Method Article

Software di acquisizione dati intuitivo, ad alta produttività e completamente automatizzato per microscopia crioelettronica a particella singola

DOI:

10.3791/62832

⸱

July 29th, 2021

 ,  ,  , 
1Molecular Biophysics Unit, Indian Institute of Science, 2Gatan Inc.

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La microscopia crioelettronica a singola particella richiede un pacchetto software adatto e una pipeline user-friendly per l'acquisizione automatica dei dati ad alto rendimento. Qui presentiamo l'applicazione di un pacchetto software di acquisizione di immagini completamente automatizzato, Latitude-S, e una pratica pipeline per la raccolta di dati di biomolecole vetrificate in condizioni a basso dosaggio.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Negli ultimi anni, i progressi tecnologici e metodologici nella microscopia crioelettronica a singola particella (cryo-EM) hanno aperto una nuova strada per la determinazione della struttura ad alta risoluzione delle macromolecole biologiche. Nonostante i notevoli progressi nella crio-EM, c'è ancora spazio per miglioramenti in vari aspetti del flusso di lavoro di analisi delle singole particelle. L'analisi a singola particella richiede un pacchetto software adatto per l'acquisizione automatica dei dati ad alta produttività. Negli ultimi otto anni sono stati sviluppati diversi pacchetti software di acquisizione automatica dei dati per l'imaging automatico per la crio-EM a singola particella. Questo documento presenta un'applicazione di una pipeline di acquisizione di immagini completamente automatizzata per biomolecole vetrificate in condizioni a basso dosaggio.

Dimostra un pacchetto software in grado di raccogliere dati crio-EM in modo completo, automatico e preciso. Inoltre, vari parametri microscopici sono facilmente controllabili da questo pacchetto software. Questo protocollo dimostra il potenziale di questo pacchetto software nell'imaging automatizzato della proteina spike della sindrome respiratoria acuta grave-coronavirus 2 (SARS-CoV-2) con un microscopio crioelettronico da 200 keV dotato di un rilevatore di elettroni diretti (DED). Circa 3.000 immagini di film crio-EM sono state acquisite in una singola sessione (48 ore) di raccolta dati, producendo una struttura a risoluzione atomica della proteina spike di SARS-CoV-2. Inoltre, questo studio strutturale indica che la proteina spike adotta due conformazioni principali, 1-RBD (dominio di legame del recettore) in alto aperto e tutte le conformazioni RBD giù chiuse.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La crio-EM a singola particella è diventata una tecnica di biologia strutturale tradizionale per la determinazione della struttura ad alta risoluzione delle macromolecole biologiche1. La ricostruzione di singole particelle dipende dall'acquisizione di un vasto numero di micrografie di campioni vetrificati per estrarre immagini di particelle bidimensionali (2D), che vengono poi utilizzate per ricostruire una struttura tridimensionale (3D) di una macromolecola biologica2,3. Prima dello sviluppo dei DED, la risoluzione ottenuta dalla ricostruzione di singole particelle variava tra 4 e 30 Å4,5. Recentemente, la risoluzione raggiungibile dalla crio-EM a singola particella ha raggiunto oltre 1,8 Å6. Il DED e il software di acquisizione dati automatizzato hanno contribuito in modo determinante a questa rivoluzione della risoluzione7, in cui l'intervento umano per la raccolta dei dati è minimo. Generalmente, l'imaging crio-EM viene eseguito a basse dosi di elettroni (20-100 e / Å2) per ridurre al minimo il danno da radiazioni indotto dal fascio di elettroni dei campioni biologici, che contribuisce al basso rapporto segnale-rumore (SNR) nell'immagine. Questo basso SNR impedisce la caratterizzazione delle strutture ad alta risoluzione delle macromolecole biologiche utilizzando l'analisi a singola particella.

