Software di acquisizione dati intuitivo, ad alta produttività e completamente automatizzato per microscopia crioelettronica a particella singola

Summary

La microscopia crioelettronica a singola particella richiede un pacchetto software adatto e una pipeline user-friendly per l'acquisizione automatica dei dati ad alto rendimento. Qui presentiamo l'applicazione di un pacchetto software di acquisizione di immagini completamente automatizzato, Latitude-S, e una pratica pipeline per la raccolta di dati di biomolecole vetrificate in condizioni a basso dosaggio.

Abstract

Negli ultimi anni, i progressi tecnologici e metodologici nella microscopia crioelettronica a singola particella (cryo-EM) hanno aperto una nuova strada per la determinazione della struttura ad alta risoluzione delle macromolecole biologiche. Nonostante i notevoli progressi nella crio-EM, c'è ancora spazio per miglioramenti in vari aspetti del flusso di lavoro di analisi delle singole particelle. L'analisi a singola particella richiede un pacchetto software adatto per l'acquisizione automatica dei dati ad alta produttività. Negli ultimi otto anni sono stati sviluppati diversi pacchetti software di acquisizione automatica dei dati per l'imaging automatico per la crio-EM a singola particella. Questo documento presenta un'applicazione di una pipeline di acquisizione di immagini completamente automatizzata per biomolecole vetrificate in condizioni a basso dosaggio.

Dimostra un pacchetto software in grado di raccogliere dati crio-EM in modo completo, automatico e preciso. Inoltre, vari parametri microscopici sono facilmente controllabili da questo pacchetto software. Questo protocollo dimostra il potenziale di questo pacchetto software nell'imaging automatizzato della proteina spike della sindrome respiratoria acuta grave-coronavirus 2 (SARS-CoV-2) con un microscopio crioelettronico da 200 keV dotato di un rilevatore di elettroni diretti (DED). Circa 3.000 immagini di film crio-EM sono state acquisite in una singola sessione (48 ore) di raccolta dati, producendo una struttura a risoluzione atomica della proteina spike di SARS-CoV-2. Inoltre, questo studio strutturale indica che la proteina spike adotta due conformazioni principali, 1-RBD (dominio di legame del recettore) in alto aperto e tutte le conformazioni RBD giù chiuse.

Introduction

La crio-EM a singola particella è diventata una tecnica di biologia strutturale tradizionale per la determinazione della struttura ad alta risoluzione delle macromolecole ^biologiche1. La ricostruzione di singole particelle dipende dall'acquisizione di un vasto numero di micrografie di campioni vetrificati per estrarre immagini di particelle bidimensionali (2D), che vengono poi utilizzate per ricostruire una struttura tridimensionale (3D) di una macromolecola ^biologica2,3. Prima dello sviluppo dei DED, la risoluzione ottenuta dalla ricostruzione di singole particelle variava tra 4 e 30 <....

Protocol

NOTA: per la raccolta dei dati crio-EM sono necessari tre passaggi importanti: 1. preparazione della griglia crio-EM, 2. calibrazione e allineamento del microscopio, 3. raccolta automatica dei dati (Figura 1). Inoltre, la raccolta automatizzata dei dati è suddivisa in a. selezione dell'area adatta, b. ottimizzazione di Latitude-S, c. avvio della selezione automatica dei fori e d. avvio automatico dell'acquisizione automatica dei dati (Figura 1).

1. Preparazione della griglia Cryo-EM e caricamento dei campioni per l'acquisizione automatica dei dati

1. Pulire le griglie utiliz....

Results

Nell'attuale situazione pandemica, la crio-EM svolge un ruolo chiave nel caratterizzare le strutture di varie proteine da SARS-CoV-226,27,28,29, che possono aiutare a sviluppare vaccini e farmaci contro il virus. Vi è un urgente bisogno di sforzi di ricerca rapidi con risorse umane limitate per combattere la malattia da coronavirus del 2019. L'acquisizione dei dati nella crio-EM a singola parti.......

Discussion

Latitude-S è un'interfaccia utente intuitiva, che fornisce un ambiente per configurare e raccogliere automaticamente migliaia di micrografie ad alta risoluzione o file di filmati in due giorni. Fornisce una facile navigazione attraverso le griglie e mantiene la posizione dello stadio del microscopio mentre passa da un basso ingrandimento ad un ingrandimento elevato. Ogni fase dell'acquisizione dei dati con Latitude-S è efficiente in termini di tempo, con funzionalità come una semplice interfaccia utente, uno streaming ra.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carta assorbente	Ted Pella, INC.	47000-100	Articolo per la preparazione dei campioni EM
Capsula	Thermo Fisher Scientific	9432 909 97591	Unità per la preparazione dei campioni EM
Cassetta	Thermo Fisher Scientific	1020863	Unità per la preparazione dei campioni EM
C-Clip Thermo	Fisher Scientific	1036171	Articolo per la preparazione dei campioni EM Strumento
l'inserimento della clip	C Thermo Fisher Scientific	9432 909 97571	Strumento per la preparazione dei campioni EM
C-Clip Ring	Thermo Fisher Scientific	1036173	Articolo per la preparazione dei campioni EM
Griglia EM (Quantifoil)	Microscopia elettronica Scienze	Q3100AR1.3	R 1.2/1.3 300 Mesh, Macchina
la scarica del bagliore	dell'oro Quorum	N/A	Quorum Macchina per la scarica del bagliore GlowQube
K2 DED	Gatan Inc.	N/A	Dispositivo di raccolta dati Cryo-EM (fotocamera)
Latitude S Software	Gatan Inc.		Software di imaging
Stazione di carico	Thermo Fisher Scientific	1130698	Unità di preparazione dei campioni EM
Talos 200 kV Arctica	Thermo Scientific™	N/A	Microscopio crioelettronico
Vitrobot Mark IV	Thermo Fisher Scientific	N/A	Unità di preparazione dei campioni EM