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Articolo metodologico

Produzione ricombinante di endoglicosidasi bifidobatteriche per il rilascio di N-glicani

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DOI:

10.3791/62804

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20 luglio 2021

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1Department of Molecular Biology and Genetics, Çanakkale Onsekiz Mart University, 2Uluova Dairy Farm, 3Department of Nutrition, University of Nevada, 4Department of Food Science and Technology, University of Nebraska, 5Evolve BioSystems Inc., 6Department of Biomedical Engineering, Karabuk University, 7Department of Chemistry, Hacettepe University

In questo articolo

Sommario

I bifidobatteri possiedono una capacità genomica unica per la scissione degli N-glicani. La produzione ricombinante di questi enzimi sarebbe un nuovo strumento promettente per rilasciare N-glicani bioattivi da substrati ricchi di glicoproteine come il colostro.

Abstract

La glicosilazione delle proteine è una modifica post-traduzionale diversificata e comune che è stata associata a molti ruoli importanti come la funzione delle proteine, tra cui il ripiegamento delle proteine, la stabilità, la protezione enzimatica e il riconoscimento biologico. Gli N-glicani attaccati alle glicoproteine (come la lattoferrina, la lattaferina e le immunoglobuline) non possono essere digeriti dall'ospite e raggiungono l'intestino crasso, dove vengono consumati da alcuni microbi benefici. Pertanto, sono considerati composti prebiotici di nuova generazione in grado di stimolare selettivamente i microrganismi benefici del microbioma intestinale. Tuttavia, l'isolamento di queste nuove classi di prebiotici richiede nuovi enzimi. Qui, descriviamo la produzione ricombinante di nuove glicosidasi da diversi ceppi di Bifidobatteri (isolati da neonati, conigli, polli e bombi) per un migliore isolamento degli N-glicani dalle glicoproteine. Il metodo presentato in questo studio include le seguenti fasi: clonaggio molecolare di geni bifidobatterici mediante una strategia di clonazione ricombinante in vivo, controllo del successo della trasformazione, induzione delle proteine e purificazione delle proteine.

Introduzione

La glicosilazione è una modificazione post-traduzionale molto cruciale osservata nelle proteine. Circa più del 50% delle proteine si trova nelle loro forme glicosilate negli eucarioti. N- e O-glicosilazione sono i due principali tipi di glicosilazione 1,2. I glicani legati agli O (O-glicani) sono legati in modo covalente alle proteine tramite N-acetilgalattosamina al gruppo ossidrile di residui di amminoacidi serina (Ser) o treonina (Thr). Gli N-glicani legati (N-glicani) sono oligosaccaridi complessi, che sono legati covalentemente all'asparagina (Asn) residuo aminoacidico delle proteine attraverso la N-acetilglucosamina (GlcNAc) in una particolare sequenza di aminoacidi AsN-X-Ser/Thr e in una meno comune, AsN-X-Cys (cisteina) (dove X potrebbe essere qualsiasi amminoacido tranne la prolina)3,4. Il nucleo basico di N-glicano è costituito da due residui di HexNAc e tre residui di mannosio. L'ulteriore allungamento di questo nucleo comune con altri monosaccaridi tramite gli enzimi glicosiltransferasi e glicosidasi determina il tipo di N-glicani in base al grado di ramificazione e al tipo di legame5. Gli N-glicani sono generalmente raggruppati in tre classi principali: mannosio alto (HM), tipo complesso (CT) e ibrido (HY)6.

