Articolo metodologico

Metodo sandwich a membrana a due strati per la raccolta della saliva di Laodelphax striatellus

DOI:

10.3791/62831

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27 agosto 2021

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1State Key Laboratory of Plant Genomics, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 2National Plant Gene Research Center, 3University of the Chinese Academy of Sciences

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il presente protocollo descrive un metodo per raccogliere una quantità sufficiente di saliva dagli insetti che succhiano il piercing usando un mezzo artificiale. Questo è un metodo conveniente per raccogliere la saliva degli insetti e studiare la funzione salivare sul comportamento di alimentazione degli insetti e sulla trasmissione del virus trasmesso da vettori.

Abstract

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Il virus della striscia di riso (RSV), che causa una significativa perdita economica dell'agricoltura in Asia orientale, dipende interamente dagli insetti vettori per la sua efficace trasmissione tra il riso ospite. Laodelphax striatellus (piccola planthopper marrone, SBPH) è il principale insetto vettore che trasmette orizzontalmente RSV mentre succhia la linfa dal floema. La saliva svolge un ruolo significativo nel comportamento alimentare degli insetti. Un metodo conveniente che sarà utile per la ricerca sulla saliva degli insetti con comportamento alimentare piercing-sucking è descritto qui. In questo metodo, agli insetti è stato permesso di nutrirsi di una dieta artificiale inserita tra due strati di film di paraffina allungati. La dieta contenente la saliva è stata raccolta ogni giorno, filtrata e concentrata per ulteriori analisi. Infine, la qualità della saliva raccolta è stata esaminata mediante colorazione proteica e immunoblotting. Questo metodo è stato esemplificato rilevando la presenza di RSV e di una proteina simile alla mucina nella saliva di SBPH. Questi metodi di alimentazione artificiale e di raccolta della saliva getteranno le basi per ulteriori ricerche sui fattori nella saliva degli insetti legati al comportamento alimentare e alla trasmissione del virus.

Introduzione

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Il virus della striscia di riso (RSV), un virus a RNA a filamento negativo nel genere Tenuivirus,causa gravi malattie nella produzione di riso in Asia orientale1,2,3. La trasmissione di RSV da piante di riso infette a quelle sane dipende da insetti vettori, principalmente Laodelphax striatellus, che trasmette RSV in modo persistente-propagativo. SBPH acquisisce il virus dopo essersi nutrito di piante infette da RSV. Una volta all'interno dell'insetto, RSV infetta la cellula epiteliale dell'intestino medio un giorno dopo l'alimentazione e poi passa attraverso la barriera dell'intestino medio per penetrare nell'emolinfa. Successivamente, RSV si diffonde in diversi tessuti attraverso l'emolinfa e poi si propaga. Dopo un periodo latente di circa 10-14 giorni dopo l'acquisizione, il virus all'interno della ghiandola salivare può essere trasmesso alle piante ospiti sane attraverso la saliva secreta mentre SBPH succhia la linfa dal floema4,5,6,7,8,9,10 . Un processo di alimentazione efficiente e vari fattori nella saliva sono essenziali per la diffusione di RSV dall'insetto alla pianta ospite.

Si ritiene che la saliva degli insetti secreta dalle ghiandole salivari mediti insetti, virus e piante ospiti. Gli insetti emitteri di solito producono due tipi di saliva: saliva gelificante e saliva acquosa11,12,13. La saliva gelificante è principalmente secreta nell'apoplasma per sostenere il movimento dello stylet tra le cellule ospiti ed è anche correlata al superamento della resistenza delle piante e delle risposte immunitarie14,15,16,17. Nella fase di sondaggio dell'alimentazione, gli insetti secernono a intermittenza saliva gelificante che viene immediatamente ossidata per formare una flangia superficiale. Quindi, guaine singole o ramificate racchiudono lo stylet per riservare un canale tubolare18,19,20. Si presume che la flangia superficiale sull'epidermide faciliti la penetrazione dello stylet fungendo da punto di ancoraggio, mentre le guaine attorno allo stylet possono fornire stabilità meccanica e lubrificazione16,21,22,23. Nlshp è stato identificato come una proteina essenziale per la formazione della guaina salivare e l'alimentazione di successo della ceppa marrone (Nilaparvata lugens, BPH). L'inibizione dell'espressione della proteina guaina strutturale (SHP) secreta dall'afide Acyrthosiphon pisum ha ridotto la sua riproduzione interrompendo l'alimentazione dai tubi del setaccio ospite24. Inoltre, in alcune specie di insetti, si suppone che i fattori della saliva gel inneschino le risposte immunitarie delle piante formando i cosiddetti modelli molecolari associati agli erbivori (HAMPs). In N. lugens,NlMLP, una proteina simile alla mucina correlata alla formazione di guaina, induce difese vegetali contro l'alimentazione, tra cui la morte cellulare, l'espressione di geni legati alla difesa e la deposizione di callosio 25,26. Inoltre, alcuni fattori di saliva gel negli afidi hanno dimostrato di innescare risposte di difesa delle piante attraverso interazioni gene-to-gene simili ai modelli molecolari associati ai patogeni12,15,27.

