di scuotimento e piastre solide come contenitori di coltivazione, combinati con incubatori vibranti, spettrofotometri, lettori di micropiastre e altre attrezzature per la coltivazione, il rilevamento e lo screening microbico. Tuttavia, questi metodi hanno molti problemi, come operazioni ingombranti, bassa produttività, bassa efficienza e grande consumo di manodopera e reagenti. I metodi di coltivazione ad alto rendimento sviluppati negli ultimi anni si basano principalmente sulla micropiastra. Ma la micropiastra ha un basso livello di ossigeno disciolto, scarsa proprietà di miscelazione e grave evaporazione ed effetto termico, che spesso portano a uno scarso stato di crescita e alla parallelizzazione sperimentale di microrganismi 4,5,6,7; d'altra parte, deve essere dotato di attrezzature costose, come stazioni di lavoro per la gestione dei liquidi e lettori di micropiastre, per ottenere la coltivazione automatizzata e il rilevamento dei processi 8,9.

Come importante branca della tecnologia microfluidica, la microfluidica a goccioline è stata sviluppata negli ultimi anni sulla base di sistemi microfluidici tradizionali a flusso continuo. Si tratta di una tecnologia microfluidica a flusso discreto che utilizza due fasi liquide immiscibili (solitamente olio-acqua) per generare micro-goccioline disperse e operare su di esse10. Poiché le micro-goccioline hanno le caratteristiche di un piccolo volume, un'ampia superficie specifica, un'elevata velocità di trasferimento di massa interna e nessuna contaminazione incrociata causata dalla compartimentazione, e i vantaggi di una forte controllabilità e di un'elevata produttività delle goccioline, ci sono stati molti tipi di ricerca che applicano la tecnologia microfluidica delle goccioline nella coltivazione, nello screening e nell'evoluzione dei microrganismi ad alto rendimento11 . Tuttavia, ci sono ancora una serie di questioni chiave per rendere la tecnologia microfluidica a goccioline popolare e ampiamente applicata. In primo luogo, il funzionamento della microfluidica delle goccioline è ingombrante e complesso, con conseguenti elevati requisiti tecnici per gli operatori. In secondo luogo, la tecnologia microfluidica a goccioline combina componenti ottici, meccanici ed elettrici e deve essere associata a scenari applicativi biotecnologici. È difficile per un singolo laboratorio o team costruire sistemi di controllo microfluidici a goccia efficienti se non esiste una collaborazione multidisciplinare. In terzo luogo, a causa del piccolo volume di micro-goccioline (dal picoliter (pL) al microlitro (μL)), ci vuole molta difficoltà per realizzare il controllo automatizzato preciso e il rilevamento online in tempo reale delle goccioline per alcune operazioni microbiche di base come la sottocoltura, la cernita e il campionamento, ed è anche difficile costruire un sistema di apparecchiature integrato12.

Al fine di affrontare i problemi di cui sopra, è stato sviluppato con successo un sistema automatico di coltura microbica di microgoccioline (MMC) basato sulla tecnologia microfluidica delle goccioline13. L'MMC è costituito da quattro moduli funzionali: un modulo di riconoscimento delle goccioline, un modulo di rilevamento dello spettro delle goccioline, un modulo chip microfluidico e un modulo di campionamento. Attraverso l'integrazione e il controllo del sistema di tutti i moduli, viene stabilito con precisione il sistema operativo automatizzato che include la generazione, la coltivazione, la misurazione (densità ottica (OD) e fluorescenza), la scissione, la fusione, lo smistamento delle goccioline, ottenendo l'integrazione di funzioni come l'inoculazione, la coltivazione, il monitoraggio, la sottocoltura, lo smistamento e il campionamento richiesti dal processo di coltivazione microbica delle goccioline. MMC può contenere fino a 200 unità di coltivazione di goccioline replicate di 2-3 μL di volume, che equivale a 200 unità di coltivazione del pallone shake. Il sistema di coltivazione a micro-goccioline può soddisfare i requisiti di non contaminazione, ossigeno disciolto, miscelazione e scambio massa-energia durante la crescita di microrganismi e soddisfare le varie esigenze della ricerca microbica attraverso molteplici funzioni integrate, ad esempio la misurazione della curva di crescita, l'evoluzione adattativa, l'analisi multilivello a fattore singolo e la ricerca e l'analisi dei metaboliti (basata sul rilevamento della fluorescenza)13,14.

