Articolo metodologico

Un sistema di coltura automatizzato da utilizzare nei test preclinici di terapie dirette all'ospite per la tubercolosi

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DOI:

10.3791/62838

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16 agosto 2021

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1Department of Clinical Medicine, Trinity Translational Medicine Institute, St. James's Hospital, Trinity College Dublin, The University of Dublin, 2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, Royal College of Surgeons in Ireland (RCSI), 3SFI Advanced Materials and Bioengineering Research (AMBER) Centre, RCSI & TCD, 4SFI Centre for Research in Medical Devices (CURAM), RCSI, Dublin and National University of Ireland

In questo articolo

Sommario

La quantificazione rapida ed efficiente della crescita intracellulare di M. tuberculosis è fondamentale per perseguire terapie migliori contro la tubercolosi (TB). Questo protocollo descrive un test di rilevamento colorimetrico basato sul brodo utilizzando un sistema di coltura liquida automatizzato per quantificare la crescita di Mtb nei macrofagi trattati con terapie candidate dirette dall'ospite.

Abstract

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), l'agente eziologico della tubercolosi (TB), è stato il killer di malattie infettive più significativo a livello globale fino all'avvento di COVID-19. Mtb si è evoluto per persistere nel suo ambiente intracellulare, eludere le difese dell'ospite e ha sviluppato resistenza a molti farmaci antitubercolari. Un approccio per risolvere la resistenza è identificare i farmaci approvati esistenti che aumenteranno la risposta immunitaria dell'ospite alla Mtb. Questi farmaci potrebbero quindi essere riproposti come terapie aggiuntive dirette dall'ospite (HDT) per ridurre i tempi di trattamento e aiutare a superare la resistenza agli antibiotici.

La quantificazione della crescita intracellulare di Mtb nei macrofagi è un aspetto cruciale della valutazione del potenziale HDT. Il gold standard per misurare la crescita della Mtb è il conteggio delle unità formanti colonie (CFU) su piastre di agar. Questo è un test lento e laborioso che non si presta a uno screening rapido dei farmaci. In questo protocollo, un sistema di coltura automatizzato basato sul brodo, che è più comunemente usato per rilevare Mtb nei campioni clinici, è stato adattato per lo screening preclinico delle terapie dirette all'ospite. È stata valutata la capacità del sistema di analisi della coltura liquida di studiare la crescita intracellulare di Mtb nei macrofagi trattati con HDT. Gli HDT testati per la loro capacità di inibire la crescita di Mtb erano acido retinoico all-trans (AtRA), sia in soluzione che incapsulati in microparticelle di poli(acido lattico-co-glicolico) (PLGA) e la combinazione di interferone-gamma e linezolid. I vantaggi di questa tecnica automatizzata basata su colture liquide rispetto al metodo CFU includono semplicità di configurazione, preparazione meno laboriosa e tempi di risultati più rapidi (5-12 giorni rispetto ai 21 giorni o più per le piastre di agar).

Introduzione

Il Mycobacterium tuberculosis (Mtb), l'agente eziologico della tubercolosi, è stato il killer di malattie infettive più significativo a livello globale nel 20191. Per eludere le difese dell'ospite, Mtb sovverte l'attività micobattericida delle cellule immunitarie innate come i macrofagi e le cellule dendritiche (DC), permettendogli di persistere intracellulare e replicarsi2. La mancanza di un vaccino efficace per prevenire la tubercolosi polmonare adulta e la crescente comparsa di ceppi resistenti ai farmaci evidenziano l'urgente necessità di nuove terapie.

