Method Article

Formulazione e modulazione acustica di nanogoccioline di perfluorocarburi vaporizzate otticamente

DOI:

10.3791/62814

⸱

July 16th, 2021

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2School of Electrical Engineering, Georgia Institute of Technology, 3Department of Biomedical Engineering and School of Electrical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le nanogoccioline di perfluorocarburo attivate otticamente mostrano risultati promettenti nelle applicazioni di imaging al di fuori del sistema vascolare. Questo articolo dimostrerà come sintetizzare queste particelle, reticolare i fantasmi di poliacrilammide e modulare acusticamente le goccioline per migliorare il loro segnale.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le microbolle sono l'agente di contrasto di imaging più comunemente usato negli ultrasuoni. Tuttavia, a causa delle loro dimensioni, sono limitati ai compartimenti vascolari. Queste microbolle possono essere condensate o formulate come nanogoccioline di perfluorocarburi (PFCnD) che sono abbastanza piccole da stravasare e quindi essere attivate acusticamente nel sito bersaglio. Queste nanoparticelle possono essere ulteriormente migliorate includendo un assorbitore ottico come colorante organico nel vicino infrarosso o nanoparticelle (ad esempio, nanoparticelle di solfuro di rame o nanoparticelle d'oro / nanobarre). I PFCnD etichettati otticamente possono essere vaporizzati attraverso l'irradiazione laser in un processo noto come vaporizzazione ottica delle gocce (ODV). Questo processo di attivazione consente l'uso di nuclei di perfluorocarburi ad alto punto di ebollizione, che non possono essere vaporizzati acusticamente al di sotto della soglia massima dell'indice meccanico per la diagnostica per immagini. I nuclei con un punto di ebollizione più alto producono goccioline che si ricondensano dopo la vaporizzazione, con conseguente PFCnD "lampeggiante" che producono brevemente contrasto dopo la vaporizzazione prima di condensarsi di nuovo in forma di nanogocce. Questo processo può essere ripetuto per produrre contrasto su richiesta, consentendo l'imaging senza sfondo, il multiplexing, la super-risoluzione e il miglioramento del contrasto attraverso la modulazione ottica e acustica. Questo articolo dimostrerà come sintetizzare PFCnD a guscio lipidico attivabili otticamente utilizzando la sonicazione della sonda, creare fantocci in poliacrilammide per caratterizzare le nanogoccioline e modulare acusticamente i PFCnD dopo ODV per migliorare il contrasto.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le microbolle sono l'agente di contrasto ad ultrasuoni più diffuso grazie alla loro biocompatibilità e all'eccellente ecogenicità rispetto ai tessuti molli. Questo li rende strumenti preziosi per visualizzare il flusso sanguigno, la delineazione degli organi e altre applicazioni1. Tuttavia, le loro dimensioni (1-10 μm), che li rendono eccezionali per l'imaging in base alla loro frequenza di risonanza, limitano le loro applicazioni al sistema vascolare2.

Questa limitazione ha portato allo sviluppo di PFCnD, che sono nano-emulsioni composte da un tensioattivo racchiuso attorno a un nucleo di perfluorocarburi liquido. Queste nanoparticelle possono essere sintetizzate a dimensioni fino a 200 nm e sono progettate per sfruttare la vascolarizzazione o i pori "permeabili" e le fenestrature aperte presenti nel sistema montante tumorale. Mentre queste interruzioni sono dipendenti dal tumore, questa permeabilità consente lo stravaso di nanoparticelle da ~ 200 nm - 1,2 μm a seconda del tumore 3,4. Nella loro forma iniziale, queste particelle producono poco o nessun contrasto ad ultrasuoni. Dopo la vaporizzazione - indotta acusticamente o otticamente - la fase centrale cambia da liquido a gas, inducendo un aumento da due e mezzo a cinque volte del diametro 5,6,7 e generando contrasto fotoacustico e ultrasonico. Mentre la vaporizzazione acustica è il metodo di attivazione più comune, questo approccio crea artefatti acustici che limitano l'imaging della vaporizzazione. Inoltre, la maggior parte dei perfluorocarburi richiede ultrasuoni focalizzati con un indice meccanico oltre la soglia di sicurezza per vaporizzare8. Ciò ha portato allo sviluppo di PFCnD con punto di ebollizione inferiore, che possono essere sintetizzati condensando microbolle in nanogoccioline9. Tuttavia, queste goccioline sono più volatili e soggette a vaporizzazione spontanea10.