Qui, il protocollo introduce in dettaglio come utilizzare l'MMC per condurre la coltivazione automatizzata e microbica e l'evoluzione adattiva (Figura 1). Abbiamo preso eseguito come esempio Escherichia coli (E. coli) MG1655 per dimostrare la misurazione della curva di crescita e un ceppo di E. coli meSV2.215 essenziale per il metanolo per dimostrare l'evoluzione adattativa in MMC. È stato sviluppato un software operativo per MMC, che rende l'operazione molto semplice e chiara. Nell'intero processo, l'utente deve preparare la soluzione batterica iniziale, impostare le condizioni dell'MMC e quindi iniettare la soluzione batterica e i relativi reagenti nell'MMC. Successivamente, l'MMC eseguirà automaticamente operazioni come la generazione di goccioline, il riconoscimento e la numerazione, la coltivazione e l'evoluzione adattiva. Eseguirà inoltre il rilevamento online (OD e fluorescenza) delle goccioline con alta risoluzione temporale e visualizzerà i relativi dati (che possono essere esportati) nel software. L'operatore può interrompere il processo di coltivazione in qualsiasi momento in base ai risultati ed estrarre le goccioline target per gli esperimenti successivi. L'MMC è facile da usare, consuma meno manodopera e reagenti e ha un throughput sperimentale relativamente elevato e una buona parallelità dei dati, che presenta vantaggi significativi rispetto ai metodi di coltivazione convenzionali. Fornisce una piattaforma sperimentale a basso costo, favorevole alle operazioni e robusta per i ricercatori per condurre ricerche microbiche correlate.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Installazione di strumenti e software

  1. Scegli un ambiente pulito e sterile (come un banco pulito) come spazio permanente dedicato per MMC. Installare MMC in modo costante nello spazio.
    NOTA: tenere l'MMC lontano dall'interferenza di forti campi elettrici, campi magnetici e forti sorgenti di radiazioni termiche. Evitare che forti vibrazioni influenzino i componenti di rilevamento ottico. Fornire l'alimentazione di AC220 V, 50 HZ all'MMC. Per informazioni dettagliate su MMC, fare riferimento alla Tabella dei materiali e al sito Web di MMC16.
  2. Installare il software operativo dal file MMC.zip
    NOTA: contattare gli autori per il file MMC.zip.
    1. Crea una cartella dedicata e salva il file zip al suo interno.
    2. Creare un'altra cartella dedicata come "Directory di installazione". Decomprimere mmc.zip e salvare i file nella nuova cartella.
      NOTA: la configurazione del computer è la migliore per soddisfare: (1) Sistema operativo Windows 7 a 64 bit o superiore; (2) CPU: i5 o superiore; (3) memoria: 4 GB o superiore; (4) disco rigido: 300 GB o superiore (velocità di rotazione superiore a 7200 rpm o disco a stato solido).