Gli N-glicani sono composti indigeribili dagli organismi ospiti a causa della mancanza di enzimi glicosidici idrolasi. Questi composti raggiungono l'intestino tenue/crasso in una forma non digerita dove migliaia di specie batteriche diverse li utilizzano e possono agire come prebiotici promuovendo microbi intestinali specializzati, in particolare le specie Bifidobacterium 7. Recenti scoperte hanno dimostrato che gli N-glicani stimolano selettivamente la crescita di alcune specie batteriche 8,9. Gli N-glicani rilasciati dalle glicoproteine del latte bovino hanno stimolato selettivamente la crescita della sottospecie di Bifidobacterium longum infantis (B. infantis), che è una specie bifidobatterica cruciale nell'intestino del bambino, ma altre specie bifidobatteriche come il Bifidobacterium animalis (B. animalis) non hanno utilizzato questi composti9. Inoltre, un recente studio in vivo ha dimostrato che 19 N-glicani unici della lattoferrina del latte e delle immunoglobuline stimolano selettivamente la crescita di B. infantis8. In particolare, B. infantis possiede una capacità genomica per la scissione e il metabolismo dei glicani. Una endo-β-N-acetilglucosaminidasi (EndoBI-1), appartenente alla famiglia delle glicosil idrolasi 18, prodotta ricombinante da B. infantis ATCC 15697, ha mostrato un'elevata attività sulle glicoproteine del latte in condizioni in vitro 9,10. Questo nuovo enzima glicoside idrolasi è in grado di scindere le parti N-N'-diacetilchitobiosio presenti negli N-glicani 10,11. L'attività di EndoBI-1 non è influenzata dalla fucosilazione del nucleo e da diverse condizioni di reazione come alta temperatura, pH, tempo di reazione, ecc. 3,11,12. Questa caratteristica unica delle glicosidi idrolasi bifidobatteriche fornisce uno strumento promettente per la produzione di N-glicani da substrati ricchi di glicoproteine come il colostro bovino13,14.

Diversi metodi di deglicosilazione sviluppati chimicamente ed enzimaticamente sono stati ampiamente utilizzati per ottenere N-glicani e O-glicani da glicoproteine 2,15. I metodi chimici sono ampiamente utilizzati in glicobiologia per la deglicosilazione delle glicoproteine a causa della loro facilità d'uso, del basso costo e dell'elevata specificità del substrato16. I metodi di deglicosilazione chimica più comuni sono la β-eliminazione e l'idratazione17. Tra questi metodi, la β-eliminazione si basa sul principio della scissione dei glicani dalle glicoproteine mediante esposizione delle glicoproteine a condizioni alcaline. I glicani rilasciati possono essere degradati durante il processo a causa delle reazioni di eliminazione del β, ma questo problema può essere prevenuto utilizzando agenti riducenti come il boroidruro di sodio (NaBH4)18,19,20. Ci sono diverse limitazioni nel metodo di β-eliminazione. Gli agenti riduttivi convertono i glicani in alditoli, impedendo loro di legarsi a un fluoroforo o a un cromoforo. Pertanto, diventa difficile monitorare il rilascio di glicani 19,20. A causa dell'elevato contenuto di sale nella fase di pulizia del metodo, l'eluizione potrebbe causare perdite di campione20. Un altro metodo per il rilascio di glicano dalle glicoproteine è il metodo dell'idrazina basato sul principio della reazione di idrolisi in seguito all'aggiunta di idrazina anidra alla glicoproteina. Poiché consente di controllare l'isolamento dei glicani modificando le condizioni di reazione come la temperatura, il metodo dell'idrazina è stato ampiamente utilizzato in glicobiologia21. La deglicosilazione chimica può essere effettuata anche utilizzando la formulazione anidra di fluoruro di idrogeno e acido trifluoroacetico, oltre ad altri metodi di deglicosilazione chimica 16,22,23. Il rilascio enzimatico di N-glicani dalle glicoproteine è comunemente effettuato dalle peptidil-N-glicosidasi (PNGasi) che generalmente rilasciano N-glicani, indipendentemente dalle loro dimensioni e carica 24,25,26,27. Simile ai metodi di deglicosilazione chimica, il processo di deglicosilazione enzimatica presenta sfide diverse. Le PNGasi mostrano attività in presenza di diversi detergenti utilizzati, che aumentano l'accessibilità enzimatica ai glicani. Tuttavia, questi trattamenti duri potrebbero distruggere i glicani nativi e le restanti strutture polipeptidiche28. Le PNGasi potrebbero non scindere i glicani quando c'è un fucosio legato alla N-acetilglucosamina29. Varie endoglicosidasi come F1, F2 e F3 mostrano una maggiore attività sulle proteine native rispetto alle PNGasi. Queste endoglicosidasi hanno una bassa attività sui glicani multi-antennari, mentre il nuovo EndoBI-1 resistente al calore è efficace in tutti i tipi di N-glicani 10,11,28. Per quanto riguarda i limiti dei metodi attuali, è ovvio che sono ancora necessari nuovi enzimi per un efficace rilascio di glicani senza alcuna restrizione. A questo scopo, le specie bifidobatteriche, che hanno un'ampia isola genomica che codifica per vari enzimi glicosidici idrolasi, consentono di scindere gli N-glicani dalle glicoproteine30,31. Nell'ambito di questo contesto, l'obiettivo generale di questo studio è quello di scoprire nuove glicosidasi dalle varie specie di Bifidobatteri. Per produrre in modo ricombinante questi enzimi, diversi tag di fusione hanno lo scopo di migliorare la loro produzione e la loro attività.