La vaporizzazione ottica delle gocce (ODV), d'altra parte, richiede l'aggiunta di un trigger ottico come le nanoparticelle 11,12,13 o il colorante 6,14,15 e può vaporizzare perfluorocarburi con punto di ebollizione più alto utilizzando fluenze entro il limite di sicurezza ANSI 11. I PFCnD sintetizzati con nuclei con punto di ebollizione più alto sono più stabili e si ricondensano dopo la vaporizzazione, consentendo l'imaging senza sfondo16, il multiplexing 17 e la super-risoluzione18. Uno dei principali limiti di queste tecniche è il fatto che i PFCnD ad alto punto di ebollizione sono ecogenici dopo la vaporizzazione solo per un breve periodo di tempo, sulla scala dei millisecondi19, e sono relativamente deboli. Mentre questo problema può essere mitigato attraverso vaporizzazioni ripetute e la media, il rilevamento e la separazione del segnale delle goccioline rimane una sfida.

Prendendo ispirazione dall'inversione del polso, la durata e il contrasto possono essere migliorati modificando la fase dell'impulso di imaging ad ultrasuoni19. Avviando l'impulso di imaging ad ultrasuoni con una fase di rarefazione (n-impulso), aumenta sia la durata che il contrasto dei PFCnD vaporizzati. Al contrario, l'avvio dell'impulso di imaging a ultrasuoni con una fase di compressione (p-pulse), si traduce in un contrasto ridotto e in una durata più breve. Questo articolo descriverà come sintetizzare nanogoccioline di perfluorocarburi attivabili otticamente, fantocci di poliacrilammide comunemente usati nell'imaging e dimostrare il miglioramento del contrasto e una migliore longevità del segnale attraverso la modulazione acustica.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Formulazione di nanogoccioline di perfluorocarburo

