I saggi automatizzati che utilizzano micropiastre multi-pozzo sono approcci vantaggiosi per identificare i regolatori di percorso consentendo la valutazione di una moltitudine di condizioni in un singolo esperimento. Qui, abbiamo adattato il consolidato protocollo di imaging e quantificazione dei macropinosomi a un formato di micropiastre a 96 pozzetti e forniamo uno schema completo per l'automazione utilizzando un lettore di piastre multimodale.
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Articolo metodologico
Imaging e analisi automatizzati per la quantificazione di macropinosomi marcati fluorescentemente
In questo articolo
Sommario
Abstract
La macropinocitosi è una via di assorbimento in fase fluida non specifica che consente alle cellule di internalizzare grandi carichi extracellulari, come proteine, agenti patogeni e detriti cellulari, attraverso l'endocitosi di massa. Questo percorso svolge un ruolo essenziale in una varietà di processi cellulari, tra cui la regolazione delle risposte immunitarie e il metabolismo delle cellule tumorali. Data questa importanza nella funzione biologica, l'esame delle condizioni di coltura cellulare può fornire informazioni preziose identificando i regolatori di questo percorso e ottimizzando le condizioni da impiegare nella scoperta di nuovi approcci terapeutici. Lo studio descrive una tecnica automatizzata di imaging e analisi che utilizza apparecchiature di laboratorio standard e un lettore di piastre multimodale per l'imaging cellulare per la rapida quantificazione dell'indice macropinocitico nelle cellule aderenti. Il metodo automatizzato si basa sull'assorbimento di destrano fluorescente ad alto peso molecolare e può essere applicato a micropiastre a 96 pozzetti per facilitare la valutazione di più condizioni in un esperimento o campioni fissi montati su coperture di vetro. Questo approccio mira a massimizzare la riproducibilità e ridurre la variazione sperimentale, risparmiando tempo ed economicamente vantaggioso.
Introduzione
La via endocitica non specifica della macropinocitosi consente alle cellule di interiorizzare una varietà di componenti extracellulari, tra cui nutrienti, proteine, antigeni e agenti patogeni, attraverso l'assorbimento di massa del fluido extracellulare e dei suoi costituenti1. Sebbene importante per la biologia di numerosi tipi cellulari, sempre più spesso, la via della macropinocitosi è descritta per svolgere un ruolo essenziale nella biologia tumorale, dove, attraverso l'assorbimento macropinocitico, le cellule tumorali sono in grado di sopravvivere e proliferare in presenza di un microambiente impoverito di nutrienti2,3
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Protocollo
1. Preparazione dei materiali
- Sciogliere 70 kDa destrano marcato con FITC o tetrametilrodramina (TMR) in PBS per ottenere una soluzione da 20 mg/mL. Conservare le aliquote a -20 °C.
- Sciogliere DAPI in ddH2O per ottenere una soluzione da 1 mg/mL. Conservare le aliquote a -20 °C.
ATTENZIONE: DAPI è un potenziale cancerogeno e deve essere maneggiato con cura. - Il giorno della fissazione, preparare formaldeide fresca al 3,7% di grado ACS in PBS.
ATTENZIONE: La formaldeide è un fissativo, noto cancerogeno ed è tossico se inalato. Preparare la soluzione in una cappa aspirante chimica per evitare l'inalazione e maneggiarla con cu....
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Risultati
Quando i passaggi e l'aggiustamento del protocollo sopra descritto vengono seguiti di conseguenza, i risultati sperimentali finali dovrebbero fornire informazioni sul fatto che le condizioni di coltura cellulare studiate o gli inibitori inducano o riducano la macropinocitosi nella linea cellulare di interesse. Per rafforzare la validità di questi risultati, l'inclusione di condizioni di controllo consentirà l'esame dei risultati per determinare se l'esperimento è stato completato con successo. I controlli di induzione de.......
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Discussione
La qualità degli esperimenti e dell'acquisizione dei dati dipende molto dalla qualità dei reagenti, dall'ottimizzazione delle impostazioni e dalla pulizia delle coperture e delle micropiastre. I risultati finali dovrebbero dare una variazione minima tra le repliche; tuttavia, le variazioni biologiche si verificano naturalmente o possono essere altrimenti causate da una serie di fattori. La densità cellulare può indurre le cellule a rispondere più o meno agli induttori o agli inibitori della macropinocitosi. E' quindi fon.......
