Coltivazione microbica automatizzata ed evoluzione adattiva utilizzando il sistema di coltura microbica di microgoccioline (MMC)

Xingjin Jian; Xiaojie Guo; Jia Wang; Zheng Lin Tan; Xin-hui Xing; Liyan Wang; Chong Zhang

doi:10.3791/62800

Method Article

Coltivazione microbica automatizzata ed evoluzione adattiva utilizzando il sistema di coltura microbica di microgoccioline (MMC)

DOI:

10.3791/62800

⸱

February 18th, 2022

Xingjin Jian*¹^,² , Xiaojie Guo*¹^,²^,³ , Jia Wang⁴ , Zheng Lin Tan¹^,²^,⁶ , Xin-hui Xing¹^,²^,⁵ , Liyan Wang³ , Chong Zhang¹^,²^,⁵

¹Department of Chemical Engineering, Institute of Biochemical Engineering, Tsinghua University, ²Key Laboratory of Industrial Biocatalysis, Ministry of Education, Tsinghua University, ³Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd., ⁴Biochemical Engineering Research Group, School of Chemical Engineering and Technology, Xi’an Jiaotong University, ⁵Center for Synthetic & Systems Biology, Tsinghua University, ⁶School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive come utilizzare il sistema di coltura microbica di microgoccioline (MMC) per condurre la coltivazione microbica automatizzata e l'evoluzione adattativa. MMC può coltivare e sub-coltivare microrganismi automaticamente e continuamente e monitorare online la loro crescita con una produttività relativamente elevata e una buona parallelizzazione, riducendo il consumo di manodopera e reagenti.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I metodi di coltivazione microbica convenzionali di solito hanno operazioni ingombranti, bassa produttività, bassa efficienza e grande consumo di manodopera e reagenti. Inoltre, i metodi di coltivazione ad alto rendimento basati su micropiastre sviluppati negli ultimi anni hanno uno scarso stato di crescita microbica e sperimentano la parallelizzazione a causa del loro basso livello di ossigeno disciolto, della scarsa miscela e della grave evaporazione e dell'effetto termico. A causa dei numerosi vantaggi delle micro-goccioline, come il piccolo volume, l'elevata produttività e la forte controllabilità, la tecnologia microfluidica a base di goccioline può superare questi problemi, che è stata utilizzata in molti tipi di ricerca di coltivazione, screening ed evoluzione microbica ad alto rendimento. Tuttavia, la maggior parte degli studi precedenti rimane nella fase di costruzione e applicazione del laboratorio. Alcune questioni chiave, come gli elevati requisiti operativi, l'elevata difficoltà di costruzione e la mancanza di tecnologia di integrazione automatizzata, limitano l'ampia applicazione della tecnologia microfluidica a goccioline nella ricerca microbica. Qui, un sistema automatizzato di coltura microbica a microgoccioline (MMC) è stato sviluppato con successo basato sulla tecnologia microfluidica delle goccioline, ottenendo l'integrazione di funzioni come l'inoculazione, la coltivazione, il monitoraggio online, la sottocoltivazione, lo smistamento e il campionamento richiesti dal processo di coltivazione microbica delle goccioline. In questo protocollo, l'Escherichia coli (E. coli) MG1655 wild-type e un ceppo di E. coli essenziale per il metanolo (MeSV2.2) sono stati presi come esempi per introdurre come utilizzare l'MMC per condurre in dettaglio la coltivazione microbica automatizzata e relativamente ad alto rendimento e l'evoluzione adattativa. Questo metodo è facile da usare, consuma meno manodopera e reagenti e ha un'elevata produttività sperimentale e una buona parallelità dei dati, che presenta grandi vantaggi rispetto ai metodi di coltivazione convenzionali. Fornisce una piattaforma sperimentale a basso costo, favorevole alle operazioni e affidabile in termini di risultati per i ricercatori scientifici per condurre ricerche microbiche correlate.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La coltivazione microbica è una base importante per la ricerca scientifica microbiologica e le applicazioni industriali, che è ampiamente utilizzata nell'isolamento, identificazione, ricostruzione, screening ed evoluzione dei microrganismi ^1,2,3. I metodi di coltivazione microbica convenzionali utilizzano principalmente provette, fiaschi di scuotimento e piastre solide come contenitori di coltivazione, combinati con incubatori vibranti, spettrofotometri, lettori di micropiastre e altre attrezzature per la coltivazione, il rilevamento e lo screening microbico. Tuttavia, questi....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Installazione di strumenti e software