  1. Risciacquare un matraccio a fondo tondo da 10 mL con cloroformio e lavare una siringa di vetro a tenuta di gas da 10 μL e 1 mL con cloroformio aspirando ripetutamente l'intero volume della siringa ed espellendolo per un totale di tre volte.
    ATTENZIONE: Il cloroformio è volatile e può essere tossico se inalato. Tutti i lavori con questo solvente devono essere eseguiti in una cappa aspirante.
  2. Utilizzando le siringhe, aggiungere 200 μL di DSPE-mPEG2000 (25 mg/ml), 6,3 μL di 1,2-distearoyl-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC, 25 mg/ml) e 1 mL di IR 1048 (1 mg/ml in cloroformio) nel matraccio a fondo rotondo. Ricordarsi di pulire le siringhe tra lipidi/colorante per evitare la contaminazione del materiale.
    NOTA: i coloranti a infrarossi sono sensibili alla luce e il lavoro deve essere svolto in condizioni di scarsa luminosità o i palloni devono essere coperti con un foglio di alluminio.
  3. Rimuovere il solvente utilizzando un evaporatore rotante. Assicurarsi che il vuoto sia regolato lentamente a 332 mbar per evitare urti. Dopo 5 minuti, ridurre la pressione a 42 mbar per rimuovere l'acqua eventualmente entrata nella soluzione.
    NOTA: Il panello lipidico può essere conservato per una notte in un matraccio a fondo rotondo coperto di parafilm a 4 °C.
  4. Sospendere la torta lipidica in 1 ml di soluzione salina tamponata fosfato (PBS) e sonicare o vortice a temperatura ambiente per 5 minuti o fino a quando tutta la torta lipidica è stata sospesa e sciolta nella soluzione. Sonicare per altri 2 minuti per omogeneizzare la soluzione.
  5. Trasferire la soluzione in un flaconcino di vetro da 7 mL e porre il flaconcino in un piatto di vetro riempito di ghiaccio per consentire alla soluzione di raffreddarsi per 5 minuti prima di aggiungere 50 μL di perfluoroesano utilizzando una siringa di vetro a tenuta di gas. Ricordarsi di sciacquare la siringa con perfluoroesano prima di erogarla nel flaconcino.
  6. Posizionare il flaconcino di vetro contenente i lipidi e il bagno di ghiaccio nell'involucro del sonicatore della sonda e immergere la punta della sonda sotto il miniscus. Assicurarsi che i lati della sonda sonicatore non tocchino il labbro del flaconcino di vetro.
  7. Sonda sonicare la miscela con le seguenti impostazioni: Ampiezza 1, Tempo di processo: 20 s, Pulse-On: 1s, Pulse-off: 5s. Quindi sonicare con le seguenti impostazioni: Ampiezza: 50, Tempo di processo: 5 s, Pulse-on: 1 s, Pulse-off: 10 s.
  8. Trasferire la soluzione di nanogoccia in una provetta da centrifuga da 1,5 ml e centrifugare a 300 x g per 3 minuti per separare le goccioline più grandi (>1 μm) dalle goccioline più piccole.
  9. Scartare il pellet e trasferire il surnatante in un'altra provetta da centrifuga da 1,5 ml. Lavare il surnatante centrifugando a 3000 x g per 5 minuti per pellettare tutte le goccioline in soluzione. Risospendere i PFCnD in 1 mL di PBS pipettando il pellet su e giù e quindi sonicare in un sonicatore da bagno per 1 minuto.
  10. Misurare la dimensione delle goccioline utilizzando la diffusione dinamica della luce (DLS). Diluire i PFCnD stock di 100 volte (10 μL di stock di PFCnD in 990 μL di PBS) e sonicare il bagno per disperdere i PFCnD prima della misurazione. I risultati rappresentativi sono mostrati nella Figura 1.
  11. Determinare la concentrazione dei PFCnD utilizzando l'analizzatore di tracciamento delle nanoparticelle (vedere Tabella dei materiali). Diluire i PFCnD di 100-1000 volte per garantire una misurazione accurata della concentrazione. Il protocollo produce tipicamente goccioline ad una concentrazione dell'ordine di 1010 particelle / ml.
  12. Preparare 10 ml di gel di accoppiamento ad ultrasuoni in una provetta da centrifuga da 50 mL e aggiungere l'1% (v/v) o 100 μL di PFCnD per ottenere una soluzione di ~108 particelle/ml. Vortex la soluzione da miscelare. Centrifugare la miscela a 4000 x g per 3 minuti per rimuovere le bolle.

2. Preparazione fantasma di poliacrilammide

  1. Degasare l'acqua riempiendo un matraccio sottovuoto da 500 ml con 400 ml di acqua deionizzata, sigillare con un tappo di gomma e collegare il pallone alla linea del vuoto. Aprire la linea del vuoto e immergere il fondo del pallone nel sonicatore da bagno. Sonicare per 5 minuti o fino a quando non è visibile la formazione di bolle di gas.
  2. Preparare una soluzione di persolfato di ammonio (APS) al 10% sciogliendo 500 mg in 5 ml di acqua degassata. Ruotare delicatamente la soluzione se il persolfato di ammonio non si dissolve completamente.
  3. In un becher da 400 mL con una barra di agitazione su una piastra di agitazione, aggiungere 150 mL di acqua degassata e 50 mL di soluzione di acrilammide-bisacrilammide al 40% (p/v) per formare 200 ml di soluzione di acrilammide-bisacrilammide al 10%. Mescolare il composto a 200 giri / min per consentire la corretta miscelazione senza introdurre bolle.
    ATTENZIONE: L'acrilammide è cancerogeno e tutto il lavoro deve essere svolto in una cappa aspirante con guanti, specialmente se si lavora con acrilammide in polvere.
  4. Pesare 400 mg di silice e aggiungerli alla soluzione di acrilammide-bisacrilammide al 10% dal punto 2.3 per formare una soluzione allo 0,2 % (p/v) di silice e acrilammide.
    ATTENZIONE: La silice se inalata può essere cancerogena. Tutti i lavori, compresa la pesatura, devono essere eseguiti in una cappa aspirante.
  5. Preparare uno stampo quadrato da 58 mm x 58 mm x 78 mm con un'inclusione cilindrica tagliando le punte di una pipetta di trasferimento di plastica e sostenendola nello stampo con nastro da laboratorio. Vedere la Figura 2.
  6. Aggiungere 2 mL di soluzione di APS al 10 % nel becher per ottenere una concentrazione finale dello 0,1 % di APS e aggiungere 250 μL di tetrametiletilendiammina (TEMED) alla soluzione fantasma. Lasciare mescolare brevemente la soluzione (meno di un minuto).
  7. Versare rapidamente la soluzione nello stampo, facendo attenzione a non introdurre bolle d'aria nella soluzione. La soluzione dovrebbe polimerizzare entro 10 minuti. Rimuovere il fantasma facendo scorrere l'estremità piatta di una spatola da laboratorio attorno al bordo dello stampo e invertendo lo stampo.
    NOTA: Questi fantocci possono essere riutilizzati più volte e devono essere immersi in acqua e conservati a 4°C.

