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Articolo metodologico

Costruzione di membrane lipidiche modello che incorporano recettori accoppiati alla proteina G (GPCR)

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⸱

DOI:

10.3791/62830

⸱

5 febbraio 2022

 ,  , 
1Mork Family Department of Chemical Engineering and Materials Science, University of Southern California

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo utilizza il gonfiore dell'agarosio come tecnica potente e generalizzabile per incorporare proteine di membrana integrali (PIM) in vescicole lipidiche unilamellari giganti (GUV), come descritto qui per la ricostituzione della proteina del recettore della serotonina 1A umana (5-HT1AR), una delle classi di recettori accoppiati a proteine G farmacologicamente importanti.

Abstract

Robuste indagini in vitro sulla struttura e la funzione delle proteine di membrana integrali sono state una sfida a causa delle complessità della membrana plasmatica e dei numerosi fattori che influenzano il comportamento delle proteine nelle cellule vive. Le vescicole unilamellari giganti (GUV) sono un sistema modello in vitro biomimetico e altamente sintonizzabile per studiare le interazioni proteina-membrana e sondare il comportamento proteico in modo preciso e dipendente dallo stimolo. In questo protocollo, presentiamo un metodo economico ed efficace per fabbricare GUV con il recettore umano della serotonina 1A (5-HT1AR) stabilmente integrato nella membrana. Fabbrichiamo GUV utilizzando un metodo di rigonfiamento dell'idrogel modificato; depositando un film lipidico sopra una miscela di agarosio e 5-HT1AR e quindi idratando l'intero sistema, si possono formare vescicole con 5-HT1AR opportunamente orientato e funzionale incorporato nella membrana. Questi GUV possono quindi essere utilizzati per esaminare le interazioni proteina-membrana e il comportamento di localizzazione tramite microscopia. In definitiva, questo protocollo può far progredire la nostra comprensione della funzionalità delle proteine di membrana integrali, fornendo una profonda comprensione fisiologica.

Introduzione

Le membrane modello sintetiche sono potenti strumenti nello studio delle proprietà e delle funzioni fondamentali delle biomembrane. Le vescicole unilamellari giganti (GUV) sono una delle piattaforme più importanti per studiare una varietà di proprietà della membrana plasmatica e possono essere progettate per imitare diverse condizioni fisiologiche1,2,3,4,5,6,7,8. È ben noto che la membrana plasmatica e la sua organizzazione svolgono un ruolo chiave in una moltitudine di processi cellulari, come la trasduzione del segnale, l'adesione, l'endocitosi e il trasporto9,10,11,12,13,14,15.

I GUV sono stati fabbricati utilizzando vari metodi, tra cui idratazione delicata16, gonfiore dell'idrogel17, elettroformazione18, tecniche microfluidiche19,20,21,22, jetting23 e scambio di solventi24,25,26. A causa delle difficoltà nella gestione delle proteine integrali di membrana (PIM), le piattaforme in vitro per studiarle sono state limitate. I GUV presentano una piattaforma semplificata per lo studio degli IMP in un ambiente che imita il loro ambiente nativo. Sebbene ci siano stati diversi approcci per la ricostituzione proteica nei GUV, le sfide derivano dall'incorporazione di proteine con il corretto orientamento e dal mantenimento della funzionalità proteica27.

La ricostituzione proteica di maggior successo nei GUV richiede il metodo di scambio del detergente; che comporta la solubilizzazione delle proteine dal loro ambiente nativo mediante detergenti, seguita dalla purificazione delle proteine, e quindi la sostituzione delle molecole detergenti con lipidi attraverso vari metodi28. Mentre i detergenti servono a stabilizzare la struttura terziaria degli PIM durante la purificazione, le micelle detergenti sono un ambiente relativamente innaturale per queste proteine, che sono meglio stabilizzate, in particolare per gli studi funzionali, in doppiostrati lipidici28,29,30. Inoltre, incorporare proteine transmembrana funzionali nel doppio strato lipidico utilizzando le tradizionali tecniche di fabbricazione GUV è stato difficile a causa delle dimensioni, della delicatezza di queste proteine e delle fasi aggiuntive di scambio di detergenti che sarebbero necessarie27,31,32,33. L'uso di solventi organici per rimuovere i detergenti provoca aggregazione proteica e denaturazione34. Un metodo migliorato mediato dal detergente è stato promettente, tuttavia, è necessaria cautela per la fase di rimozione del detergente e potrebbe essere necessaria un'ottimizzazione per proteine specifiche31,35. Inoltre, i metodi che utilizzano l'elettroformazione potrebbero limitare la scelta delle proteine e potrebbero non essere adatti a tutte le composizioni lipidiche, in particolare i lipidi caricati31,36,37. Un'altra tecnica che è stata utilizzata è la fusione indotta da peptidi di grandi vescicole unilamellari (LUV) contenenti la proteina desiderata con GUV, sebbene sia risultata laboriosa e possa portare all'inserimento di molecole estranee- i peptidi fusogenici33,38,39. Le vescicole giganti della membrana plasmatica (GPMV), che derivano da cellule viventi, possono essere utilizzate per superare alcuni di questi problemi, tuttavia consentono un controllo minimo della composizione lipidica e proteica risultante14,40,41. Pertanto, l'integrazione di PIM nello strato bilipidico dei GUV utilizzando il nostro metodo di gonfiore dell'agarosio modificato presenta un metodo affidabile per esaminare ulteriormente queste proteine nell'ambiente di membrana42,43,44,45.

La segnalazione e la comunicazione cellulare coinvolgono una famiglia di proteine note come recettori accoppiati alla proteina G (GPCR); I GPCR fanno parte della più grande famiglia di proteine e sono associati alla modulazione dell'umore, dell'appetito, della pressione sanguigna, della funzione cardiovascolare, della respirazione e del sonno tra molte altre funzioni fisiologiche46. In questo studio, abbiamo utilizzato il recettore umano della serotonina 1A (5-HT1AR) che è un membro prototipico della famiglia GPCR. 5-HT1AR può essere trovato nel sistema nervoso centrale (SNC) e nei vasi sanguigni; influenza numerose funzioni come le funzioni cardiovascolari, gastrointestinali, endocrine, oltre a partecipare alla regolazione dell'umore47. Una grande barriera alla ricerca GPCR deriva dalla loro complessa struttura anfifila e i GUV presentano una piattaforma promettente per lo studio di varie proprietà di interesse, che vanno dalla funzionalità proteica, alle interazioni lipidico-proteina e alle interazioni proteina-proteina. Vari approcci sono stati utilizzati per studiare le interazioni lipidico-proteina come la risonanza plasmonica di superficie (SPR)48,49, la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR)50,51, il saggio di sovrapposizione lipidica proteica (PLO)51,52,53,54, la spettrometria di massa nativa55, la calorimetria di titolazione isotermica (ITC)56,57 e il liposoma saggio di sedimentazione58,59. Il nostro laboratorio ha utilizzato l'approccio GUV semplificato per studiare l'effetto delle interazioni lipidico-proteina sulla funzionalità proteica incapsulando BODIPY-GTPγS, che si lega con la subunità Giα nello stato attivo del recettore. Il loro legame incanta il fluoroforo producendo un segnale di fluorescenza che potrebbe essere rilevato nel tempo45. Inoltre, vari studi hanno studiato le interazioni lipidico-proteina e il ruolo delle proteine nel rilevare o stabilizzare la curvatura della membrana60,61, e l'utilizzo di un approccio GUV fattibile potrebbe essere un vantaggio chiave.

Questo protocollo dimostra un metodo semplice per incorporare i GPCR nella membrana dei GUV utilizzando un sistema di idrogel di agarosio modificato17,42. Inoltre, sulla base del nostro lavoro precedente, il nostro metodo potrebbe essere adatto per i PIM che possono sopportare un'esposizione a breve termine a 30-40 °C. In breve, abbiamo diffuso un sottile film di agarosio combinato con frammenti di membrana contenenti il GPCR di interesse. Dopo la gelificazione di questo strato, depositiamo una soluzione lipidica sopra l'agarosio e lasciamo evaporare il solvente. La reidratazione del sistema è stata quindi eseguita con un tampone acquoso, con conseguente formazione di GUV con proteine incorporate nel doppio strato lipidico.

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Protocollo

1. Etichettatura delle proteine

  1. Consentire a NHS-Rhodamine, ai frammenti di membrana 5-HT1A e a una colonna di dissalazione di spin 7 K MWCO di equilibrarsi a temperatura ambiente.
  2. Sciogliere 1 mg di NHS-rodamina in 100 μL di dimetilsolfossido (DMSO).
  3. Aggiungere 5 μL di soluzione di bicarbonato di sodio 1 M per aumentare il pH della soluzione 5-HT1AR a pH 8.
  4. Aggiungere 3,66 μL della soluzione NHS-rodamina a 50 μL della soluzione 5-HT1AR e pipettare delicatamente su e giù in un tubo microcentrifugale.
    NOTA: Assicurarsi di avere almeno 10x eccesso molare di NHS-rodamina.
  5. Tenere la miscela al riparo dalla luce e mettere il rotatore a temperatura ambiente per 1 ora.
  6. Lavare una colonna di centrifuga MWCO da 7 k con 200 μL di 1x soluzione salina tampone fosfato (1x PBS) tre volte per 1,5 minuti a 1,5 RCF per ogni lavaggio.
  7. Aggiungere la proteina etichettata a una colonna e bilanciare la quantità in un altro tubo di microcentrifuga.
  8. Abbassare la proteina marcata una volta per 5 minuti a 1,5 RCF.
  9. Prendi uno spettro UV-vis usando uno spettrofotometro nanodrop a 280 nm e 554 nm e calcola l'efficienza di etichettatura seguendo il manuale del produttore.
  10. Conservare la proteina etichettata coperta a 5 °C fino a nuovo utilizzo. La soluzione è stabile per circa una settimana dopo l'etichettatura.

2. GUV con membrana incorporata 5-HT 1A

  1. Preparazione di materiali e reagenti
    1. Lasciare che le proteine, i lipidi e la BSA (albumina sierica bovina) si equilibrino a temperatura ambiente.
    2. Durante questo periodo, pulire i coperchi mettendoli in metanolo e sonicandoli per 30 minuti a 40 °C. Assicurarsi che il metanolo copra completamente i coperchi e che il livello dell'acqua nel bagno d'acqua sia superiore al livello del metanolo nel contenitore.
      NOTA: il metanolo è tossico e deve essere maneggiato in un cappuccio chimico appropriato.
    3. Asciugare il metanolo in eccesso sulle coperture con un leggero flusso d'aria. Posizionare il rack coverslip coperto in un forno a 40 °C per 15 minuti per assicurarsi che i coverslip in eccesso si asciughino.
    4. Iniziare il processo di pulizia al plasma. In primo luogo, posizionare i coperchi nel pulitore al plasma e chiudere la valvola di aspirazione dell'aria per evacuare tutta l'aria all'interno della camera.
    5. Una volta che la camera è sotto vuoto, pulire i coverslip per 5 minuti utilizzando l'impostazione di potenza RF elevata e un vuoto quasi completo, con solo una leggera presa d'aria nella camera a vuoto. Per garantire il corretto livello di plasma, regolare l'apertura della camera a vuoto in modo tale che il colore risultante del plasma sia un rosa costante e brillante.
      NOTA: È fondamentale quando si utilizza l'aria che il plasma rimanga di un colore rosa brillante per tutta la durata della fase di trattamento al plasma, poiché un colore viola più scuro indica che c'è una quantità impropria di aria nella camera e si tradurrà in un trattamento al plasma non ottimale.
    6. Una volta trascorsi i 5 minuti, spegnere l'alimentazione RF e rilasciare il vuoto.
      NOTA: Al momento della rimozione dalla camera al plasma, assicurarsi che i coperchi rimangano coperti.
  2. Preparazione idrogel
    1. Combinare 6 mg di agarosio a bassissima temperatura di fusione con 300 μL di acqua ultrapura (cioè 2% (p/v) di agarosio).
      NOTA: il 2% di agarosio sarà utilizzato per produrre GUV privi di proteine. La soluzione di agarosio può essere conservata a 45 °C per due giorni.
    2. Combinare 9 mg di agarosio a bassissima temperatura con 300 μL di acqua ultrapura per 3 p/v% di agarosio come preparato al punto 3.1. Il 3% di agarosio sarà utilizzato per produrre GUV incorporati in proteine.
    3. Ruotare brevemente la soluzione prima di posizionarla sul blocco termico a 90 °C per 10 minuti. Quindi, ruotare nuovamente il tubo prima di trasferirlo in un blocco di calore a 45 °C per mantenerlo nella forma fusa fino a un ulteriore utilizzo.
  3. Miscelazione di agarosio e proteine
    1. Mescolare 21 μL di agarosio al 3% con i 7 μL di frammenti di membrana 5-HT1AR. Pipettare su e giù lentamente molte volte per garantire un'adeguata miscelazione. Quindi, incubare a 45 °C per 1 min.
  4. Idrogel e deposizione lipidica
    1. Per i GUV privi di proteine: fare un film sottile su coperchi appena puliti al plasma usando 20 μL di agarosio al 2%. Lascia cadere rapidamente un altro coverslip sopra la goccia di agarosio e fai scorrere delicatamente i coverslips per creare un film sottile su entrambi i coverslip.
      NOTA: Questo passaggio è complicato in quanto lo scorrimento della goccia deve avvenire mentre l'agarosio è ancora nella forma fusa.
    2. Per i GUV incorporati in proteine: pipettare la miscela proteina/agarosio su e giù ancora una volta, quindi depositare 20 μL dell'agarosio al 2% su una coverslip pulita al plasma. Seguire le indicazioni di scorrimento come descritto sopra.
    3. Lasciare gelificare l'agarosio al riparo dalla luce per 30 minuti a temperatura ambiente.
    4. Depositare i lipidi a goccia sopra lo strato di agarosio. Utilizzare un totale di 10 μL di 2 mg/mL di 1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina (POPC) con 0,4 Mol% 1,2-Dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina (DPPE) etichettato con ATTO 488 (ATTO-488-DPPE) (o miscela lipidica di interesse) in cloroformio sopra il film di agarosio. Depositare le goccioline usando un ago per gascromatografia e distribuire una goccia alla volta attraverso un flusso d'aria delicato.
      NOTA: è necessaria cautela con questo passaggio per creare uno strato relativamente uniforme di lipidi sulla parte superiore dell'idrogel. Inoltre, il cloroformio è tossico e deve essere maneggiato in un cappuccio chimico appropriato.
    5. Assemblare le camere Sykes-Moore (S-M) posizionando un O-ring sopra il coperchio e quindi posizionando il componente superiore della camera sopra l'O-ring. Utilizzare la chiave fornita dal produttore per assemblare la camera avvitando i componenti della camera insieme per sigillare la camera e prevenire eventuali perdite.
      NOTA: la parte superiore della camera deve essere serrata sull'O-ring, ma è necessaria cautela per garantire che il coverslip rimanga intatto poiché il coverslip può rompersi se l'O-ring non si trova correttamente nella camera. Inoltre, assicurarsi che la camera sia sigillata abbastanza ermeticamente in modo che la camera non perda quando viene aggiunta la soluzione di gonfiore. Il mancato serraggio sufficiente della camera comporterà perdite e perdita di campione.
  5. Gonfiore e raccolta delle vescicole
    1. Idratare l'intero sistema pipettando delicatamente 450 μL di 200 mM di saccarosio in 1x PBS e picchiettando delicatamente le camere per garantire un'adeguata copertura tampone degli strati idrogel-lipidici.
      NOTA: La soluzione di saccarosio può essere sostituita con un tampone di reidratazione contenente sonde biologiche di interesse.
    2. Posizionare le camere a 45 °C e coprire la parte superiore della camera con un coperchio per evitare l'evaporazione. Lasciare che il campione si gonfi, al riparo da detriti e luce per 1 ora.
    3. Aggiungere 100 μL di 1 mg/mL di BSA in acqua ultrapura in ogni pozzetto di una piastra da 96 pozzetti destinata ad essere utilizzata. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
    4. Lavare tre volte con acqua ultrapura e una volta con 200 mM di saccarosio in 1x PBS.
    5. Infine, aggiungere 200 mM di glucosio in 1x PBS fino all'aggiunta della soluzione campione GUV.
      NOTA: BSA è stato utilizzato per bloccare l'adsorbimento GUV.
    6. Dopo aver lasciato che l'idrogel si gonfiasse, scuotere delicatamente e picchiettare la camera per rimuovere eventuali GUV che potrebbero rimanere attaccati alla superficie dell'idrogel. Quindi, pipettare con cura la soluzione GUV-saccarosio.
      NOTA: come passaggio opzionale per garantire che tutte le vescicole siano staccate dalla superficie, pipettare delicatamente parte della sospensione di saccarosio sulla superficie dell'idrogel.
    7. Spostare la sospensione in un tubo microcentrifuga precedentemente preparato contenente 700 μL di 200 mM di glucosio in 1x PBS.
      NOTA: Il gradiente di densità porterà all'assestamento delle vescicole sul fondo del tubo della centrifuga.
    8. Lasciare riposare le vescicole per un'altra ora per assicurarsi che le vescicole possano affondare sul fondo del tubo del microcentrifuga, consentendo una raccolta ottimale.
    9. Dopo la decantazione dei GUV in glucosio, trasferire 300 μL dal fondo del tubo della centrifuga (le vescicole stabilizzate) nella piastra a 96 pozzetti precedentemente preparata e trattata con BSA per esaminare le vescicole al microscopio confocale.
      NOTA: Assicurarsi di evitare il fondo del tubo di microcentrifuga per ridurre al minimo la quantità di detriti raccolti nel campione finale.
  6. Controllare i campioni al microscopio.
    1. Brillare un laser a 488 nm sul campione (che ci consente di visualizzare la membrana, poiché il doppio strato è stato etichettato con ATTO-488-DPPE).
    2. Brillare un laser a 561 nm sul campione (che ci permette di visualizzare la proteina, poiché è stata etichettata con NHS-Rhodamine).
      NOTA: è necessaria cautela durante l'imaging del campione poiché la fotoossidazione può destabilizzare le vescicole. Le vescicole sono state osservate lo stesso giorno.

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Figura 1: Illustrazione dei passaggi dettagliati del protocollo. Creato con BioRender.com Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Risultati

La concentrazione di proteine è stata misurata e il grado di etichettatura è stato calcolato come il rapporto molare tra il colorante e la proteina per essere 1: 1. Esaminando i GUV utilizzando la microscopia confocale, siamo stati in grado di confermare la formazione e l'integrazione proteica delle vescicole. I lipidi sono stati etichettati con 0,4 mol% ATTO 488-DPPE e la proteina è stata etichettata covalentemente tramite la modifica dell'estere NHS della rodamina delle ammine primarie. La Figura 2...

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Discussione

Abbiamo identificato due passaggi fondamentali per il successo del protocollo complessivo: il trattamento al plasma e la deposizione lipidica. La pulizia al plasma dei coverslip è essenziale per garantire che vi sia un'adeguata copertura e adesione dell'idrogel di agarosio al coperchio di vetro. La pulizia al plasma realizza due cose: in primo luogo, rimuove tracce di materia organica dalla superficie del vetro; in secondo luogo, attiva la superficie del coverslip, consentendo un aumento della bagnabilità all'aumentare d...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Ringraziamenti

Ringraziamo Matthew Blosser per la preziosa discussione e i consigli. Questo lavoro è stato sostenuto dall'Office of Naval Research (N00014-16-1-2382) e dalla National Science Foundation (PHY-1915017).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC)Avanti Polar Lipids, Alabastro, AL850375C-25mg
  Microscopio invertito TI-EclipseNikon, Melville, NYEclipse Ti
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (DPPC)Avanti Polar Lipids, Alabastro, AL850355C-25mg
13/16″ ID, 1″ O-ring in silicone ODSterling Seal & Alimentazione, Nettuno, IN5-003-8770
16-bit Cascade II 512 elettrone-moltiplicato carica accoppiata dispositivo fotocameraFotometria, Huntington Beach, CA Cascade II 512
1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina (POPC)Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL850457C-25mg
50 mW laser a stato solido a 488 nm e filtro di emissione centrato a 525 nm e 561 nm con filtro di emissione centrato a 595 nmCoherent, Santa Clara, CA488/561-50-LS
5-HT1AR frammenti di membranaPerkin Elmer, Waltham, MARBHS1AM400UA
ATTO-488-1,2-Dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina (DPPE)ATTO-TEC, Siegen, GermaniaAD 488-155
Detergente al plasma da bancoHarrick Plasma, Ithaca, NYPDC-32G
albumina sierica bovina (BSA)Sigma Aldrich, St. Louis, MOA9418
cloroformio (CHCl3)Millipore Sigma, Burlington, MACX1055
Colesterolo (Chol)Sigma Aldrich, St. Louis, MOC8667-5G
Corning 96-well Flat Clear Bottom Corning, Corning, NY3904
Elmasonic E-Series E15H UltrasonicElma, Singen, Germania[non più venduto sul sito web principale]
glucosioSigma Aldrich, St. Louis, MOG7528
metanolo (MeOH)Millipore Sigma, Burlington, MAMX0485
NanoDrop ND-1000Thermo Fisher Scientific, Waltham, MAND-1000
NHS-RhodamineThermo Fisher Scientific, Waltham, MA46406
soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (10x PBS)Corning, Corning, NY21-040
testa confocale CSUX a disco rotanteYokogawa, Tokyo, GiapponeCSU-X1
vetrini coprioggetti standard da 25 mm n. 1ChemGlass, Vineland, NJCLS-1760
saccarosioSigma Aldrich, St. Louis, MOS7903
Camere Sykes-MooreBellco, Vineland, NJ1943-11111
Temperatura di fusione ultra-bassa agarosioSigma Aldrich, St. Louis, MOA5030
VWR Analog HeatblockVWR International, Radnor, PA[non più venduto sul sito principale]
VWR Tube RotatorVWR International, Radnor, PA10136-084
Colonne di desalinizzazione Zeba Spin, 7K MWCO, 0,5 mLThermo Fisher Scientific, Waltham, MA89882

Riferimenti

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