Per studiare i fattori salivari essenziali per l'alimentazione degli insetti e/o la trasmissione di agenti patogeni, è necessario analizzare la saliva secreta. Qui, l'alimentazione artificiale e i metodi di raccolta per ottenere quantità sufficienti di saliva sono descritti per ulteriori analisi. Utilizzando un mezzo contenente un solo elemento nutrizionale, molte proteine della saliva sono state raccolte e analizzate mediante colorazione dell'argento e western blotting. Questo metodo sarà utile in ulteriori ricerche sui fattori nella saliva che sono essenziali per la trasmissione di RSV da parte di SBPH.

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Protocollo

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1. Manutenzione SBPH

  1. Allevare gli individui SBPH virulifero e privi di RSV in un incubatore di vetro (65 x 200 mm) con 5-6 piantine di riso(Oryza sativa cv. Nipponbare) per camera di vetro in laboratorio. Coltivare le piante di riso a 25 °C sotto un fotoperiodo luminoso di 16 ore / 8 ore di buio.
    NOTA: Gli individui SBPH viruliferosi e privi di RSV sono stati inizialmente catturati nella provincia di Jiangsu, in Cina.
  2. Rileva l'RSV in SBPH mediante un saggio immunoassorbinte legato a punti enzimatici (dot-ELISA) con un anticorpo policlonale RSV specifico per coniglio (vedi Tabella dei materiali)sollevato contro le ribonucleoproteine RSV (RNP).
    NOTA: Per garantire un'elevata efficienza dell'infezione della prole, le femmine virulifere sono state mantenute separatamente e il 15% della loro prole è stato testato in modo casuale per l'infezione da RSV. I dettagli di dot-ELISA sono descritti nei passaggi 1.3-1.7.
  3. Omogeneizzare un singolo SBPH in 20 μL di tampone di rivestimento (0,05 M Na2CO3-NaHCO3, pH 9,5). Individuare 3 μL di ciascuno su membrana di nylon (vedere Tabella dei materiali), quindi asciugare la membrana a temperatura ambiente (RT).
  4. Incubare la membrana con 15 mL di tampone bloccante (PBS + 3% di latte scremato) per 30 minuti a temperatura ambiente.
  5. Incubare la membrana con anticorpi primari diluiti contro RSV (1:10000) in 15 mL di PBS per 1 ora a RT e lavare la membrana tre volte con PBS per 5 minuti di incubazione ogni volta.
  6. Incubare la membrana con 1,5 μL di anticorpi anti-coniglio coniugati con perossidasi di rafano (vedi Tabella dei materiali)in 15 mL di PBS e lavare tre volte con PBS per 5 minuti di incubazione ogni volta.
  7. Sviluppare gli immunoblot con Enhanced HRP-DAB Chromogenic Kit (vedi Tabella dei Materiali)secondo i protocolli forniti dal produttore.