3. Imaging di nanogoccioline di perfluorocarburo

  1. Accendere e riscaldare il sistema laser pulsato per ~ 20 minuti seguendo le istruzioni del produttore. Assicurarsi che il fascio in fibra ottica sia collegato correttamente all'uscita laser e che le due gambe siano posizionate correttamente all'interno del supporto del fascio di fibre.
  2. Accendere il sistema di imaging a ultrasuoni, collegare il trasduttore di imaging array (L11-4v) al sistema e fissare il trasduttore all'interno del supporto per allineare il suo piano di imaging con la sezione trasversale del laser.
  3. Impostare la frequenza di ripetizione dell'impulso del sistema laser su 10Hz e posizionare un misuratore di potenza all'estremità del fascio di fibre per misurare l'energia. Regolare il ritardo dell'interruttore q fino a quando la fluenza stimata è di 70 mJ/cm2.
    ATTENZIONE: Gli occhiali appropriati devono essere indossati quando si spara il laser e le tende laser devono racchiudere lo spazio.
  4. Riempire uno dei canali del fantasma di poliacrilammide con il gel ad ultrasuoni/miscela PFCnD utilizzando una siringa a punta di plastica da 1 ml. Coprire liberamente la parte superiore del canale con gel ad ultrasuoni e rimuovere eventuali bolle con una siringa di plastica da 1 ml. Posizionare il fantasma di poliacrilammide sotto il trasduttore e il fascio di fibre come mostrato nella Figura 3.
  5. Utilizzare la piattaforma di imaging combinata a ultrasuoni laser ed elasticità (CLUE) basata sul software20 per immagini PFCnD sincronizzate con l'attivazione ottica. Modificare i parametri generali definiti dall'utente nella struttura Param per l'imaging: impostare la profondità di inizio/fine su 0/40mm, la frequenza centrale su 6,9 MHz e il nome del trasduttore su "L11-4v".
  6. Definire un nuovo RunCase e progettare una sequenza di moduli per l'attivazione/ricondensazione ottica ripetuta e l'imaging US di PFHnD. Questo viene fatto elencando moduli predefiniti come imaging ultraveloce (mUF), laser esterno (mExtLaser) e idle (mIdle).
    1. Ripetere due volte il set di sequenze mExtLaser-mIdle-mUF-mExtLaser-mUF per acquisire dati di imaging sia a impulso n che a impulso p.
      NOTA: il primo modulo mExtLaser in ogni sequenza viene impostato come laser fittizio impostando ExtLaser.Enable su 0 e il 'mIdle' è incluso per ridurre al minimo il tempo tra le immagini US di sfondo e le immagini US n/p-pulse dopo l'attivazione del laser.
  7. Impostare i parametri del modulo per ogni modulo inserito nella sequenza di moduli del caso di esecuzione corrente. Accedere a ciascun parametro del modulo per indice corrispondente al suo ordine nella sequenza del modulo. I moduli eseguiranno operazioni predefinite con i parametri del modulo impostati dall'utente qui.
    1. Impostare ExtLaser.QSdelay nei moduli laser esterni sul valore del ritardo del Q-switch laser sintonizzato nel passaggio 3.3, in microsecondi. Questo modulo attende l'attivazione della torcia del sistema laser e genera il trigger Q-switch dopo il ritardo specificato in QSdelay.
    2. Nel modulo di imaging ultraveloce, impostare Resource.numFrame su 100, impostare SeqControl.PRI su 200 (μs) e impostare TW.polarity su 1 per P-impulso e -1 per N-impulso (vedere la Figura 4 per la forma dell'impulso corrispondente). Questo modulo trasmetterà un'onda planare ultraveloce di 0 gradi con tipo di impulso specificato in TW.polarity.
      1. Acquisire una finestra di imaging con apertura completa di 38,8 mm di larghezza per il numero di fotogrammi in Resource.numFrame, intervallo di ripetizione dell'impulso di SeqControl.PRI, quindi salvare i dati per l'elaborazione off-line.
    3. Impostare SeqControl.lastPRI_Module modulo inattivo per il periodo di tempo tra gli impulsi laser (100 ms) sottratto dal ritardo dell'interruttore Q, dal tempo di acquisizione dei dati di imaging (20 ms) e da un margine di 20 μs per il segnale da percorrere. Questo modulo mantiene il sistema in stato di "nessuna operazione" per il tempo in SeqControl.lastPRI_Module per colmare il divario temporale tra la fine dell'acquisizione dei dati di imaging e la successiva eccitazione dell'impulso laser.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La corretta formulazione e separazione centrifuga dei PFCnD dovrebbe produrre goccioline di circa 200-300 nm di diametro (Figura 1A). Le goccioline separate in modo improprio possono mostrare piccoli picchi intorno a 1 μm. Queste soluzioni possono essere ulteriormente sonicate per rompere le goccioline più grandi. La dimensione delle goccioline aumenterà nel tempo a causa della coalescenza e/o della diffusione in un processo noto come Ostwald maturando21,22...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La sonicazione della sonda è un metodo relativamente semplice e facile da imparare per fabbricare PFCnD. Ci sono alcuni passaggi in cui è necessario prestare attenzione. Quando si maneggia il cloroformio, è imperativo utilizzare una pipetta a spostamento positivo o siringhe di vetro, poiché è volatile e "perde" dalle pipette a spostamento d'aria standard. Inoltre, se si utilizza uno spostamento positivo, assicurarsi che venga utilizzata una punta appropriata poiché il cloroformio dissolverà la maggior parte delle punte d...