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Dichiarazioni
C.C. è un inventore di un brevetto rilasciato intitolato "Diagnostica del cancro, terapie e scoperta di farmaci associati alla macropinocitosi", brevetto n.: 9.983.194.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni NIH / NCI (R01CA207189, R21CA243701) a C.C. KMO.G. ha ricevuto un TRDRP Postdoctoral Fellowship Award (T30FT0952). BioTek Cytation 5 fa parte del Sanford Burnham Prebys Cell Imaging Core, che riceve sostegno finanziario dal NCI Cancer Center Support Grant (P30 CA030199). Le figure 1-3 sono state create utilizzando BioRender.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,25% Tripsina | Corning | 25053CI | 0,1% EDTA in HBSS senza bicarbonato di calcio, magnesio e sodio |
| 1,5 mL Provetta per microcentrifuga | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| Piatto per coltura tissutale da 10 cm | Greiner Bio-One | 664160 | CELLSTAR |
| Provetta da centrifuga da 15 mL | Fisherbrand | 07-200-886 | |
| Bicchiere da 2 L | Fisherbrand | 02-591-33 | |
| Piastra per coltura tissutale a 24 pozzetti | Greiner Bio-One | 662160 | CELLSTAR |
| Serbatoio per reagenti da 25 mL | Genesee Scientific Corporation | 28-121 | |
| Becher da 500 mL | Fisherbrand | 02-591-30 | |
| Piatto per coltura tissutale da 6 cm | Greiner Bio-One | 628160 | CELLSTAR |
| Adattatore per aspirazione a 8 canali | Integra Biosciences | 155503 | |
| Adattatore di aspirazione a 8 canali per puntali standard | Integra Biosciences | 159024 | |
| 95% Ethanol | Decon Laboratories Inc | 4355226 | |
| Detergente per vetri senza ammoniaca | Sparkle | FUN20500CT | |
| Micropiastra di screening ad alto contenuto a 96 pozzetti nera | PerkinElmer | 6055300 | CellCarrier-96 Ultra |
| Applicatore con punta in cotone | Fisherbrand | 23-400-101 | |
| Vetrini coprioggetti | Fisherbrand | 12-545-80 | Lettore |
| multimodale Cytation 5 Cell Imaging di 12 | Biotek | CYT5FW | |
| DAPI | Millipore Sigma | 5.08741 | |
| Destrano 70 kDa - FITC | Life Technologies | D1822 | Fissabile |
| con lisinaDestrano 70 kDa - TMR | Life Technologies | D1819 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D1435 | |
| DPBS | Corning | 21031CV | di calcio e magnesio |
| Strumenti per la scienza fine | 11251-20 | Dumont #5 | |
| Formaldeide, 37% | Ricca Chemical | RSOF0010-250A | ACS Reagente Grado |
| Glycerol | Fisher BioReagenti | BP229-1 | |
| Mezzi di montaggio a fluorescenza indurenti | Agilent Tech | S302380-2 | DAKO |
| Hoechst 33342 | Millipore Sigma | B2261 | |
| Acido cloridrico (HCl) | Fisher Chemical | A144-212 | Certificato ACS Plus, 36,5%... 38,0% |
| Salviette prive di lanugine | Kimberly-Clark | 34155 | Kimwipes |
| Vetrini per miscroscopio | Fisherbrand | 12-544-1 | Pipetta multicanale in vetro liscio Premium |
| Gilson | FA10013 | 8 canali, 0,5" 10 µ L | |
| Pipetta multicanale | Gilson | FA10012 | 12 canali, 20– 200 µ L |
| Pipetta multicanale | Gilson | FA10011 | 8 canali, 20– 200 µ L |
| Parafilm M | Pechiney | PM996 | |
| Involucro di plastica | Kirkland Signature | 208733 | Isolatori |
| in silicone | Stretch-Tite Grace Bio Labs Inc | 664107 | 13 mm di diametro X 0,8 mm di profondità ID, 25 mm X 25 mm |
| Adattatore scorrevole | Biotek | 1220548 | |
| Flacone di lavaggio | Fisherbrand | FB0340922C |
Riferimenti
- Lin, X. P., Mintern, J. D., Gleeson, P. A. Macropinocytosis in different cell types: similarities and differences. Membranes. 10 (8), 21(2020).
- Recouvreux, M. V., Commisso, C. Macropinocytosis: a metabolic adaptation to nutrient stress in cancer. Frontier....
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Ristampe e permessi