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Protocollo

1. Clonaggio molecolare di geni bifidobatterici

  1. Amplificazione PCR di geni bersaglio mediante tre set di primer vettoriali (N-His, C-His e N-His SUMO)
    1. Preparare soluzioni di primer stock (oligomeri) da 100 μM aggiungendo acqua sterile nelle quantità determinate dall'azienda. Preparare nuovi stock da 10 μM da utilizzare nell'amplificazione PCR dei geni bersaglio.
    2. Preparare la miscela PCR (volume totale 50 μL) con 25 μL di master mix, 1 μL di primer diretto e inverso a 0,2 μM, 21 μL di acqua distillata priva di DNasi/RNasi e 2 μL di DNA stampo (cellule batteriche) nelle provette PCR. Mescolare delicatamente la miscela pipettando su e giù.
      NOTA: La miscela master (Lucigen) utilizzata per la PCR contiene Taq DNA polimerasi con elevata purezza e alta attività e può funzionare a temperature più elevate per un'amplificazione affidabile di modelli fino a 5 kb.
    3. Impostare il programma PCR come segue: fase iniziale di denaturazione a 95 °C per 5 minuti per il rilascio del DNA genomico, quindi 40 cicli di denaturazione a 95 °C per 30 s, ricottura a 60 °C per 30 s e allungamento a 72 °C per 1 minuto e l'estensione finale a 72 °C per 10 minuti.
    4. Controllare i prodotti PCR con il metodo dell'elettroforesi su gel di agarosio con un sistema di documentazione su gel dopo essere stati eseguiti a 100 V per 60 minuti sul gel di agarosio all'1%. Miscelare i prodotti della PCR e la scala del DNA con il colorante di caricamento mescolando a un rapporto di 1:5 (5 μL di prodotto della PCR + 1 μL di colorante di caricamento e 5 μL di 1 kb di scala del DNA + 1 μL di colorante di caricamento) per caricare sul gel (Figura 1).
    5. Misurare le concentrazioni di DNA dei prodotti PCR utilizzando un fluorimetro prima della fase di clonazione molecolare.
      NOTA: Le concentrazioni dei prodotti PCR devono essere nell'intervallo richiesto per il clonaggio molecolare (25-100 ng/μL).
  2. Preparazione del terreno di agar Brodo di Lisogenesi (LB) per clonazione molecolare
    1. Sciogliere 12,5 g di LB e 6 g di agarosio in 500 mL di dH2O e sterilizzare in autoclave il terreno di agar LB (sterilizzazione a 121 °C per 20 min).
    2. Sciogliere 15 mg di kanamicina con 1 mL di dH2O e conservare a -20 °C.
    3. Dopo la sterilizzazione in autoclave, aggiungere 1 mL di kanamicina nel flacone contenente i 500 mL sterili di terreno di agar LB. La concentrazione finale di kanamicina è di 30 μg/mL. Versare 25 mL di terreno di agar kanamicina LB in ciascuna piastra dell'armadio del laboratorio.
  3. Trasformazione per shock termico di cellule di E. coli chimicamente competenti
    1. Aggiungere nella provetta 1-3 μl (da 25 a 100 ng) di prodotti PCR per ciascun ceppo, inclusi 40 μl di cellule di E. coli chimicamente competenti. Quindi, aggiungere 2 μl di DNA vettore alla stessa provetta. Mescolare delicatamente con la punta della pipetta e trasferire le miscele in provette da centrifuga da 15 mL.
      NOTA: Eseguire questo passaggio sul ghiaccio. Non pipettare su e giù per mescolare per evitare bolle d'aria e il riscaldamento involontario delle cellule.