I rivelatori di elettroni di nuova generazione sono rivelatori basati su CMOS (complementare metallo-ossido-semiconduttore), che possono superare questi ostacoli legati al basso SNR. Queste telecamere CMOS a rilevamento diretto consentono una lettura rapida del segnale, grazie alla quale la telecamera contribuisce a una migliore funzione di diffusione del punto, un SNR adatto e un'eccellente efficienza quantistica detective (DQE) per macromolecole biologiche. Le telecamere a rilevamento diretto offrono un elevato SNR8 e un basso rumore nelle immagini registrate, con conseguente aumento quantitativo dell'efficienza quantistica del detective (DQE), una misura della quantità di rumore che un rilevatore aggiunge a un'immagine. Queste telecamere registrano anche filmati alla velocità di centinaia di fotogrammi al secondo, il che consente una rapida acquisizione dei dati9,10. Tutte queste caratteristiche rendono le telecamere a rilevamento diretto rapido adatte per applicazioni a basso dosaggio.

Le immagini stack con correzione del movimento vengono utilizzate per l'elaborazione dei dati per calcolare la classificazione 2D e ricostruire una mappa di densità 3D delle macromolecole utilizzando vari pacchetti software come RELION11, FREALIGN12, cryoSPARC13, cisTEM14 e EMAN215. Tuttavia, per l'analisi a singola particella, è necessario un enorme set di dati per ottenere una struttura ad alta risoluzione. Pertanto, i pedaggi di acquisizione automatica dei dati sono estremamente essenziali per la raccolta dei dati. Per registrare grandi set di dati crio-EM, negli ultimi dieci anni sono stati utilizzati diversi pacchetti software. Pacchetti software dedicati, come AutoEM16, AutoEMation17, Leginon18, SerialEM19, UCSF-Image420, TOM221, SAM22, JAMES23, JADAS24, EM-TOOLS ed EPU, sono stati sviluppati per l'acquisizione automatica dei dati.

Questi pacchetti software utilizzano attività di routine per trovare automaticamente le posizioni dei fori correlando le immagini a basso ingrandimento alle immagini ad alto ingrandimento, che aiutano a identificare i fori con ghiaccio vitreo di spessore di ghiaccio appropriato per l'acquisizione di immagini in condizioni a basso dosaggio. Questi pacchetti software hanno ridotto il numero di attività ripetitive e aumentato il throughput della raccolta dati crio-EM acquisendo una grande quantità di dati di buona qualità per diversi giorni in modo continuo, senza alcuna interruzione e la presenza fisica dell'operatore. Latitude-S è un pacchetto software simile, che viene utilizzato per l'acquisizione automatica dei dati per l'analisi di singole particelle. Tuttavia, questo pacchetto software è adatto solo per ID K2 / K3 e viene fornito con questi rilevatori.

Questo protocollo dimostra il potenziale di Latitude-S nell'acquisizione automatica di immagini della proteina spike SARS-CoV-2 con un rivelatore di elettroni diretto dotato di un crio-EM da 200 keV (vedi la Tabella dei materiali). Utilizzando questo strumento di raccolta dati, 3.000 file di filmati della proteina spike SARS-CoV-2 vengono acquisiti automaticamente e viene effettuata un'ulteriore elaborazione dei dati per ottenere una struttura proteica spike con risoluzione 3,9-4,4 Å.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: per la raccolta dei dati crio-EM sono necessari tre passaggi importanti: 1. preparazione della griglia crio-EM, 2. calibrazione e allineamento del microscopio, 3. raccolta automatica dei dati (Figura 1). Inoltre, la raccolta automatizzata dei dati è suddivisa in a. selezione dell'area adatta, b. ottimizzazione di Latitude-S, c. avvio della selezione automatica dei fori e d. avvio automatico dell'acquisizione automatica dei dati (Figura 1).

1. Preparazione della griglia Cryo-EM e caricamento dei campioni per l'acquisizione automatica dei dati

  1. Pulire le griglie utilizzando uno scaricatore a bagliore e variare i parametri di scarica del bagliore in base ai requisiti sperimentali (qui, 60 s a 20 mA).
  2. Aggiungere un campione proteico appena preparato (3 μL) alla griglia a scarica di bagliore e incubare per 10 s.
  3. Tamponare le griglie per 3-5 s al 100% di umidità e immergerle rapidamente nell'etano liquido usando un crio-stantuffo.
  4. Bloccare manualmente le griglie in un anello di clip per formare la cartuccia utilizzando un anello C-clip flessibile.
  5. Caricare le griglie congelate montate sulla cartuccia nella cassetta del caricatore automatico e trasferire la cassetta dal nano tappo al caricatore automatico preraffreddato del microscopio per la raccolta dei dati.