Scegli un ambiente pulito e sterile (come un banco pulito) come spazio permanente dedicato per MMC. Installare MMC in modo costante nello spazio.
NOTA: tenere l'MMC lontano dall'interferenza di forti campi elettrici, campi magnetici e forti sorgenti di radiazioni termiche. Evitare che forti vibrazioni influenzino i componenti di rilevamento ottico. Fornire l'alimentazione di AC220 V, 50 HZ all'MMC. Per informazioni dettagliate su MMC, fare riferimento alla Tabella dei materiali e al sito Web di MMC¹⁶.
Installare il software operativo dal file MMC.z....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo utilizza E. coli MG1655 e un ceppo MeSV2.2 come esempi per dimostrare la coltivazione microbica e l'evoluzione adattativa essenziale del metanolo con una strategia automatizzata e relativamente elevata in MMC. La misurazione della curva di crescita è stata utilizzata principalmente per caratterizzare la coltivazione microbica. L'evoluzione adattativa è stata condotta mediante sottocoltura continua automatizzata e aggiungendo un'alta concentrazione di metanolo come pressione selettiva durante og.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo presenta come utilizzare il sistema di coltura microbica di microgoccioline (MMC) per eseguire la coltivazione microbica automatizzata e l'evoluzione adattiva a lungo termine. MMC è un sistema di coltivazione microbica miniaturizzato, automatizzato e ad alto rendimento. Rispetto ai metodi e agli strumenti di coltivazione microbici convenzionali ad alta produttività, MMC presenta molti vantaggi come il basso consumo di manodopera e reagenti, il funzionamento semplice, il rilevamento online (OD e fluoresc.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio è stato supportato dal National Key Research and Development Program of China (2018YFA0901500), dal National Key Scientific Instrument and Equipment Project della National Natural Science Foundation of China (21627812) e dal Tsinghua University Initiative Scientific Research Program (20161080108). Ringraziamo anche la Prof.ssa Julia A. Vorholt (Istituto di Microbiologia, Dipartimento di Biologia, ETH Zurigo, Zurigo 8093, Svizzera) per la fornitura del ceppo di E. coli essenziale per metanolo versione 2.2 (MeSV2.2).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
0,22 μ m membrana filtrante in PVDF	Merck Millipore Ltd.	SLGPR33RB	Sterilizzare l'olio MMC
4 gradi Frigorifero C	Haier	BCD-289BSW	Per la conservazione dei reagenti
Agar	Becton, Dickinson and Company	214010	Per la preparazione di piastre solide
CaCl₂· 2H₂O	Reagente chimico Sinopharm Beijing Co., Ltd.	20011160	Componente del mezzo speciale per MeSV2.2.
Banco pulito	Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd.	DL-CJ-INDII	Per funzionamento asettico e sterilizzazione UV
CoCl₂· 6H₂O	Reagente chimico Sinopharm Beijing Co., Ltd.	10007216	Componente del mezzo speciale per MeSV2.2.
Computer	Lenovo	E450	Installazione software e controllo MMC Incubatore
temperatura costante	Shanghai qixin scientific instrument co., LTD	LRH 250	Per la coltivazione microbica utilizzando terreno solido
CuSO₄· 5H₂O	Reagente chimico Sinopharm Beijing Co., Ltd.	10008218	Componente del mezzo speciale per MeSV2.2.
Bilancia elettronica	OHAUS	AR 3130	Per pesare reagenti
Provetta EP	Thermo Fisher	1,5 mL	Per raccolta goccioline
FeCl₃· 6H₂O	Reagente chimico Sinopharm Beijing Co., Ltd.	10011928	Componente del mezzo speciale per MeSV2.2.
Provetta di congelamento	Thermo Fisher	2,0 mL	Per la conservazione del ceppo
Gluconato	Sigma-Aldrich	S2054	Componente del terreno speciale per MeSV2.2.
Glicerolo	GENERAL-REAGENT	G66258A	Per la conservazione dei ceppi