    2. Incubare le provette contenenti le cellule competenti e il DNA su ghiaccio per 30 minuti. Applicare uno shock termico alla miscela in un bagno d'acqua a 42 °C per 45 s. Mettere immediatamente queste provette sul ghiaccio e incubare per 2 minuti.
    3. Aggiungere 960 μl del terreno di recupero, utilizzato per il recupero rapido delle cellule dopo il clonaggio molecolare, alle cellule nelle provette e incubare le provette a 250 giri/min per 1 ora a 37 °C in un incubatore ad agitazione.
    4. Piastra 100 μL di cellule trasformate su piastre di agar LB contenenti 30 μg/mL di kanamicina. Utilizzare solo cellule di E. coli chimicamente competenti come controllo negativo.
      NOTA: Prima dell'uso, mettere nell'incubatore piastre di agar LB contenenti 30 μg/mL di kanamicina preparate al punto 1.2.2 a 37 °C.
    5. Incubare tutte le piastre per una notte a 37 °C in atmosfera ambiente (Figura 2).
  4. Preparazione del terreno LB per la PCR delle colonie
    1. Sciogliere 7,5 g di LB con 300 mL di dH2O in un flacone e sterilizzare in autoclave il terreno LB (sterilizzazione a 121 °C per 20 min).
    2. Sciogliere 9 mg di kanamicina (30 μg/mL) con 1 mL di dH2O e porre a -20 °C. Dopo la sterilizzazione in autoclave, aggiungere 1 mL di kanamicina nel flacone contenente i 300 mL sterili di terreno LB. Conservare il terreno di coltura liquido a +4 °C fino al momento dell'utilizzo.
  5. Screening dei trasformanti mediante PCR in colonia
    1. Per confermare che tutti i trasformanti trasportano i geni ricombinanti, selezionare le colonie in modo casuale e amplificare i geni bersaglio mediante PCR utilizzando i primer di sequenziamento forniti con il kit di clonazione.
    2. Eseguire tutti i passaggi sul ghiaccio e pre-raffreddare tutte le provette per PCR e le provette da 15 ml prima dell'uso.
    3. Utilizzando la punta di una pipetta, trasferire metà di una colonia selezionata nella provetta PCR per ciascun campione. Prelevare un'altra metà della colonia con il puntale della pipetta e inserirla nella provetta da 15 mL contenente 5 mL di terreno liquido LB+kanamicina (preparato al punto 1.4). Agitare le provette da 15 mL e incubare le colture liquide a 250 giri/min a 37 °C per una notte in un incubatore ad agitazione.
    4. Inserire 50 μl di miscela di reazione per PCR (25 μl di master mix, 1 μl di primer diretto, 1 μl di primer inverso, 23 μl di acqua distillata priva di DNasi/RNasi) in tutte le provette per PCR e disperdere le cellule pipettando delicatamente su e giù.
    5. Impostare il programma PCR a 95 °C per 5 minuti per il rilascio di DNA genomico mediante lisi di cellule batteriche, per un totale di 40 cicli di 95 °C per 30 s per la denaturazione iniziale, 60 °C per 30 s per la ricottura, 72 °C per 1 min per l'allungamento e 72 °C per 10 min per l'estensione finale.
    6. Controllare i prodotti PCR con il metodo dell'elettroforesi su gel dopo essere stati eseguiti a 100 V per 60 minuti sul gel di agarosio all'1% (Figura 3). I dettagli dell'elettroforesi su gel di DNA sono descritti nel passaggio 1.1.3.
    7. Preparare il 15% di scorte di glicerolo dei trasformanti riusciti. Mettere 500 μL di stock di glicerolo al 60% nelle crioprovette e aggiungere 1.500 μL della coltura liquida dei trasformanti riusciti. Conservare le scorte preparate a -80 °C.