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Disclosures

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il lavoro è stato sostenuto in parte dalla Breast Cancer Research Foundation con sovvenzione BCRF-20-043.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Persolfato di ammonio (APS)VWR97064-592
1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC)Avanti Polar Lipids850365CLipidi, questi possono essere acquistati sospesi in cloroformio o in polvere. Per la conservazione a lungo termine, la polvere è la migliore, ma il cloroformio è più pratico.
1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilenglicole)-2000] (sale di ammonio) (DSPE-PEG)Avanti Polar Lipids880120CLipidi, questi possono essere acquistati sospesi in cloroformio o in polvere. Per la conservazione a lungo termine, la polvere è la migliore, ma il cloroformio è più pratico.
Acrilammide : Soluzione di bisacrilammide (19:1) 40% (p/v), OmniPur®VWREM-1300soluzione acrilammidica, concentrazione più bassa/ polvere
IR-1048Sigma405175colorante a infrarossi
L11-4vTrasduttore lineare a ultrasuoniVerasonics
Microtip 1/8"Qsonica LLC4418microtip per sonicatore
a sonda N, N, N′, N′ -Tetrametiletilendiammina (TEMED)VWR97064-902Utilizzato per polimerizzare la poliacrilammide formando radicali liberi in presenza di persolfato di ammonio
Nova IIOphir-Spiricon7Z01550misuratore di potenza laser
PerfluoroesanoFluoromedAPF-60Mperfluorocarburo liquido
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) CompresseVWR97062-732Compresse utilizzate per produrre PBS
Q500Qsonica LLCQ500-110Sonda sonicatore
Gel di siliceSigma-Aldrich2885002-25 μ m dimensione delle particelle
Tempest 30New waveresearch-Sistemalaser pulsato
Vantage 128Verasonics-sistemaimaging a ultrasuoni per la ricerca
Zetasizer Nano ZSMalvern Instruments Ltd-Effettuamisurazioni dimensionali basate sulla diffusione dinamica della luce
di

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