In questo protocollo, il vettore AAV2 è prodotto co-coltivando cellule di insetti Spodoptera frugiperda (Sf9) con baculovirus (BV)-AAV2-green fluorescent protein (GFP) o gene terapeutico e cellule Sf9 infette da BV-AAV2-rep-cap in coltura in sospensione. Le particelle AAV vengono rilasciate dalle cellule utilizzando detergente, chiarificate, purificate mediante cromatografia a colonna di affinità e concentrate mediante filtrazione a flusso tangenziale.
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Articolo metodologico
Sviluppo del processo per la produzione e la purificazione del vettore adeno-associato al virus (AAV)2 utilizzando il sistema di coltura cellulare baculovirus-insetto
In questo articolo
Sommario
Abstract
I virus adeno-associati (AAV) sono vettori promettenti per le applicazioni di terapia genica. Qui, il vettore AAV2 è prodotto dalla co-coltura di cellule di Spodoptera frugiperda (Sf9) con cellule Sf9 infettate da baculovirus (BV)-AAV2-GFP (o gene terapeutico) e BV-AAV2-rep-cap in coltura in sospensione senza siero. Le cellule vengono coltivate in un pallone in uno shaker orbitale o in un bioreattore Wave. Per rilasciare le particelle AAV, le cellule produttrici vengono lisate in un tampone contenente detergente, che viene successivamente chiarito mediante centrifugazione e filtrazione a bassa velocità. Le particelle AAV vengono purificate dal lisato cellulare utilizzando la cromatografia a colonna AVB Sepharose, che lega le particelle AAV. Le particelle legate vengono lavate con PBS per rimuovere i contaminanti ed eluite dalla resina utilizzando un tampone di citrato di sodio a pH 3,0. L'eluato acido viene neutralizzato con tampone alcalino Tris-HCl (pH 8,0), diluito con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e ulteriormente concentrato con filtrazione a flusso tangenziale (TFF). Il protocollo descrive la produzione di vettori pre-clinici su piccola scala compatibile con la produzione AAV di grado clinico su larga scala per applicazioni di terapia genica umana.
Introduzione
I virus adeno-associati (AAV) sono parvovirus umani non avvolti contenenti un DNA a singolo filamento di 4,6 kb. I vettori AAV hanno diversi vantaggi rispetto ad altri vettori virali per applicazioni di terapiagenica 1,2,3,4. Gli AAV sono naturalmente incompetenti per la replicazione, quindi richiedono un virus helper e un meccanismo ospite per la replicazione. Gli AAV non causano alcuna malattia e hanno una bassa immunogenicità nell'ospite infetto3,5. L'AAV può infettare sia le cell....
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Protocollo
Vedere la Figura 1 per un'illustrazione che riepiloga il protocollo.
1. Generazione di cellule TIPS infette da baculovirus
- Scongelare una fiala di cellule Sf9 e seminarle immediatamente in 50 ml di terreno di coltura cellulare di insetti. Coltiva celle Sf9 in un incubatore shaker orbitale a 125 giri/min e 28 °C in palloni a fondo tondo con un tappo liberamente fissato per lo scambio d'aria8,9. Propagare le cellule in un pallone da 1 L contenente 200 mL di terreno per ottenere un numero sufficiente di cellule PER LA PRODUZIONE DI CELLULE TIPS.<....
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Risultati
Qui vengono mostrati i risultati rappresentativi dello sviluppo del processo per la produzione e la purificazione di vettori AAV utilizzando il sistema cellulare di insetti Sf9. Il metodo include la co-coltura di cellule Sf9 con cellule TIPS infette da baculovirus, l'alimentazione delle cellule con terreno di crescita, la raccolta e la lisi delle cellule produttrici per rilasciare le particelle AAV, la chiarificazione del lisato cellulare con trattamento della nucleasi, la centrifugazione e la filtrazione, la purificazio.......