2. Induzione dell'espressione proteica da parte dell'L-ramnosio

  1. Preparare una precoltura con 1 L di terreno liquido LB contenente 30 μg/mL di kanamicina.
  2. Mettere 8 mL di terreno LB in provette da centrifuga da 50 mL. Utilizzare una delle provette come controllo negativo contenente solo il mezzo liquido. Per il 20% di L-ramnosio come brodo, sciogliere 0,5 g di L-ramnosio con 2,5 mL di dH2O e conservare a -20 °C fino al momento dell'utilizzo.
  3. Mettere 10 μL delle scorte batteriche nelle provette da centrifuga contenenti 8 mL di terreno liquido. Agitarli delicatamente e incubare a 37 °C per una notte nell'incubatrice vibrante.
  4. Versare 250 mL di liquido LB in un pallone di Erlenmeyer sterilizzato da 2 L.
  5. Inoculare 2,5 mL della coltura liquida notturna in un pallone da 2 L contenente terreno liquido LB in un rapporto di 1:100 tra il pallone e il terreno e incubare a 37 °C e 150 giri/min per 4 ore nell'incubatore di agitazione.
  6. Misurare la densità ottica a 600 nm (OD600) per le cellule batteriche mediante uno spettrofotometro. Quando le cellule raggiungono la densità ottica di 0,5-0,6, aggiungere 2,5 mL di ramnosio al 20% (la concentrazione finale è 0,2%) ai 250 mL di coltura LB e incubare a 37 °C per una notte a 250 giri/min nell'incubatore con agitazione.
  7. Trasferire la coltura liquida nelle 5 provette da 50 mL, centrifugare campioni 3724 x g per 15 minuti a +4 °C ed eliminare il surnatante. Conservare i pellet a -20 °C fino alla fase di purificazione.
    NOTA: Per valutare l'espressione proteica con SDS-PAGE, raccogliere 1 mL di coltura non indotta (quando colture a una densità ottica di 600 nm di 0,5-0,6, senza L-ramnosio) come controllo e 1 mL di coltura indotta (dopo l'incubazione notturna) come campione indotto. Microcentrifugare tutti i campioni a 12.000 x g per 1 minuto e risospendere i campioni non indotti e indotti con 50 μL e 100 μL di tampone di caricamento SDS-PAGE, rispettivamente.

3. Lisi cellulare di cellule di E. coli chimicamente competenti contenenti enzimi His-tagged

  1. Preparare il tampone di lisi pH 8,0 (50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM imidazolo, 1% SDS), il tampone di equilibrazione pH 7,4 (20 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazolo), il tampone di lavaggio pH 7,4 (20 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 25 mM imidazolo) e il tampone di eluizione pH 7,4 (20 mM NaH2PO4, 300 mM di NaCl, 250 mM di imidazolo).
  2. Posizionare le provette da 50 mL contenenti i pellet cellulari a -80 °C per 15 minuti per congelare. Quindi, rimuovere il pellet da -80 °C e scongelare a temperatura ambiente.
  3. Aggiungere 5 mL di dH2O ai pellet e sciogliere pipettando su e giù. Centrifugare a 3724 x g per 15 minuti a +4 °C ed eliminare il surnatante.
  4. Per 50 mL di pellet di coltura, aggiungere 6.300 μL di tampone di lisi e 63 μL di cocktail di inibitori della proteasi stop senza EDTA (rapporto 1:100) nei pellet e sciogliere pipettando su e giù. Incubarli su ghiaccio per 30 min, vortice ogni 10 min.
  5. Impostare la modalità a impulsi del sonicatore su 10 s ON e 59 s OFF e l'ampiezza su 37%. Posizionare la provetta in un becher contenente ghiaccio e immergere la sonda del sonicatore nella provetta.
    NOTA: La sonda deve essere immersa completamente senza toccare alcun lato del tubo.
  6. Dopo il processo di sonicazione (6 impulsi per 10 s con 1 min di raffreddamento), centrifugare i campioni a 3.724 x g per 45 min a +4 °C. Successivamente, raccogliere tutte le parti surnatanti in una provetta e centrifugare a 3,724 x g per 5 minuti a +4 °C.
  7. Raccogliere il surnatante in una provetta e prelevare 100 μl del campione per l'elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) al punto 4.7. Misurare le concentrazioni proteiche dei campioni utilizzando un fluorimetro.

