Espressione GFP indotta dalla luce in embrioni di zebrafish utilizzando il sistema optogenetico TAEL/C120

Summary

L'optogenetica è uno strumento potente con applicazioni ad ampio raggio. Questo protocollo dimostra come ottenere l'espressione genica inducibile dalla luce negli embrioni di zebrafish utilizzando il sistema TAEL/C120 sensibile alla luce blu.

Abstract

I sistemi di espressione genica inducibili sono uno strumento inestimabile per lo studio dei processi biologici. I sistemi di espressione optogenetica possono fornire un controllo preciso sui tempi, la posizione e l'ampiezza dell'espressione genica utilizzando la luce come agente induttore. In questo protocollo, un sistema di espressione optogenetica viene utilizzato per ottenere l'espressione genica inducibile dalla luce negli embrioni di zebrafish. Questo sistema si basa su un fattore di trascrizione ingegnerizzato chiamato TAEL basato su un fattore di trascrizione attivato dalla luce naturale dal batterio E. litoralis. Quando illuminato con luce blu, TAEL dimerizza, si lega al suo elemento regolatore affine chiamato C120 e attiva la trascrizione. Questo protocollo utilizza embrioni transgenici di zebrafish che esprimono il fattore di trascrizione TAEL sotto il controllo dell'onnipresente promotore ubb. Allo stesso tempo, l'elemento regolatore C120 guida l'espressione di un gene reporter fluorescente (GFP). Utilizzando un semplice pannello LED per fornire luce blu attivante, l'induzione dell'espressione GFP può essere rilevata per la prima volta dopo 30 minuti di illuminazione e raggiunge un picco di oltre 130 volte l'induzione dopo 3 ore di trattamento della luce. L'induzione dell'espressione può essere valutata mediante PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR) e microscopia a fluorescenza. Questo metodo è un approccio versatile e facile da usare per l'espressione genica optogenetica.

Introduction

I sistemi di espressione genica inducibili aiutano a controllare la quantità, i tempi e la posizione dell'espressione genica. Tuttavia, ottenere l'esatto controllo spaziale e temporale negli organismi multicellulari è stato difficile. Il controllo temporale è più comunemente ottenuto aggiungendo composti a piccole molecole¹ o attivazione di promotori di shock termici². Tuttavia, entrambi gli approcci sono vulnerabili a problemi di tempistica, forza di induzione e risposte allo stress fuori bersaglio. Il controllo spaziale si ottiene principalmente con l'uso di promotori tessuto-specifici³, ma ques....

Protocol

Questo studio è stato condotto con l'approvazione dell'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università della California Merced.

1. Incrocio di zebrafish e raccolta di embrioni

1. Mantenere separate le linee transgeniche di zebrafish contenenti l'attivatore trascrizionale TAEL o il gene reporter controllato da C120 per ridurre al minimo l'attivazione spuria.
2. Incrociare 6-8 pesci zebra adulti da ogni linea utilizzando i metodi standard⁹ per produrre embrioni transgenici doppi che contengono sia i componenti TAEL che C120 (Figura 1B).
   NOTA: In alterna....

Results

Per questa dimostrazione, una linea reporter GFP C120-responsive (Tg(C120F:GFP)^ucm107)) è stata incrociata con una linea transgenica che esprime TAEL-N ubiquitamente dal promotore dell'ubiquitina b (ubb) (Tg(ubb:TAEL-N)^ucm113)) per produrre embrioni transgenici doppi contenenti entrambi gli elementi. 24 ore dopo la fecondazione, gli embrioni sono stati esposti all'attivazione della luce blu, pulsata ad una frequenza di 1 ora on/1 h off. L'induzione dell'espression.......

Discussion

Questo protocollo descrive l'uso del sistema optogenetico TAEL/C120 per ottenere l'espressione genica inducibile dalla luce blu. Questo sistema è costituito da un attivatore trascrizionale, TAEL, che dimerizza all'illuminazione con luce blu e attiva la trascrizione di un gene di interesse a valle di un elemento regolatore C120. L'espressione indotta di un reporter GFP può essere rilevata dopo appena 30 minuti di esposizione alla luce, suggerendo che questo approccio possiede una cinetica relativamente veloce e reattiva.<.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BioRender strumento di illustrazione scientifica basato sul web	BioRender
Fotocamera digitale CCD	a https://biorender.com/ Lumenara	755-107
Console compatta per contatori di potenza ed energia, LCD digitale da 4"	Thorlabs	PM100D
, 545 nm	Olympus	ET545/25x
illustra RNAspin Mini kit	GE Sanità	95017-491
Instant Ocean Sea Salt	Instant Ocean	SS15-10
MARS AQUA Dimmerabile 165 W LED Acquario luce (blu e bianco)	Amazon	B017GWDF7E
Metilcellulosa	Sigma-Aldrich	M7140
NEARPOW Timer digitale programmabile	Amazon	B01G6O28NA
PerfeCTa SYBR verde mix veloce	Quantabio	101414-286
Software per l'elaborazione delle immagini Photoshop
Prism,	GraphPad
qScript, XLT, cDNA, SuperMix,	Quantabio	10142-786
QuantStudio 3, Sistema di PCR in tempo reale	, Applied Biosystems	A28137
Stereomicroscopio	Olympus	SZX16
Tricaina (Etile 3-amminobenzoato metanosulfonato)	Sigma-Aldrich	E10521
X-Cite 120 Sorgente luminosa LED a fluorescenza	Excelitas	010-00326R	Fuori produzione. È stato sostituito con l'X-Cite mini+