Pentola di sterilizzazione a vapore ad alta pressione	SANYO Electric	MLS3020	Per sterilizzazione autoclavata
isopropil-beta;-d-tiogalattopiranoside (IPTG)	Biotopped	420322	Componente del mezzo speciale per MeSV2.2.
Kanamicina solfato	Solarbio	K8020	Componente del mezzo speciale per MeSV2.2.
KH₂PO₄	MACKLIN	P815661	Componente del mezzo speciale per MeSV2.2.
Metanolo	MACKLIN	M813895	Componente del mezzo speciale per MeSV2.2.
MgSO₄· 7H₂O	BIOBYING 1305715		Componente del mezzo speciale per MeSV2.2.
Sistema di coltura microbica di microgoccioline (MMC)	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-I	Esecuzione della determinazione della curva di crescita e dell'evoluzione adattiva. Si prega di fare riferimento a http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110
chip microfluidico	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-ALE-OD	Per varie operazioni di goccioline. Si prega di fare riferimento a http://www.tmaxtree.com/en/
Olio MMC	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-M/S-OD	La fase oleosa per la microfluidica a goccioline. Si prega di fare riferimento a http://www.tmaxtree.com/en/
MnCl₂	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	20026118	Componente del mezzo speciale per MeSV2.2.
NaCl	GENERAL-REAGENT	G81793J	Componente del mezzo LB
Na₂HPO₄· 12H₂O	GENERAL-REAGENT		Componente del mezzo speciale per MeSV2.2.
NH₄Cl	Reagente chimico Sinopharm Beijing Co., Ltd.	10001518	Componente del mezzo speciale per MeSV2.2.
Piastra di Petri	Corning Incorporated	90 mm	Per la preparazione di terreni solidi
Pipette	eppendorf	2.5 μ L, 10 μ L, 100μ L, 1000μ L	Per la manipolazione dei liquidi
Connettore rapido A	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	—	Per il collegamento di ogni giunto. Si prega di fare riferimento al flacone di reagenti http://www.tmaxtree.com/en/
	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-PCB	Campionamento e conservazione di soluzioni batteriche e reagenti. Fare riferimento a http://www.tmaxtree.com/en/
Shake pallone	Union-Biotech	50 mL	Per la coltivazione microbica
Incubatore a scuotimento	Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd.	SKY-210 2B	Per la coltivazione microbica in pallone di agitazione
Streptomicina solfato	Solarbio	S8290	Componente del terreno speciale per MeSV2.2.
Siringa	JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD	10 ml	Aspirare il liquido e iniettarlo nel flacone del reagente
Ago per siringa	OUBEL Hardware Store	22G	Il diametro interno è di 0,41 mm e il diametro esterno è di 0,71 mm.
Tryptone	Oxoid Ltd.	LP0042	Componente del frigorifero a
bassissima temperatura	medium SANYO Ultra-low	MDF-U4086S	Per la conservazione delle tensioni (-80 ° C)
UV– Spettrofotometro Vis	General Electric Company	Ultrospec 3100 pro	Per la misurazione dei valori OD
Vitamina B1	Solarbio	SV8080	Componente del mezzo speciale per MeSV2.2.
Estratto di lievito	Oxoid Ltd.	LP0021	Componente del LB medium
ZnSO₄· 7H₂O	Reagente chimico Sinopharm Beijing Co., Ltd.	10024018	Componente del mezzo speciale per MeSV2.2.

a G10267B LB

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lewis, W. H., et al. Innovations to culturing the uncultured microbial majority. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).
Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. Reconstruction of biochemical networks in microorganisms.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Coltivazione microbica automatizzata ed evoluzione adattiva utilizzando il sistema di coltura microbica di microgoccioline (MMC)

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles