Questo protocollo utilizza il gonfiore dell'agarosio come tecnica potente e generalizzabile per incorporare proteine di membrana integrali (PIM) in vescicole lipidiche unilamellari giganti (GUV), come descritto qui per la ricostituzione della proteina del recettore della serotonina 1A umana (5-HT1AR), una delle classi di recettori accoppiati a proteine G farmacologicamente importanti.
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Articolo metodologico
Costruzione di membrane lipidiche modello che incorporano recettori accoppiati alla proteina G (GPCR)
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Robuste indagini in vitro sulla struttura e la funzione delle proteine di membrana integrali sono state una sfida a causa delle complessità della membrana plasmatica e dei numerosi fattori che influenzano il comportamento delle proteine nelle cellule vive. Le vescicole unilamellari giganti (GUV) sono un sistema modello in vitro biomimetico e altamente sintonizzabile per studiare le interazioni proteina-membrana e sondare il comportamento proteico in modo preciso e dipendente dallo stimolo. In questo protocollo, presentiamo un metodo economico ed efficace per fabbricare GUV con il recettore umano della serotonina 1A (5-HT1AR) stabilmente integrato nella membrana. Fabbrichiamo GUV utilizzando un metodo di rigonfiamento dell'idrogel modificato; depositando un film lipidico sopra una miscela di agarosio e 5-HT1AR e quindi idratando l'intero sistema, si possono formare vescicole con 5-HT1AR opportunamente orientato e funzionale incorporato nella membrana. Questi GUV possono quindi essere utilizzati per esaminare le interazioni proteina-membrana e il comportamento di localizzazione tramite microscopia. In definitiva, questo protocollo può far progredire la nostra comprensione della funzionalità delle proteine di membrana integrali, fornendo una profonda comprensione fisiologica.
Introduzione
Le membrane modello sintetiche sono potenti strumenti nello studio delle proprietà e delle funzioni fondamentali delle biomembrane. Le vescicole unilamellari giganti (GUV) sono una delle piattaforme più importanti per studiare una varietà di proprietà della membrana plasmatica e possono essere progettate per imitare diverse condizioni fisiologiche1,2,3,4,5,6,7,8. È ben noto che la membrana plasmatica e l....
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Protocollo
1. Etichettatura delle proteine
- Consentire a NHS-Rhodamine, ai frammenti di membrana 5-HT1A e a una colonna di dissalazione di spin 7 K MWCO di equilibrarsi a temperatura ambiente.
- Sciogliere 1 mg di NHS-rodamina in 100 μL di dimetilsolfossido (DMSO).
- Aggiungere 5 μL di soluzione di bicarbonato di sodio 1 M per aumentare il pH della soluzione 5-HT1AR a pH 8.
- Aggiungere 3,66 μL della soluzione NHS-rodamina a 50 μL della soluzione 5-HT1AR e pipettare delicatamente su e giù in un tubo microcentrifugale.
NOTA: Assicurarsi di avere almeno 10x eccesso molare di NHS-rodamina. - Tenere la misc....
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Risultati
La concentrazione di proteine è stata misurata e il grado di etichettatura è stato calcolato come il rapporto molare tra il colorante e la proteina per essere 1: 1. Esaminando i GUV utilizzando la microscopia confocale, siamo stati in grado di confermare la formazione e l'integrazione proteica delle vescicole. I lipidi sono stati etichettati con 0,4 mol% ATTO 488-DPPE e la proteina è stata etichettata covalentemente tramite la modifica dell'estere NHS della rodamina delle ammine primarie. La Figura 2.......
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Discussione
Abbiamo identificato due passaggi fondamentali per il successo del protocollo complessivo: il trattamento al plasma e la deposizione lipidica. La pulizia al plasma dei coverslip è essenziale per garantire che vi sia un'adeguata copertura e adesione dell'idrogel di agarosio al coperchio di vetro. La pulizia al plasma realizza due cose: in primo luogo, rimuove tracce di materia organica dalla superficie del vetro; in secondo luogo, attiva la superficie del coverslip, consentendo un aumento della bagnabilità all'aumentare d.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Matthew Blosser per la preziosa discussione e i consigli. Questo lavoro è stato sostenuto dall'Office of Naval Research (N00014-16-1-2382) e dalla National Science Foundation (PHY-1915017).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) | Avanti Polar Lipids, Alabastro, AL | 850375C-25mg | |
| Microscopio invertito TI-Eclipse | Nikon, Melville, NY | Eclipse Ti | |
| 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (DPPC) | Avanti Polar Lipids, Alabastro, AL | 850355C-25mg | |
| 13/16″ ID, 1″ O-ring in silicone OD | Sterling Seal & Alimentazione, Nettuno, IN | 5-003-8770 | |
| 16-bit Cascade II 512 elettrone-moltiplicato carica accoppiata dispositivo fotocamera | Fotometria, Huntington Beach, CA | Cascade II 512 | |
| 1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina (POPC) | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850457C-25mg | |
| 50 mW laser a stato solido a 488 nm e filtro di emissione centrato a 525 nm e 561 nm con filtro di emissione centrato a 595 nm | Coherent, Santa Clara, CA | 488/561-50-LS | |
| 5-HT1AR frammenti di membrana | Perkin Elmer, Waltham, MA | RBHS1AM400UA | |
| ATTO-488-1,2-Dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina (DPPE) | ATTO-TEC, Siegen, Germania | AD 488-155 | |
| Detergente al plasma da banco | Harrick Plasma, Ithaca, NY | PDC-32G | |
| albumina sierica bovina (BSA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | A9418 | |
| cloroformio (CHCl3) | Millipore Sigma, Burlington, MA | CX1055 | |
| Colesterolo (Chol) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | C8667-5G | |
| Corning 96-well Flat Clear Bottom Corning | , Corning, NY | 3904 | |
| Elmasonic E-Series E15H Ultrasonic | Elma, Singen, Germania | [non più venduto sul sito web principale] | |
| glucosio | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | G7528 | |
| metanolo (MeOH) | Millipore Sigma, Burlington, MA | MX0485 | |
| NanoDrop ND-1000 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | ND-1000 | |
| NHS-Rhodamine | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 46406 | |
| soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (10x PBS) | Corning, Corning, NY | 21-040 | |
| testa confocale CSUX a disco rotante | Yokogawa, Tokyo, Giappone | CSU-X1 | |
| vetrini coprioggetti standard da 25 mm n. 1 | ChemGlass, Vineland, NJ | CLS-1760 | |
| saccarosio | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | S7903 | |
| Camere Sykes-Moore | Bellco, Vineland, NJ | 1943-11111 | |
| Temperatura di fusione ultra-bassa agarosio | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | A5030 | |
| VWR Analog Heatblock | VWR International, Radnor, PA | [non più venduto sul sito principale] | |
| VWR Tube Rotator | VWR International, Radnor, PA | 10136-084 | |
| Colonne di desalinizzazione Zeba Spin, 7K MWCO, 0,5 mL | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 89882 |
Riferimenti
- Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Comparative properties and methods of preparation of lipid vesicles (liposomes). Annual Review of Biophysics and Bioengineering. 9, 467-508 (1980).
- Mouritsen, O. G. Model answers to lipid membrane q....
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Ristampe e permessi