2. Preparativi

  1. Collegare l'ago della siringa (diametro interno è 0,41 mm e il diametro esterno è 0,71 mm), il connettore rapido A e il flacone del reagente (Figura 2C) e autoclave a 121 °C per 15 minuti.
    NOTA: svitare leggermente il tappo del flacone del reagente durante la sterilizzazione. Alcuni altri flaconi di reagente possono essere preparati ogni volta per l'uso.
  2. Utilizzare un filtro al fluoruro di polivinilidene (PVDF) da 0,22 μm per filtrare l'olio MMC. Mettere il chip microfluidico (Figura 2B) e l'olio MMC nel banco pulito in anticipo e sterilizzarli mediante irradiazione ultravioletta per 30 minuti prima dell'uso.
    NOTA: Per i dettagli del connettore rapido A, del flacone del reagente, dell'olio MMC e del chip microfluidico fare riferimento alla Tabella dei materiali.
  3. Installare il chip microfluidico
    1. Aprire la porta della camera operativa (Figura 2A) e sollevare la sonda in fibra ottica.
    2. Allineare i fori del campo elettrico con gli aghi del campo elettrico e posizionare delicatamente il chip sul piedistallo del chip. Quindi inserire le due colonne di posizionamento nei fori di posizionamento e posizionare la sonda in fibra ottica (Figura 2D).
    3. Collegare il connettore rapido A sul chip alla porta corrispondente della MMC in base al numero di posizione (C5-O5, C4-O4, C6-O6, C2-O2, CF-OF, C1-O1, C3-O3). Quindi chiudere la porta della camera operativa.
  4. Ricostituire l'olio MMC (fino a circa 80 ml) nella bottiglia dell'olio e svuotare il liquido di scarto nella bottiglia di scarico prima dell'uso.
    NOTA: Il liquido di scarto è solitamente un rifiuto organico. Si prega di fare riferimento alla legge e ai regolamenti regionali al momento dello smaltimento, soggetti a modifiche in base all'impostazione sperimentale.

3. Misurazione della curva di crescita in MMC

  1. Preparazione per la soluzione batterica iniziale
    1. Seguire le relative normative standard per preparare il mezzo Luria-Bertani (LB) e l'autoclave a 121°C per 15 min.
      NOTA: Componenti del mezzo LB: NaCl (10 g / L), estratto di lievito (5 g / L) e triptone (10 g / L).
    2. Estrarre il ceppo E. coli MG1655 dal brodo di glicerolo e coltivarlo in un matraccio da 50 ml con 10 mL di LB medium in un incubatore vibrante (200 giri/ min) a 37 °C per 5-8 ore.
      NOTA: Il tempo di coltivazione dipende dai ceppi specifici. È ottimale coltivare il ceppo fino al periodo/fase logaritmica.
    3. Diluire la soluzione di E. coli MG1655 in coltura con mezzo fresco a un OD600 di 0,05-0,1 per ottenere una soluzione batterica iniziale (preparare circa 10 ml).
  2. Fare clic su Inizializzazione per inizializzare MMC. Dopo aver visualizzato l'interfaccia di inizializzazione, impostare la temperatura di coltivazione su 37 °C e il valore del segnale fotoelettrico su 0,6 (Figura 3A). L'inizializzazione richiederà circa 20 minuti.
  3. Accendere la lampada UV (lunghezza d'onda 254 nm) durante l'inizializzazione.
  4. Iniettare la soluzione batterica iniziale e l'olio MMC nel flacone del reagente.