2. Sintonizzazione del microscopio e allineamento di base prima dell'acquisizione automatica dei dati

  1. Spostamento del fascio
    1. Fare clic su Beam shift dalla scheda Allineamento diretto .
    2. Ridurre l'ingrandimento e centrare il fascio sull'asse ottico utilizzando la manopola X e Y multifunzione .
  2. Allineamento del punto di rotazione
    1. Fate clic sull'opzione Inclinazione fascio (Beam tilt ) in Allineamento diretto pp X (Direct Alignment pp X ) della scheda Allineamento diretto (Direct Alignment ).
    2. Condensare il fascio in un punto e ridurre al minimo il movimento utilizzando la manopola multifunzione X e Y .
  3. Centraggio dell'apertura C2
    1. Selezionate l'apertura del condensatore dalla scheda Allineamento .
    2. Condensare il raggio in un punto, centrare il raggio sull'asse ottico e quindi espandere il raggio per coprire il cerchio in modo uniforme.
    3. Ripetere questi passaggi fino a quando l'apertura del condensatore 2 non viene regolata.
  4. Allineamento senza coma
    1. Fare clic su Allineamento X senza coma dalla scheda Allineamento diretto per allineare il fascio all'asse ottico.
    2. Utilizzare la manopola multifunzione per ridurre al minimo la forma e il movimento dell'FFT (assicurarsi che sia stabile).
    3. Ripetere la stessa procedura per Coma - allineamento libero Y.
  5. Impostare l'illuminazione parallela prima della raccolta dei dati nella crio-EM a causa della doppia lente C.
    1. Inserire l'apertura dell'obiettivo (70 μm) in modalità diffrazione.
    2. Focalizzare l'apertura dell'obiettivo sul piano focale anteriore dell'obiettivo di diffrazione controllando la manopola di intensità di sfocatura (obiettivo obiettivo e corrente dell'obiettivo C2).
    3. Assicurarsi che il bordo nitido dell'apertura dell'obiettivo sia visualizzato dopo la corretta sfocatura.
    4. Inserire il tappo del fascio e distribuire l'intensità fino a ridurre al minimo gli anelli di diffrazione della polvere d'oro.
      NOTA: se il raggio è distribuito correttamente, sullo schermo è visibile un anello di diffrazione trasparente della polvere d'oro, che indica che il raggio è parallelo.
    5. Ritrarre il tappo del fascio dopo aver impostato l'illuminazione parallela e cambiare la modalità del microscopio in nano sonda.
      NOTA: Controllare la messa a punto del microscopio prima di iniziare la raccolta dei dati per garantire le prestazioni ottimali del microscopio. Tutte queste impostazioni verrebbero eseguite nel microscopio Direct Alignment GUI Tab. Tutta la messa a punto del microscopio viene eseguita utilizzando una griglia di prova prima della raccolta dei dati.