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Discussione
I parametri utilizzati in questo protocollo per lo sviluppo del processo di produzione, purificazione e concentrazione di vettori AAV possono essere applicati sia alla produzione su piccola che su larga scala di vettori AAV per applicazioni di terapia genica. L'intero processo a monte e a valle può essere eseguito in un sistema chiuso compatibile con le attuali Good Manufacturing Practices (cGMP). I principali vantaggi del sistema Sf9-baculovirus sono la scalabilità per la produzione di AAV di livello GMP su larga scala .......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare il Dr. Robert M. Kotin (National Heart, Blood and Lung Institute, NIH) per averci generosamente fornito i plasmidi AAV e Danielle Steele e Rebecca Ernst (Cincinnati Children's Hospital) per la loro assistenza tecnica. Questo lavoro è supportato dal fondo Start-Up dalla Cincinnati Children's Research Foundation a M.N.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1 N Idrossido di sodio | Sigma-Aldrich | 1.09137 | Per la pulizia Akta Avant |
| Palloni da 2 L | ThermoFisher Scientific | 431281 | Pallone per coltura in sospensione |
| Tubo conico da 50 ml | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | Per la raccolta di surnatanti |
| Piastra a 24 pozzetti | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Piastra per colture cellulari aderenti |
| Palloni da 250 mL | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask per coltura in sospensione |
| Akta Avant 150 con Unicorn Software | Cytiva | 28976337 Sistema cromatografico | |
| AVB Sepharose Mezzo | cromatografico | Cytiva | 28411210 |
| Baculovirus-AAV-2 GFP | Vettore | ||
| di trasferimento AAV non catalogato internoBaculovirus-AAV-2 rep-cap | Vettore di imballaggio AAV | non catalogato | in-house |
| Nucleasi | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzima per degradare il DNA e l'RNA |
| Tampone bloccante | Santa Cruz Biotechnologies 516214 | Blocco per prevenire il legame di anticorpi non specifici alle cellule | |
| Tampone di lisi cellulare | In-house | Articolo non di catalogo | 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 0,5 % Titron X-100 |
| Cellbag, 2 L e 10 L | Cytiva | 28937662 | Sacca per bioreattore |
| Tampone di pulizia | In-house | Articolo non di catalogo | 100 mM di acido citrico (pH 2,1) |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | Per crioconservazione |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Terreni di crescita per linee cellulari |
| Tampone di eluizione | Articolo | interno Non di catalogo | 50 mM di tampone citrato di sodio (pH 3,0) |
| Etanolo | Sigma-Aldrich | E7073 | Per la disinfezione e la conservazione della cromatografia |
| Unità di filtrazione | Pall Corporation | 12941 | Filtro a membrana |
| HT1080 linea cellulare | ATCC | CCL-121 | Linea cellulare di fibroblasti |
| HyClone™ SFX-Terreni di coltura per insetti | Cytiva | SH30278.02 | Terreno di crescita delle cellule di insetti senza siero |
| Pompa peristaltica | Pall Corporation | Articolo non di catalogo | Pompa TFF |
| MaxQ 8000 incubatore con agitatore orbitale | ThermoFisher Scientific | Agitatore per colture in | sospensione |
| Microscopio | Nikon | Articolo fuori catalogo | Monitoraggio e conteggio cellulare |
| Anticorpo PE anti-baculovirus gp64 di topo | Santa Cruz Biotechnologies | 65498 PE | Monitoraggio dell'infezione da baculovirus nelle cellule Sf9 |
| Serbatoio di ossigeno | Praxair | Articolo non di catalogo | 40 % L'apporto di ossigeno è necessario per la crescita delle cellule Sf9 |
| PBS | ThermoFisher Scientific 20012027 | Tampone di lavaggio | |
| Kit di colorazione dell'argento | ThermoFisher Scientific | LC6100 | Colorazione AAV proteine del capside |
| Cellule Sf9 | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Cellule di insetti |
| Acqua di steile | Articolo non di catalogo | Interno Per la pulizia Akta Avant | |
| Centrifuga da tavolo | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | Per la chiarificazione del surnatante del baculovirus |
| Cartuccia di filtrazione a flusso tangenziale (TFF) | Pall Corporation | OA100C12 | Cartuccia TFF per concentrare il |
| Tris-HCl AAV, pH 8.0 | ThermoFisher | 15568025 | tampone alcalino per neutralizzare il bioreattore AAV WAVE eluito |
| Sistema 20/50 | Cytiva | 28-9378-00 | Bioreattore |
Riferimenti
- Hildinger, M., Auricchio, A. Advances in AAV-mediated gene transfer for the treatment of inherited disorders. European Journal of Human Genetics. 12 (4), 263-271 (2004).
- Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. Adeno-associated virus serotypes....
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Ristampe e permessi