    1. Estrarre un flacone di reagente sterilizzato sul banco pulito e stringere il tappo.
    2. Utilizzare una siringa sterile da 10 mL per iniettare 3-5 mL di olio MMC dall'ago della siringa del tubo laterale. Inclinare e ruotare lentamente il flacone del reagente per far sì che l'olio si infiltri completamente nella parete interna.
    3. Iniettare circa 5 ml di soluzione batterica iniziale, quindi riempire il flacone del reagente iniettando nuovamente 5-7 ml di olio.
    4. Estrarre il connettore rapido indipendente A e inserire il connettore rapido A del flacone del reagente nel connettore rapido B per completare l'operazione di iniezione del campione (Figura 4A).
  5. Attendere la fine dell'inizializzazione e quindi spegnere la lampada UV (lunghezza d'onda 254 nm).
  6. Aprire la porta della camera operativa e mettere il flacone del reagente nel bagno metallico.
  7. Estrarre il connettore C2 del chip e il connettore rapido A del flacone del reagente. Collegare il connettore del tubo laterale del flacone del reagente al connettore C2 e il connettore del tubo superiore al connettore O2. Quindi chiudere la porta della camera operativa.
  8. Fare clic su Curva di crescita per scegliere la funzione di misurazione della curva di crescita (Figura 3A). Nell'interfaccia di impostazione dei parametri, immettere il numero come 15, attivare l'interruttore di rilevamento OD e impostare la lunghezza d'onda su 600 nm. Fare clic su Start per avviare la generazione di droplet. Ci vorranno circa 10 minuti.
    NOTA: Qui, Numero si riferisce al numero di goccioline da generare. La lunghezza d'onda si riferisce alla lunghezza d'onda dell'OD da rilevare. Impostare il numero (massimo 200) e la lunghezza d'onda (350-800 nm) in base ai requisiti dell'esperimento.
  9. Quando viene visualizzata una finestra pop-up sull'interfaccia principale che richiede "Rimuovere il flacone del reagente tra C2 e O2, quindi fare clic sul pulsante OK dopo il completamento", aprire la porta della camera operativa per estrarre il flacone del reagente e collegare i connettori C2 e O2.
  10. Chiudi la porta e fai clic sul pulsante OK nella finestra pop-up per coltivare automaticamente le goccioline e rilevare i valori OD.
    NOTA: MMC rileva il valore OD quando la goccia passa la sonda in fibra ottica. Pertanto, il periodo di rilevamento dipende dal numero di goccioline generate.
  11. Quando la curva di crescita raggiunge la fase stazionaria, fare clic sul pulsante Esportazione dati per esportare i dati OD. Selezionare il percorso di salvataggio dei dati ed esportare il valore OD registrato durante il periodo di coltivazione nel formato .csv, che può essere aperto da un software appropriato (ad esempio, Microsoft Excel). Quindi utilizzare un software di mappatura (ad esempio, EXCEL e Origin 9.0) per tracciare la curva di crescita.
    NOTA: Durante il processo di coltivazione, è possibile fare clic su Esportazione dati in qualsiasi momento per esportare i dati OD di tutte le goccioline correnti.