3. Acquisizione dati con Latitude-S

  1. Avviare il software di acquisizione dati automatizzato Latitude-S.
    NOTA: l'installazione di Latitude-S richiede anche la calibrazione del microscopio, che verrà eseguita prima della raccolta dei dati e le impostazioni verranno memorizzate in modo permanente. Cinque diversi stati per la raccolta dei dati sono calibrati con quattro diversi ingrandimenti (Figura 1 e Figura 2). Lo stato dell'atlante e lo stato della griglia sono in due diversi ingrandimenti in modalità LM (intervalli a basso ingrandimento). Lo stato del foro è in modalità SA (intervalli ad alto ingrandimento) ma con un ingrandimento moderato. Lo stato attivo e lo stato dei dati utilizzano la modalità SA ad alto ingrandimento.
    1. Fare clic su DigitalMicrograph dal menu Start oppure fare doppio clic sull'icona DigitalMicrograph sul desktop.
    2. Selezionare l'icona Gestione tecnica da DigitalMicrograph.
      NOTA: questo sistema mostrerà le icone TEM e Latitude-S (Figura 2 e Figura supplementare S1).
    3. Selezionare l'icona Latitude-S per la raccolta automatica dei dati a particella singola.
      NOTA: la telecamera K2 funziona in tre modalità: lineare/integrata, conteggiata e super-risoluzione. L'utente può selezionare qualsiasi modalità nell'interfaccia di DigitalMicrograph. Le immagini di dati possono essere salvate come stack di immagini frazionate in dose o come immagini sommate in file MRC, TIF o .dm4 con profondità di bit diverse. Inoltre, i dati potrebbero essere salvati come immagini corrette dal movimento per la fotocamera K3. Su una fotocamera K2, uno stack di immagini non elaborato può essere salvato come file MRC a 4 bit, TIF a 8 bit o .dm4 a 8 bit.
  2. Creare una nuova sessione in base alle impostazioni di una sessione precedente.
    1. Seleziona la casella di controllo In base alla sessione precedente nella tavolozza.
    2. Seleziona il pulsante Nuovo .
    3. Scegliere la cartella contenente la sessione su cui si basano le impostazioni della nuova sessione. Passare alla directory della sessione precedente per creare la nuova sessione. Scegliere la cartella in cui salvare la nuova sessione e i dati associati.
    4. Selezionare e scegliere la cartella in cui verranno salvati la nuova sessione e i dati associati.
      NOTA: ogni stato e le relative impostazioni sottostanti (ingrandimento, condizioni di illuminazione, immagine o proiettore) e lo spostamento del fascio e i parametri della fotocamera (esposizione totale, esposizione a fotogramma singolo e binning) verranno esportati dalla sessione esistente alla nuova sessione. Il percorso della cartella viene visualizzato come stringa di testo nella parte inferiore della tavolozza. A ciascuna delle tavolozze degli stati e di configurazione è aggiunto un asterisco (*) al titolo per indicare che è già stato configurato ed è pronto per l'uso.
  3. Continuare una sessione esistente.
    1. Premere il pulsante Continua nella tavolozza per continuare una sessione esistente.
      NOTA: il montaggio dell'atlante non può essere modificato.
    2. Scegliere e passare alla cartella che contiene la sessione che deve essere continuata.
  4. Inizia una sessione completamente nuova.
    1. Fare clic su Nuova scheda nella tavolozza. Scegliere la cartella che contiene la sessione da continuare. Selezionare una cartella in cui salvare i dati.
      Nota : il nome di cartella predefinito viene compilato utilizzando la data e l'ora.
    2. Fare clic sull'icona Impostazioni . Nella casella Gestisci esplorazione stato visualizzata, aggiungere stato, impostare la condizione TEM, la condizione fotocamera e immagine/stack, quindi assegnare un nome allo stato.
      NOTA: il flusso di lavoro di acquisizione automatica dei dati utilizza 5 stati diversi per la raccolta automatica dei dati. Questi stati vengono configurati e memorizzati nelle rispettive tavolozze di stati. Il riepilogo dello stato è riportato nella Tabella 1.
  5. Configurare lo stato dell'atlante.
    1. Fare clic sulla tavolozza degli stati dell'atlante.
    2. Configurare lo stato dell'atlante con i seguenti parametri: ingrandimento 115x modalità LM in nano sonda, condizioni di illuminazione-dimensione spot 8 e luminosità 934400, binning: 1 e tempo di esposizione della fotocamera: 1.0 s per l'imaging a basso ingrandimento. Fare riferimento al riepilogo dello stato fornito nella Tabella 1.
    3. Fare clic su Avanti per passare allo stato successivo.
      NOTA: lo stato dell'atlante è lo stato di ingrandimento più basso, che fornisce il rilevamento dell'intera griglia (Figura supplementare S2). Generalmente, questo stato ci aiuta a visualizzare le intere griglie a basso ingrandimento e giudicare lo spessore del ghiaccio, la planarità e il quadrato rotto delle griglie. Si consiglia di generare l'atlante in diverse aree della griglia per osservare lo spessore ottimale del ghiaccio e lo spessore di ghiaccio non ottimale delle griglie (Figura supplementare S3). I parametri citati potrebbero essere variati in base alle esigenze dell'utente.