2. Preparazione della camera di alimentazione e dieta artificiale

  1. Pesare 2 g di saccarosio in polvere e scioglierlo in 40 ml di ddH2O per preparare la soluzione acquosa al 5% di saccarosio come dieta artificiale.
  2. Filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,22 μm (vedi Tabella dei materiali)per rimuovere la contaminazione batterica e le impurità.
  3. Affamate 200 3°-5° larve SBPH per 3-5 ore prima di introdurle nella camera.
    NOTA: 200 SBPH sono preparati per una camera; più SBPH dovrebbe essere preparato per diverse camere.
  4. Preparare i cilindri di vetro come camere di alimentazione (Figura 1A). Coprire un'estremità aperta della camera con una membrana di paraffina (vedi Tabella dei materiali)prima di introdurre gli insetti sperimentali.
    NOTA: Ogni cilindro è lungo 15,0 cm e ha un diametro di 2,5 cm. Questi cilindri in vetro sono realizzati su misura in base alle esigenze sperimentali.
  5. Trasferisci gli insetti in un cilindro di vetro.
  6. Coprire l'altra estremità della camera con membrana di paraffina allungata (in particolare, Parafilm M). Quindi, aggiungi 200 μL di dieta artificiale ad esso. Infine, coprire il liquido con un altro strato di membrana di paraffina allungata.
    NOTA: La membrana di paraffina è allungata a circa il doppio della sua area originale.
  7. Coprire la camera con un foglio di alluminio, ma lasciare la fine con il dispositivo dietetico artificiale esposto alla luce.

3. Raccolta della saliva SBPH

  1. Raccogliere la dieta artificiale da SBPH senza RSV e viruliferoso separatamente alla fine del periodo di 24 ore.
  2. Raffreddare il cilindro a 4 °C per immobilizzare gli insetti.
  3. Scoprire il film esterno e raccogliere il liquido dietetico artificiale utilizzando una pipetta sterile in tubi sterili da 1,5 ml. Mantenere la saliva raccolta a -80 °C fino all'analisi.
    NOTA: La saliva raccolta potrebbe essere conservata a -80 °C per 1 anno.
  4. Risciacquare la membrana interna con 50 μL di dieta artificiale fresca tre volte pipettando delicatamente e raccogliere la dieta di lavaggio artificiale come descritto nel passaggio 3.3. Posizionare la nuova dieta artificiale sulla membrana interna e mantenere una membrana di paraffina appena tesa sulla parte superiore.
  5. Ripetere i passaggi 3.2 e 3.3 per 5 giorni a 2 settimane.
    NOTA: Contare il tasso di sopravvivenza dell'alimentazione artificiale SBPH e garantire un supplemento sufficiente di SBPH fresco in base al tasso di sopravvivenza.
  6. Filtrare i campioni raccolti attraverso un'unità filtrante da 0,22 μm per rimuovere microbi e altri contaminanti.

4. Concentrazione della saliva raccolta

  1. Trasferire i campioni di saliva raccolti in un filtro centrifugo da 0,5 mL 10 kD (vedi Tabella dei materiali)e ruotare a 5.500 x g a 4 °C per 20 minuti. Raccogliere il surnatante e portare il volume finale a 100 μL.
  2. Misurare la concentrazione della saliva raccolta utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis appropriato seguendo i passaggi 4.3-4.6.
  3. Accendere lo spettrofotometro e lavare i piedistalli tre volte con ddH2O.
  4. Selezionare le seguenti opzioni sullo schermo nell'ordine corretto: Proteine | Proteina A280 | Seleziona Tipo | 1 Abs = 1 mg/mL. Quindi, selezionare la casella di controllo Correzione baseline 340 nm.
  5. Caricare 2 μL di soluzione acquosa di saccarosio al 5% come vuoto, toccare Blank nella parte inferiore dello schermo.
  6. Dopo aver impostato gli standard, caricare 2 μL della saliva raccolta per la misurazione. Leggere e registrare la concentrazione proteica.
    NOTA: 1 mg di proteine della saliva sono stati finalmente raccolti in totale almeno.