4. Evoluzione adattiva in MMC

  1. Preparazione per la soluzione batterica iniziale
    1. Seguire le relative normative standard per preparare le piastre liquide speciali medie e solide per il MeSV2.2 e l'autoclave a 121 °C per 15 min.
      NOTA: Per i componenti del supporto speciale fare riferimento alla Tabella 1 e alla Tabella dei Materiali.
    2. Coltivare il MeSV2.2 utilizzando la piastra solida (diametro = 90 mm) in un incubatore a temperatura costante a 37 °C per 72 ore. Quindi raccogliere una colonia indipendente e coltivarla in un matraccio da 50 mL con 10 mL dello speciale mezzo liquido in un incubatore vibrante (200 giri/ min) a 37 °C per 72 ore.
    3. Diluire la soluzione di MeSV2.2 coltivata con il mezzo a un OD600 di 0,1-0,2 (assicurarsi che il volume totale non sia inferiore a 10 ml) e continuare a coltivarla nel matraccio per 5 ore per ottenere la soluzione batterica iniziale.
      NOTA: Il MeSV2.2 è un ceppo di E. coli essenziale per il metanolo. Lo speciale mezzo liquido contiene 500 mmol / L di metanolo, che è un forte stress per MeSV2.2, con conseguente crescita molto lenta. Si noti che ottenere la soluzione iniziale di batteri qui è diverso da quello descritto nel passaggio 3.1.
  2. Inizializzare MMC come illustrato nei passaggi 3.2, 3.3 e 3.5.
  3. Estrarre due flaconi di reagente sterilizzati, uno dei quali è per la soluzione batterica iniziale e l'altro è per il mezzo fresco. Iniettare la soluzione batterica iniziale (5 mL), il mezzo fresco (12-15 ml) e l'olio MMC nei flaconi del reagente come spiegato al punto 3.4.
    NOTA: poiché l'evoluzione adattiva è un processo a lungo termine che coinvolge più sottocolture, conservare il maggior numero possibile di mezzi freschi in MMC. Il mezzo non può essere reintegrato durante l'esecuzione dell'esperimento.
  4. Installare i due flaconi di reagente in MMC come spiegato nel passaggio 3.6. Installare quello per la soluzione batterica iniziale tra il connettore C2 e O2 e l'altro per il mezzo fresco tra il connettore C4 e O4.
  5. Cliccare su ALE per scegliere la funzione di evoluzione adattiva (Figura 3B). Nell'interfaccia di impostazione dei parametri, attivare l'opzione OD Detection .
  6. Impostare Il numero come 50, Lunghezza d'onda come 600 nm, Concentrazione come 0%, Digita come Tempo, Parametro come 30 ore e Ripetizioni come 99. Fare clic su Start per avviare la generazione di droplet. Ci vorranno circa 25 minuti.
    NOTA: Qui, "Concentrazione" si riferisce alla concentrazione massima di fattori chimici per l'evoluzione adattativa. Per diverse goccioline, è realizzabile in MMC introdurre diverse concentrazioni di fattori chimici per fornire diverse condizioni di crescita. Calcolare le concentrazioni introdotte utilizzando la seguente equazione:
    figure-protocol-1
    Qui "C" si riferisce alla concentrazione di fattori chimici introdotti nelle goccioline; "a" si riferisce alla concentrazione di fattori chimici nei flaconi di reagente tra il connettore C4 e O4; "b" si riferisce alla concentrazione di fattori chimici nei flaconi di reagente tra il connettore C6 e O6; e "i" si riferisce alla concentrazione disponibile. Ci sono otto concentrazioni disponibili in MMC. Poiché il fattore chimico qui ha una singola concentrazione (500 mmol / L metanolo) ed è uno degli ingredienti del mezzo, qui è installato un solo flacone di reagente contenente il fattore chimico e la concentrazione è impostata su 0%. Il tipo si riferisce alla modalità di sub-coltivazione, che è divisa in tre tipi: modalità tempo, modalità valore OD e modalità fluorescenza. Il primo significa coltivare le goccioline per un tempo fisso e poi sub-coltivare, mentre gli ultimi due significa coltivare le goccioline a valore OD predefinito / intensità di fluorescenza e quindi sub-coltivare. Il parametro si riferisce al parametro correlato richiesto quando si sceglie una modalità di sottocoltivazione. Le ripetizioni si riferiscono al numero di sotto-coltivazioni.