  6. Configurare lo stato della griglia.
    1. Fare clic sulla tavolozza Stato griglia.
    2. Configurare lo stato grid con le seguenti ottiche di imaging al microscopio (ingrandimento 380x modalità LM nella sonda Nano), condizioni di illuminazione (dimensione dello spot: 8 e luminosità 626.200), binning: 1 e tempo di esposizione della fotocamera: 1,0 s.
    3. Vedere il riepilogo dello stato Latitude-S fornito nella Tabella 1.
    4. Fare clic su Avanti per passare allo stato successivo.
      NOTA: lo stato della griglia è impostato con un ingrandimento superiore allo stato dell'atlante in modo tale che il campo visivo sia di un quadrato della griglia (Figura 2). In questo particolare ingrandimento, si osserva un quadrato della griglia. Pertanto, i fori sono osservati correttamente in questo ingrandimento, che aiuta a controllare lo spessore del ghiaccio dei fori (Figura supplementare S4). Un semplice filtro passa-banda viene utilizzato nello stato della griglia per individuare i fori nella griglia del brevetto. I parametri citati potrebbero essere variati in base alle esigenze dell'utente.
  7. Configurate lo stato del foro.
    1. Fate clic sulla tavolozza dei fori.
    2. Configurare lo stato del foro con le seguenti impostazioni del microscopio: ottica di imaging (ingrandimento 4500x modalità SM in nano sonda), condizioni di illuminazione (dimensione dello spot: 7 e diametro del fascio 8,81 μm), binning: 1 e tempo di esposizione della fotocamera: 1,0 s.
    3. Modificare i parametri, se necessario, in base al tipo di griglia. Vedere il riepilogo dello stato fornito nella Tabella 1.
    4. Fare clic su Avanti per passare allo stato successivo.
      NOTA: la modalità SA indica un intervallo di ingrandimento elevato nel microscopio elettronico. Lo stato del foro è nell'intervallo di ingrandimento SA con un campo visivo di pochi micrometri (10-20 μm) (Figura 2 e Figura supplementare S4). Questo intervallo di ingrandimento è superiore allo stato Atlante o Griglia ma molto più piccolo dello stato Messa a fuoco/Dati. In questo ingrandimento, i singoli fori saranno visibili. La dimensione del foro è appropriata per osservare alti gradi di contaminazione, fori vuoti e il corretto spessore del ghiaccio dei fori. I fori per l'imaging sono selezionati in base a queste ipotesi. Nello stato del foro vengono utilizzati due filtri: uno per correlare un'immagine di riferimento del foro con una nuova immagine del foro e un altro per regolare l'altezza dello stage all'altezza eucentrica.
  8. Configurare lo stato attivo.
    1. Fare clic sulla tavolozza Messa a fuoco.
    2. Configurare lo stato di messa a fuoco con le seguenti impostazioni del microscopio: ottica di imaging (ingrandimento 45.000x modalità SA in nano sonda), condizioni di illuminazione (dimensione dello spot: 8 e luminosità 934400), binning: 1 e tempo di esposizione della fotocamera: 1,0 s.
    3. Concentrati sull'area del carbonio amorfo vicino al foro. Fare riferimento al riepilogo dello stato Latitude-S fornito nella Tabella 1.
    4. Fare clic su Avanti per passare allo stato successivo.
      NOTA: la modalità SA indica un intervallo di ingrandimento elevato nel microscopio elettronico. Lo stato Focus è l'ingrandimento dell'intervallo SA più elevato. In modalità di messa a fuoco, il raggio viene spostato in un'area di carbonio vicina del foro di destinazione ed esegue automaticamente la messa a fuoco per raccogliere i dati nello stato dei dati. Un filtro passa-banda combinato con un filtro hanning o soft rettangolare viene utilizzato nello stato di messa a fuoco per misurare l'offset tra due immagini dello stato di messa a fuoco della stessa area (Figura 2). I parametri citati potrebbero essere variati in base alle esigenze dell'utente.
  9. Configurare lo stato dei dati.
    1. Fare clic su Tavolozza dati.
    2. Configurare lo stato dei dati con le seguenti impostazioni del microscopio: ottica di imaging (ad esempio, ingrandimento 28.000x, 45.000x, 54.000x in modalità SA in nano sonda), condizioni di illuminazione (dimensione dello spot: 8 e luminosità 934400), binning: 1 e tempo di esposizione della fotocamera: 1.0 s.
    3. Fare riferimento al riepilogo dello stato Latitude-S fornito nella Tabella 1.
    4. Fare clic su Avanti per passare allo stato successivo.
      NOTA: lo stato dei dati è l'ingrandimento più elevato selezionato in base ai requisiti di dimensione dei pixel e alla risoluzione di destinazione (Figura 2). Generalmente, dopo la messa a fuoco, il raggio viene automaticamente spostato nell'area di destinazione per raccogliere i dati. I parametri sopra menzionati potrebbero essere modificati in base alle esigenze dell'utente.