5. Colorazione dell'argento delle proteine della saliva

  1. Estrarre proteine dai campioni di saliva degli insetti utilizzando il tampone di carico del campione (50 mM Tris-HCl pH 6,8, 10% glicerolo, 2% SDS, 0,1% blu bromofenolo e 1% β-mercaptoetanolo). Quindi, frazionarlo del 10% SDS-PAGE (vedi Tabella dei materiali). Caricare la soluzione saccarosaque al 5% trattata allo stesso modo di un controllo negativo.
  2. Caricare un'aliquota di 20 μL del campione su un gel SDS-PAGE insieme a un marcatore prestained. Eseguire il gel per 15 minuti a 90 Volt e poi 50 minuti a 140 Volt.
  3. Fissare il gel in etanolo al 30% (vol/vol), al 10% (vol/vol) di acido acetico per almeno 30 minuti dopo l'elettroforesi.
  4. Risciacquare il gel due volte con etanolo al 20% (vol/vol) e acqua separatamente per 10 minuti ogni volta.
  5. Sensibilizzare il gel in 0,8 mM di tiosolfato di sodio per 1 minuto, quindi risciacquare due volte in acqua per 1 minuto ogni volta.
  6. Immergere il gel in 12 mM di nitrato d'argento per almeno 1 ora, quindi immergerlo in acqua deionizzata per 10 s prima di trasferirlo alla soluzione dello sviluppatore.
  7. Quando lo sfondo del gel si sta oscurando, immergere il gel in una soluzione di arresto (acido acetico al 5%) per almeno 30 minuti per interrompere la reazione.
  8. Lavare il gel due volte con acqua per 30 minuti ogni volta. Sviluppare l'immagine con il Sistema di Rilevamento (vedi Tabella dei Materiali).

6. Rilevamento delle proteine mediante western blotting

  1. Rileva la proteina simile alla mucina della saliva di SBPH (LssgMP) e RSV da western blots usando anticorpi specifici, rispettivamente.
  2. Trattare i campioni di saliva degli insetti seguendo il passaggio 5.1.
  3. Caricare un'aliquota di 20 μL del campione su un gel SDS-PAGE al 10% insieme a un marcatore prestained e un campione di saliva non infetta RSV da 20 μL come controllo negativo. Eseguire il gel per 15 minuti a 90 Volt e poi per 50 minuti a 140 Volt.
  4. Mescolare 100 mL di tampone di trasferimento proteico 10x (umido) (vedere Tabella dei materiali)con 900 mL di ddH 2 O in unasoluzionedi lavoro (1x), quindi trasferire le proteine a una membrana di polivinilidene difluoruro utilizzando il tampone di trasferimento proteico (1x).
  5. Bloccare la membrana in latte scremato al 5% con soluzione salina tamponata Tris da 0,01 M con Tween 20 (TBST) allo 0,05% a temperatura ambiente (RT) per 1 ora.
    NOTA: In questo protocollo, mescolare 100 mL di 10x TBST (vedi Tabella dei materiali)con 900 mL di ddH 2 O nellasoluzionedi lavoro.
  6. Incubare la membrana con anticorpi primari di coniglio contro RSV o LssgMP (entrambi 1:10000) diluiti in TBST a RT per almeno 2 ore.
    NOTA: La produzione di anticorpi primari contro RSV è stata menzionata sopra. Un'azienda biotecnologica ha prodotto l'anticorpo policlonale anti-LssgMP del coniglio contro il peptide LssgMP GIQFDSYSASDLTRC.
  7. Lavare la membrana tre volte con TBST per 10 minuti di incubazione ogni volta.
  8. Incubare la membrana con anticorpi anti-coniglio coniugati con perossidasi di rafano diluiti in 1:10000 TBST.
  9. Sviluppare gli immunoblot con il sistema di rilevamento Western Blotting a chemiluminescenza potenziato.