  7. Rimuovere il flacone del reagente posto tra il connettore C2 e O2 come spiegato nel passaggio 3.8.
  8. Osservare se i valori massimi di OD delle goccioline durante ogni periodo di sottocoltura sono aumentati in modo significativo. Se l'aumento si verifica e soddisfa i requisiti dell'esperimento, fare clic sul pulsante Esportazione dati per esportare i dati OD come spiegato nel passaggio 3.9.
    NOTA: Qui, il periodo di sotto-coltivazione dipende dal parametro. Ad esempio, quando si imposta Tipo come Tempo e Parametro come 30 h, il periodo di sottocoltivazione è 30 h. Durante ogni periodo di sotto-coltivazione, ci sono i valori massimi di OD delle goccioline. Stimare se l'evoluzione adattativa soddisfa i requisiti dell'esperimento aumentando i valori massimi di OD (L'aumento dipende dall'effettivo processo di coltivazione del ceppo, ad esempio, aumentato di oltre il 20%).
    ATTENZIONE: Prestare attenzione se il mezzo fresco immagazzinato è esaurito. Se l'aumento significativo non si è verificato anche dopo che il mezzo è esaurito, estrarre le goccioline che crescono meglio ed effettuare un nuovo ciclo di evoluzione adattiva.
  9. Estrarre le goccioline di destinazione da MMC.
    1. Fare clic sul pulsante Screening per scegliere la funzione di estrazione delle goccioline (Figura 3C). Scegliere l'opzione Raccogli , fare clic sul numero di droplet di destinazione, quindi fare clic su OK.
      NOTA: lo screening delle goccioline include "Raccogli", "Scarta" e "Estrai soluzione di semi". Per "soluzione di semi estratti" si intende la raccolta delle goccioline rimanenti13 dopo l'operazione di sottocoltura.
    2. Attendi che la finestra pop-up richieda "Estrai il connettore rapido CF e inseriscilo nel tubo EP". Inserire il connettore rapido CF nel tubo microcentrifuga per la raccolta in base al prompt del software, quindi fare clic su OK (Figura 4D).
    3. Dopo 1-2 minuti, l'interfaccia del software aprirà una nuova finestra che chiede: "Inserire nuovamente il connettore e fare clic su OK se terminato". Quindi, inserire nuovamente il connettore rapido CF e fare clic su OK per continuare l'esecuzione di MMC (Figura 4D). Quando il droplet di destinazione successivo raggiunge il sito di riconoscimento delle goccioline, ripetere 4.9.2-4.9.3 per raccoglierlo.
      NOTA: dopo aver raccolto tutte le goccioline di destinazione, MMC continuerà a coltivare le goccioline rimanenti. Se la coltivazione non è necessaria, clicca su Stop per terminare direttamente l'operazione.
    4. Estrarre la goccia utilizzando una pipetta da 2,5 μL, farla cadere sulla piastra di agarosio da 90 mm e distribuirla uniformemente con un'asta di spandimento triangolare in vetro con una lunghezza laterale di 3 cm. Quindi coltivarlo in un incubatore a temperatura costante a 37 °C per 72 ore.
    5. Raccogliere 3-5 colonie indipendenti e coltivarle separatamente nei palloni da 50 mL con 10 mL di terreno fresco in un incubatore vibrante (200 giri/min) a 37 °C per 48-72 h. Seguire le relative normative standard per conservare la soluzione di batteri in coltura nel tubo di glicerolo per esperimenti successivi.