4. Configurazione della messa a fuoco

  1. Fare clic sulla tavolozza di configurazione Messa a fuoco. Specificate l'intervallo di valori di sfocatura e la dimensione del passo nella scheda specificata.
  2. Premere il pulsante Avanti per passare al passaggio successivo.
    NOTA: valori di sfocatura più bassi possono essere utilizzati per l'acquisizione di dati ad alta risoluzione. Generalmente, per l'acquisizione delle immagini vengono utilizzati valori di sfocatura da -0,5 a -3,0 μm con dimensioni del gradino di sfocatura di 0,25 o 0,5 5. Gli utenti possono saltare il passaggio di configurazione dello stato attivo se desiderano solo esaminare l'esempio. Basta premere il pulsante Avanti sulla tavolozza per saltare la fase di configurazione della messa a fuoco.

5. Allineamento fine

  1. Concentrarsi su alcune caratteristiche della griglia (ad esempio, ghiaccio esagonale di contaminazione del ghiaccio); vedere la Figura 3.
    NOTA: le funzionalità non devono essere troppo grandi o troppo piccole. Dovrebbero essere visibili sia con l'ingrandimento dello stato Atlas 115x (modalità LA) che con l'ingrandimento dei dati.
  2. Fare clic sul pulsante Cattura . Posiziona il segno della croce rossa sulla stessa caratteristica su ogni immagine di stati diversi.
  3. Inizia con lo stato attivo, i dati e gli stati dei fori perché il loro campo visivo è molto più grande degli stati dell'atlante e della griglia. Eseguire lo zoom sugli stati atlante e griglia per posizionare il segno della croce rossa sulla stessa feature negli stati atlante e griglia.
  4. Fare clic sul pulsante Calcola per calcolare le posizioni di cinque stati diversi, che calcoleranno gli offset tra ciascuno degli stati e li rifletteranno nella finestra di output.
    NOTA: i valori di offset sono integrati negli stati per un ulteriore utilizzo (Figura 3). L'allineamento fine viene eseguito per fornire un'elevata precisione della posizione di ciascuno stato (Figura 3). Questo allineamento fine aiuta a individuare la posizione esatta in tutti e cinque gli stati. L'allineamento fine è fondamentale per l'acquisizione di dati a singola particella. Pertanto, si consiglia vivamente di eseguire l'allineamento fine prima dell'imaging.