4. Purificazione di enzimi marcati con His-taged con metodo batch

  1. Aggiungere 1 mL di resina Ni-NTA in una provetta da centrifuga e centrifugare per 2 minuti a 700 x g. Rimuovere con cautela il tubo ed eliminare il surnatante formatosi.
  2. Aggiungere 2 mL (il doppio del volume della resina) del tampone di equilibratura nella provetta e mescolare bene fino a quando la resina non è completamente sospesa. Centrifugare la provetta per 2 minuti a 700 x g e rimuovere ed eliminare con cura il tampone.
  3. Mescolare l'estratto proteico e il tampone di equilibratura in un rapporto di 1:1 in una provetta da centrifuga. Aggiungere il composto al tubo contenente resina e metterlo su uno shaker a 150 giri/min per 30 min. Centrifugare la provetta per 2 minuti a 700 x g ed eliminare il surnatante.
  4. Lavare la resina con 5 mL di tampone di lavaggio e centrifugare la provetta per 2 minuti a 700 x g. Ripetere la fase di lavaggio fino a quando la concentrazione del surnatante non scende al valore di base.
  5. Aggiungere 1 mL di tampone di eluizione nella provetta per eluire le proteine marcate con His. Centrifugare la provetta per 2 minuti a 700 x g. Conservare il surnatante e prelevare 100 μl per l'analisi SDS-PAGE al passaggio 4.7. Ripetere la fase di eluizione tre volte. Misurare le concentrazioni di ciascun surnatante utilizzando un fluorimetro.
  6. Raccogliere tutti i surnatanti nella provetta tagliata da 10 kDa e centrifugarla per 2 minuti a 700 x g. Ripetere la centrifugazione fino a quando il volume del surnatante non scende a 200 μl pipettando di tanto in tanto su e giù. Conservare le proteine purificate a -20 °C e prelevare 100 μl per l'analisi SDS-PAGE al passaggio 4.7.
    NOTA: La concentrazione proteica deve essere misurata e, se la concentrazione è bassa, centrifugare fino a quando non aumenta.
  7. Analisi SDS-PAGE delle proteine purificate
    1. Preparare un gel da impilare al 4% (40% acrilammide/bisacrilammide, 1 M Tris pH 6,8, 10% SDS, 10% persolfato di ammonio, TEMED, dH2O) e un gel risolutore al 12% (40% acrilammide/bisacrilammide, 1 M Tris pH 8,8, 10% SDS, 10% persolfato di ammonio, TEMED, dH2O).
    2. Miscelare il campione con 2 tamponi Laemmli in un rapporto di 1:1 e incubare a 95 °C per 5 minuti per denaturare le proteine.
      NOTA: La concentrazione proteica dei campioni deve essere misurata prima del caricamento e il volume caricato si baserà sulla loro concentrazione a parità di carico.
    3. Aggiungere 1x tampone di corsa nel serbatoio e caricare i campioni e la scala delle proteine nei pozzetti. Far funzionare le proteine prima a 80 V e aumentare la corrente a 120 V quando le proteine si spostano dal gel di impilamento al gel di risoluzione.
    4. Mettere il gel nel colorante colorante blu coomassie e metterlo in uno shaker per 30 minuti. Lavare il gel con una soluzione decolorante (250 mL dH2O + 50 mL di acido acetico (HOAc) + 200 mL di metanolo) e scattare l'immagine (Figura 4).