5. Pulizia della MMC

  1. Dopo aver completato l'esperimento, fare clic su Stop per interrompere tutte le operazioni. Quindi fare clic su Pulisci per pulire il chip e i tubi. Ci vorranno circa 15 minuti.

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Results

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Questo protocollo utilizza E. coli MG1655 e un ceppo MeSV2.2 come esempi per dimostrare la coltivazione microbica e l'evoluzione adattativa essenziale del metanolo con una strategia automatizzata e relativamente elevata in MMC. La misurazione della curva di crescita è stata utilizzata principalmente per caratterizzare la coltivazione microbica. L'evoluzione adattativa è stata condotta mediante sottocoltura continua automatizzata e aggiungendo un'alta concentrazione di metanolo come pressione selettiva durante og...

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Discussion

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Questo protocollo presenta come utilizzare il sistema di coltura microbica di microgoccioline (MMC) per eseguire la coltivazione microbica automatizzata e l'evoluzione adattiva a lungo termine. MMC è un sistema di coltivazione microbica miniaturizzato, automatizzato e ad alto rendimento. Rispetto ai metodi e agli strumenti di coltivazione microbici convenzionali ad alta produttività, MMC presenta molti vantaggi come il basso consumo di manodopera e reagenti, il funzionamento semplice, il rilevamento online (OD e fluoresc...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio è stato supportato dal National Key Research and Development Program of China (2018YFA0901500), dal National Key Scientific Instrument and Equipment Project della National Natural Science Foundation of China (21627812) e dal Tsinghua University Initiative Scientific Research Program (20161080108). Ringraziamo anche la Prof.ssa Julia A. Vorholt (Istituto di Microbiologia, Dipartimento di Biologia, ETH Zurigo, Zurigo 8093, Svizzera) per la fornitura del ceppo di E. coli essenziale per metanolo versione 2.2 (MeSV2.2).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,22 μ m membrana filtrante in PVDFMerck Millipore Ltd.SLGPR33RBSterilizzare l'olio MMC
4 gradi Frigorifero CHaierBCD-289BSWPer la conservazione dei reagenti
AgarBecton, Dickinson and Company214010Per la preparazione di piastre solide
CaCl2· 2H2OReagente chimico Sinopharm Beijing Co., Ltd.20011160Componente del mezzo speciale per MeSV2.2.
Banco pulitoBeijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd.DL-CJ-INDIIPer funzionamento asettico e sterilizzazione UV
CoCl2· 6H2OReagente chimico Sinopharm Beijing Co., Ltd.10007216Componente del mezzo speciale per MeSV2.2.
ComputerLenovoE450Installazione software e controllo MMC Incubatore
temperatura costanteShanghai qixin scientific instrument co., LTDLRH 250Per la coltivazione microbica utilizzando terreno solido
CuSO4· 5H2OReagente chimico Sinopharm Beijing Co., Ltd.10008218Componente del mezzo speciale per MeSV2.2.
Bilancia elettronicaOHAUSAR 3130Per pesare reagenti
Provetta EPThermo Fisher1,5 mLPer raccolta goccioline
FeCl3· 6H2OReagente chimico Sinopharm Beijing Co., Ltd.10011928Componente del mezzo speciale per MeSV2.2.
Provetta di congelamentoThermo Fisher2,0 mLPer la conservazione del ceppo
GluconatoSigma-AldrichS2054Componente del terreno speciale per MeSV2.2.
GliceroloGENERAL-REAGENTG66258APer la conservazione dei ceppi
Pentola di sterilizzazione a vapore ad alta pressioneSANYO ElectricMLS3020Per sterilizzazione autoclavata
isopropil-beta;-d-tiogalattopiranoside (IPTG)Biotopped420322Componente del mezzo speciale per MeSV2.2.
Kanamicina solfatoSolarbioK8020Componente del mezzo speciale per MeSV2.2.
KH2PO4MACKLINP815661Componente del mezzo speciale per MeSV2.2.
MetanoloMACKLINM813895Componente del mezzo speciale per MeSV2.2.
MgSO4· 7H2OBIOBYING 1305715Componente del mezzo speciale per MeSV2.2.
Sistema di coltura microbica di microgoccioline (MMC)Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.  MMC-IEsecuzione della determinazione della curva di crescita e dell'evoluzione adattiva. Si prega di fare riferimento a http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110
chip microfluidicoLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MMC-ALE-ODPer varie operazioni di goccioline. Si prega di fare riferimento a http://www.tmaxtree.com/en/
Olio MMCLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MMC-M/S-ODLa fase oleosa per la microfluidica a goccioline. Si prega di fare riferimento a http://www.tmaxtree.com/en/
MnCl2Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.20026118Componente del mezzo speciale per MeSV2.2.
NaClGENERAL-REAGENTG81793JComponente del mezzo LB
Na2HPO4· 12H2OGENERAL-REAGENTComponente del mezzo speciale per MeSV2.2.
NH4ClReagente chimico Sinopharm Beijing Co., Ltd.10001518Componente del mezzo speciale per MeSV2.2.
Piastra di PetriCorning Incorporated90 mmPer la preparazione di terreni solidi
Pipetteeppendorf2.5 μ L, 10 μ L, 100μ L, 1000μ LPer la manipolazione dei liquidi
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SiringaJIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD10 mlAspirare il liquido e iniettarlo nel flacone del reagente
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TryptoneOxoid Ltd.LP0042Componente del frigorifero a
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Vitamina B1SolarbioSV8080Componente del mezzo speciale per MeSV2.2.
Estratto di lievitoOxoid Ltd.LP0021Componente del LB medium
ZnSO4· 7H2OReagente chimico Sinopharm Beijing Co., Ltd.10024018Componente del mezzo speciale per MeSV2.2.
a G10267B LB

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