6. Procedura di acquisizione dati con Latitude-S

  1. Fare clic sulla tavolozza Cattura.
    NOTA: Generalmente, i dati dell'atlante vengono raccolti a basso ingrandimento (115x) per visualizzare la maggior parte dei quadrati della griglia.
  2. Scegli le dimensioni dell'atlante per coprire l'intera griglia o parte della griglia in base al requisito (ad esempio, 6 x 6, 8 x 8, 12 x 12, 6 x 8, 8 x 6, 12 x 8 o 8 x 12).
    NOTA: la dimensione dell'atlante 16 x 16 copre l'intera griglia.
  3. Fare clic sul pulsante Cattura per acquisire l'atlante.
    NOTA: viene visualizzata la finestra di navigazione principale di Latitude-S che riempie lo spazio disponibile in DigitalMicrograph (Figura supplementare S5). Tre riquadri immagine nella finestra di navigazione principale mostrano le immagini degli stati del sistema a tre diversi ingrandimenti. L'atlante complessivo è attualmente visualizzato nel suo stato corrente di acquisizione nel riquadro più a sinistra. Le tessere nell'atlante si riempiranno man mano che si verifica ogni acquisizione.
  4. Selezionare il quadrato della griglia in base allo spessore del ghiaccio navigando sull'atlante (Figura supplementare S5). Una volta selezionati i quadrati della griglia desiderati, fare clic sul pulsante Pianifica e osservare le tessere nel quadrato della griglia riempirsi mentre ogni quadrato della griglia viene acquisito.
  5. Fare clic sul pulsante Pianifica una volta selezionati i quadrati della griglia.
  6. Selezionate un foro rappresentativo nel quadrato della griglia aggiungendone la posizione. Una volta acquisita l'immagine di un foro, definire i dati e le posizioni di messa a fuoco e salvare il layout come modello (Figura supplementare S6).
  7. Fare clic su Ricerca automatica, indicare la dimensione del foro (ad esempio, R1.2 / 1.3) e fare clic sul pulsante Trova nel programma, che farà sì che il programma Trova trovi automaticamente i fori in base al diametro del foro. Quindi, fare clic sul pulsante Contrassegna per aggiungere il modello (Figura 4) e aggiungere segni di cerchi rossi in tutti i fori in una griglia o in un quadrato parziale della griglia.
  8. Impostare l'intensità per rimuovere i fori dal quadrato della griglia e la contaminazione da ghiaccio (Figura 4).
    NOTA: Infine, i fori selezionati saranno contrassegnati in giallo per la pianificazione della raccolta dei dati.
  9. Fare clic sul pulsante Pianifica nelle attività Latitude dopo aver aggiunto i fori tramite Ricerca automatica.
    NOTA: prima di pianificare la raccolta automatica dei dati, assicurarsi che il livello del serbatoio dell'azoto liquido sia sufficiente, che la pompa turbo del caricatore automatico sia spenta e che lo spazio dell'unità RAID sia libero. Il task manager Latitude-S mostra il numero di stati dell'atlante, del quadrato della griglia, del foro e dei dati pianificati per la raccolta dei dati (Figura 5). Nella GUI di Latitude-S, saranno visibili varie combinazioni di colori e verrà visualizzato il significato delle diverse combinazioni di colori: 1. Il giallo indica non programmato; 2. Il verde indica programmato; 3. Il blu indica Acquisito; 4. Il rosso indica non riuscito.

7. Elaborazione dati Cryo-EM

NOTA: l'elaborazione delle immagini Cryo-EM della proteina spike è descritta in dettaglio nella letteratura recente25.