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Risultati

In questo studio sono stati presi di mira gli enzimi membri della glicosil idrolasi selezionati da diverse origini. Si è ipotizzato che la co-applicazione di diversi enzimi con strutture diverse potesse fornire un migliore rilascio di glicani poiché sono evoluti per essere attivi in diverse glicoproteine. L'elenco dei geni bersaglio e la loro origine sono elencati nella Tabella 1. I ceppi batterici sono stati ottenuti dalle collezioni coordinate di microrganismi del Belgio. I set di primer sono stati pro...

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Discussione

La strategia di clonaggio ricombinante in vivo utilizzata per il clonaggio molecolare dei geni bersaglio fornisce risultati rapidi e affidabili rispetto ad altri protocolli di clonaggio tradizionali. Anche se esistono molti metodi convenienti per la clonazione molecolare, il metodo descritto in questo articolo presenta maggiori vantaggi. Il sistema di clonaggio in vivo , a differenza di altri sistemi di clonazione, non necessita di alcun trattamento enzimatico o purific...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo studio è supportato da TUBITAK #118z146 e Uluova Süt Ticaret A.Ş (Uluova Milk Trading Co.).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
EconoTaq PLUS 2X Master MixLucigen30035-1Amplificazione dei geni bersaglio (PCR)
Acqua distillata priva di DNasi/RNasiInvitrogen10977035Amplificazione dei geni bersaglio (PCR)
Safe-Red Loading DyeabmG108-RElettroforesi su gel di DNA
1 kb Plus DNA LadderGoldBioD011-500Elettroforesi
su gel di DNAKit di analisi della proteina QubitInvitrogenQ33211Misurazione della concentrazione di DNA
LB Brodo, Miller (Luria-Bertani)amrescoJ106-2KGTerreno di coltura batterica
AgarosioInvitrogen16500-500Terreno di coltura batterica et al.
Kanamicina monosolfatoGoldBioK-120-5Antibiotico in terreni di coltura batterica
Kit del sistema di clonazione ed espressione del ramnosio Expresso,Kit di clonazioneLucigen49011-1
Kit del sistema di clonazione ed espressione del ramnosio Expresso,Kit di clonazioneLucigen49013-1
Kit del sistema di clonazione ed espressione del ramnosio Expresso, C-HisLucigen49012-1Kit di clonazione
Soluzione di gliceroloSigma-Aldrich15524-1L-RPreparazione del fondo di glicerolo
L-Ramnosio monoidratoSigma-Aldrich83650Induzione dell'espressione proteica
2X Laemmli Sample BufferClearBandTGS10Analisi SDS-Page
SureCast 40% (w/v) AcrylamideInvitrogenHC2040Analisi SDS-Page
SureCast APSInvitrogenHC2005Analisi SDS-Page
SureCast TEMEDInvitrogenHC2006SDS-Page analisi
10X Running BufferClearBandTGS10SDS-Page analisi
Triset al.BioShopTRS001.1Analisi SDS-Page e lisi cellulare
10% SDSClearBandS100Analisi SDS-Page
PageRuler Plus Prestained Protein LadderThermoFisher26619Analisi SDS-Page
ImidazoleSigma-Aldrich56750Lisi cellulare
NaClSigma-Aldrich31434-5Kg-RLisi cellulare
Sodico Fosfato Monobasico Anidroamresco0571-1KgTampone fosfato di sodio per lisi cellulare
Fosfato di sodio bibasico Dihydrateet al.Sigma-Aldrich04272-1KgTampone fosfato di sodio per lisi cellulare
Filtro centrifugo cut-off da 10 kDaAmicon® - MERCKUFC9010Purificazione di enzimi
N-His SUMO

Riferimenti

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  2. Karav, S., German, J. B., Rouquié, C., Le Parc, A., Barile, D. Studying lactoferrin N-glycosylation. International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 870(2017).
  3. Le Parc, A., et al. A novel endo-β-N-acetylglucosaminidase releases specific N-glycans depending on different reaction conditions. Biotechnology Progress. 31 (5), 1323-1330 (2015).
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