7. Rilevamento del modello di espressione LssgMP in SBPH

  1. Immobilizzare gli insetti a 4 °C per 5 min.
  2. Lavare gli insetti con etanolo al 75% e ddH2O uno per uno, quindi sezionare gli insetti in TBS pre-refrigerato (0,01 M soluzione salina tamponata con Tris).
  3. Sezionare gli insetti dall'addome mentre si tagliano le zampe anteriori di SBPH nell'articolazione coxa-trocantere con una pinza; lavare il midgut e le ghiandole salivari due volte in TBS per rimuovere qualsiasi contaminazione dall'emolinfa.
  4. Metti cinque tessuti in un tubo privo di RNasi da 1,5 ml per estrarre l'RNA. Considerare ogni provetta come un campione.
  5. Eseguire l'estrazione dell'RNA secondo i protocolli del produttore e la PCR trascrizionale inversa (RT-PCR) (vedi Tabella dei materiali).
  6. Eseguire la PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR) per indagare i relativi livelli di espressione del trascritto di LssgMP in estratti di tutto il corpo o vari tessuti di L. striatellus.
    NOTA: Le coppie di primer utilizzate per l'amplificazione genica erano LssgMP-q-F /LssgMP-q-R, la qPCR basata su SYBR Green è stata eseguita secondo il protocollo del produttore. Il livello di trascrizione del fattore di allungamento della traslazione di L. striatellus 2 (ef2) è stato quantificato con la coppia di primer ef2-q-F/ef2-q-R per la normalizzazione dei modelli di cDNA. E le sequenze di primer sono allegate di seguito:LssgMP-q-F: TCCGACCTCACCAGAGTTTACAG; LssgMP-q-R: GCTTCGTCCCAGGTACTGATTCC; ef2-q-F: GTCTCCACGGATGGGCTTT; ef2-q-R: ATCTTGAATTTCTCGGCATACATTT.

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Risultati

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Schemi di installazione di alimentazione artificiale e raccolta della saliva
La figura 1A raffigura il cilindro di vetro (15 cm x 2,5 cm) utilizzato come camera di alimentazione per raccogliere la saliva. In primo luogo, le larve SBPH sono state affamate per diverse ore per migliorare l'efficienza di raccolta e poi immobilizzate raffreddando per 5 minuti. Dopo che gli insetti sono stati trasferiti nel cilindro di vetro, entrambe le estremità aperte della camera sono state...

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Discussione

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Il successo dell'allevamento di insetti con diete artificiali è stato segnalato per la prima volta nel 1962 quando Mittler e Dadd hanno descritto la tecnica della membrana di paraffina per tenere una dieta artificiale29,30. E questo metodo è stato esplorato in molti aspetti della biologia e del comportamento degli insetti, ad esempio l'integrazione di nutrienti, l'alimentazione di dsRNA e l'acquisizione di virus. Sulla base dei requisiti dell'analisi della saliva...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Key Research and Development Program of China (n. 2019YFC1200503), dalla National Science Foundation of China (n. 32072385) e dalla Youth Innovation Promotion Association CAS (2021084).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Filtro centrifugo 10-KDMerck MilliporeR5PA83496Per la concentrazione
10x Tampone di trasferimento proteico (umido)macGENEMP008Tampone di trasferimento per western blotting
10x tampone TBSTCoolaberSL1328-500mL&volte; 10Wash Buffer per western blotting
Azure c600 biosystemsAzure BiosystemsAzure c600Sistema di imaging per western blotting e colorazione con argento
Scala proteica prestained a coloriGenStarM221-01Marcatore proteico per western blotting
ECL  reagenti per la rilevazione del western blottingGE HealthcareRPN2209rilevazione del western blotting
cromogenico HRP-DAB potenziatoTIANGENReazione cromogenica
Anticorpi anti-coniglio coniugati con perossidasi di rafanoSigma401393-2MLAnticorpo secondario policlonale per western blotting
Immobilon(R)-P Membrana polivinilide difluoruroMerck Membranadi trasferimento IPVH00010per western blotting
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad1725125Per PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR)
KIT,iSCRIPT cDNA SYNTHESBio-Rad1708891Per PCR trascrizionale inversa (RT-PCR)
Filtro Millex-GP, 0,22 e micro; mMerck MilliporeSLGP033RBPer filtrazione
Mini-PROTEAB TGX GelBio-Rad4561043Per SDS-PAGE
NanoDrop OneThermo ScientificND-ONEC-WRilevamento della concentrazione di proteine
Membrana in nylonPALLT42754Membrana per dot-ELISA
Parafilm M MembranaSigmaP7793-1EAProduzione di dieta artificiale sandwich
Anticorpo policlonale anti-LssgMP di coniglio contro i peptidi LssgMPGenstriptAnticorpo policlonale primario anti-LssgMP di coniglio per western blotting
Anticorpo policlonale anti-RSV di coniglioGenstriptAnticorpo policlonale primario anti-RSV di coniglio per western blotting e microkit puro dot-ELISA
RNAprepTIANGENDP420per l'estrazione dell'RNA
Kit cromogenico per la Kit#PA110 Millipore

Riferimenti

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