  1. Eseguire l'elaborazione delle immagini della proteina spike di SARS-CoV2 utilizzando RELION 3.011.
  2. Scherma manualmente le immagini dei filmati raccolte utilizzando Latitude-S ed esegui la correzione del movimento indotta dal fascio dei singoli filmati utilizzando il software MotionCor29. Eseguire manualmente lo screening iniziale delle micrografie corrette in movimento con l'aiuto del pacchetto software cisTEM14.
    NOTA: Quasi l'85% delle micrografie acquisite automaticamente erano di buona qualità e i dati avevano un segnale compreso tra 3,7-5,2 Å, che viene calcolato utilizzando il software cisTEM14 (Figura supplementare S7A,B).
  3. Elaborare i dati utilizzando il pacchetto software RELION 3.011.
    1. Prelevare manualmente le particelle spike e sottoporle alla classificazione di classe 2D (Figura supplementare S7C). Utilizzare la migliore classe 2D come riferimento per selezionare automaticamente 3.99.842 particelle a picco singolo dalle micrografie utilizzando lo strumento di selezione automatica RELION11.
      NOTA: Sono stati effettuati tre cicli di classificazione 2D prima di sottoporre le particelle alla classificazione 3D (Figura supplementare S8). Circa 2.55.982 singole particelle sono state selezionate per la classificazione 3D e il set di dati è stato classificato in sei classi. L'auto-perfezionamento 3D finale è stato eseguito con la migliore classe; 85.227 particelle spike sono state ottenute dalla classificazione 3D.
    2. Dopo il perfezionamento automatico, eseguire il perfezionamento per sfocatura per particella con parametri di inclinazione del fascio appropriati per il miglioramento della risoluzione. Successivamente, sottoporre le particelle alla lucidatura bayesiana utilizzando il pacchetto software RELION 3.011. Infine, utilizzare il set di particelle lucide per un altro ciclo di auto-raffinamento 3D utilizzando RELION 3.011.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nell'attuale situazione pandemica, la crio-EM svolge un ruolo chiave nel caratterizzare le strutture di varie proteine da SARS-CoV-226,27,28,29, che possono aiutare a sviluppare vaccini e farmaci contro il virus. Vi è un urgente bisogno di sforzi di ricerca rapidi con risorse umane limitate per combattere la malattia da coronavirus del 2019. L'acquisizione dei dati nella crio-EM a singola parti...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Latitude-S è un'interfaccia utente intuitiva, che fornisce un ambiente per configurare e raccogliere automaticamente migliaia di micrografie ad alta risoluzione o file di filmati in due giorni. Fornisce una facile navigazione attraverso le griglie e mantiene la posizione dello stadio del microscopio mentre passa da un basso ingrandimento ad un ingrandimento elevato. Ogni fase dell'acquisizione dei dati con Latitude-S è efficiente in termini di tempo, con funzionalità come una semplice interfaccia utente, uno streaming ra...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno conflitti di interesse concorrenti o finanziari da dichiarare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Riconosciamo il Dipartimento di Biotecnologia, il Dipartimento di Scienza e Tecnologia (DST) e Scienza, e il Ministero dello Sviluppo delle Risorse Umane (MHRD), India, per i finanziamenti e la struttura crio-EM di IISc-Bangalore. Riconosciamo il programma DBT-BUILDER (BT/INF/22/SP22844/2017) e DST-FIST (SR/FST/LSII-039/2015) per la struttura National Cryo-EM di IISc, Bangalore. Riconosciamo il sostegno finanziario del Science and Engineering Research Board (SERB) (Grant No.-SB/S2/RJN-145/2015, SERB-EMR/2016/000608 e SERB-IPA/2020/000094), DBT (Grant No. BT/PR25580/BRB/10/1619/2017). Ringraziamo la signora Ishika Pramanick per aver preparato le griglie crio-EM, la raccolta dei dati crio-EM e la preparazione della Tabella dei materiali. Ringraziamo anche il signor Suman Mishra per l'elaborazione delle immagini crio-EM e per averci aiutato a preparare le figure. Ringraziamo il Prof. Raghavan Varadarajan per averci aiutato a ottenere il campione di proteina spike purificato per questo studio.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Carta assorbenteTed Pella, INC.47000-100Articolo per la preparazione dei campioni EM
CapsulaThermo Fisher Scientific9432 909 97591Unità per la preparazione dei campioni EM
CassettaThermo Fisher Scientific1020863Unità per la preparazione dei campioni EM
C-Clip ThermoFisher Scientific1036171Articolo per la preparazione dei campioni EM Strumento
l'inserimento della clipC Thermo Fisher Scientific9432 909 97571Strumento per la preparazione dei campioni EM
C-Clip RingThermo Fisher Scientific1036173Articolo per la preparazione dei campioni EM
Griglia EM (Quantifoil)Microscopia elettronica ScienzeQ3100AR1.3R 1.2/1.3 300 Mesh, Macchina
la scarica del baglioredell'oro QuorumN/AQuorum Macchina per la scarica del bagliore GlowQube
K2 DEDGatan Inc.N/ADispositivo di raccolta dati Cryo-EM (fotocamera)
Latitude S SoftwareGatan Inc.Software di imaging
Stazione di caricoThermo Fisher Scientific1130698Unità di preparazione dei campioni EM
Talos 200 kV ArcticaThermo Scientific™N/AMicroscopio crioelettronico
Vitrobot Mark IVThermo Fisher ScientificN/AUnità di preparazione dei campioni EM
per per

References

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