Le terapie aggiuntive dirette dall'ospite (HDT) potrebbero ridurre i tempi di trattamento e aiutare a superare la resistenza3. La valutazione preclinica dei candidati HDT in vitro per determinare l'attività micobattericida all'interno dei macrofagi si basa spesso sulla quantificazione della crescita di Mtb da parte di unità formanti colonie (CFU) su piastre di agar solido. Questo è un test lento e laborioso che non si presta a uno screening rapido dei farmaci. I sistemi di rilevamento microbico automatizzati basati sul brodo disponibili in commercio sono più comunemente utilizzati nei laboratori di microbiologia clinica per il rilevamento e i test di sensibilità ai farmaci di Mtb e altre specie micobatteriche nei campioni clinici4. Questi strumenti misurano la crescita indirettamente in base all'attività metabolica batterica che porta a cambiamenti fisici nei terreni di coltura (variazione dei livelli di CO 2 o O2 o pressione) monitorati nel tempo5. La lettura è il tempo di positività (TPP), che ha precedentemente dimostrato di correlare con CFU Mtb in campioni di espettorato di pazienti affetti da tubercolosi in risposta al trattamento 6,7 e in lisati di polmone murino infetto e milza8. Inoltre, sono stati utilizzati sistemi di rilevamento di colture liquide per misurare l'effetto delle terapie convenzionali dirette da patogeni sulla crescita di micobatteri in coltura axenica e macrofagi in coltura 9,10. Lo strumento è stato utilizzato anche per studiare la capacità innata delle cellule dendritiche e dei macrofagi alveolari di controllare la crescita intracellulare di Mtb11,12. Questo protocollo sperimentale dimostra che un sistema diagnostico di coltura liquida può essere adattato per eseguire lo screening preclinico dell'HDT per la tubercolosi nei macrofagi in coltura. Rispetto al censimento delle CFU, il vantaggio principale di questa tecnica è che riduce considerevolmente il lavoro sperimentale e il tempo necessario per quantificare la crescita/sopravvivenza micobatterica intracellulare. Questa tecnica si basa sull'accesso a uno strumento di coltura automatizzato che può essere utilizzato per valutare la sopravvivenza micobatterica intracellulare nelle cellule immunitarie trattate con una vasta gamma di reagenti farmacologici mirati alle funzioni cellulari per aumentare l'immunità dell'ospite.

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Protocollo

Gli esperimenti delineati in questo protocollo sono stati condotti utilizzando il ceppo H37Ra attenuato di Mtb, che può essere gestito in un laboratorio di livello di contenimento 2. Tutte le manipolazioni di micobatteri vivi sono state effettuate in un armadio di sicurezza biologica di classe II (BSC). Le procedure sperimentali sono state progettate per ridurre al minimo la generazione di aerosol. La coltura cellulare eucariotica (cellule THP-1) è stata effettuata anche in una BSC di Classe II. Il laboratorio ha effettuato una valutazione del rischio e ha assicurato che tutte le procedure fossero eseguite in linea con le normative istituzionali e nazionali sulla sicurezza biologica. La linea cellulare monocitica umana THP-1 è stata utilizzata per eseguire il metodo come descritto (fase 1). Le cellule sono differenziate in macrofagi dopo stimolazione con forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA) prima dell'infezione da micobatteri.

1. Coltura cellulare

  1. Propagare lo stock di semi di H37Ra alla fase logaritmica nel brodo Middlebrook 7H9 (MB) integrato con arricchimento di albumina-destrosio-catalasi (ADC) (10%) e polisorbato allo 0,05% 80. Conservare le scorte di H37Ra in 1 mL di aliquote in un congelatore a -80 °C per un massimo di 1 anno.
  2. Scongelare un flaconcino da 1 mL di Mtb-H37Ra e trasferirlo in un matraccio T25 con un tappo filtrante contenente 9 mL di brodo integrato MB circa 1 settimana prima dell'esperimento pianificato. Incubare a 37 °C per 5-7 giorni in incubatrice statica.
  3. Coltivare cellule THP-1 in RPMI-1640 integrate con siero fetale di vitello non ucciso dal calore (RPMI completo (c) RPMI) in un pallone T75 in un incubatore umidificato di CO 2 al 5% di CO2/37 °C e sottocoltura due volte alla settimana per mantenere una densità inferiore a 1 x 106 cellule / ml.
  4. Differenziare le cellule THP-1 in macrofagi 3 giorni prima dell'infezione pipettando delicatamente le cellule più volte usando una pipetta sierologica in palloni T75 per disperdere eventuali grumi e metterli in un tubo conico da 50 ml.
  5. Centrifugare le celle a 300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente, decantare il surnatante e risospendere delicatamente il pellet in 2 ml di RPMI. Eseguire il conteggio delle cellule per stimare le cellule/ml.
  6. Semina 2 mL di macrofagi THP-1 in piastre di coltura tissutale a 12 pozzetti ad una densità di 100.000 cellule/ml in cRPMI con 100 ng/mL PMA per 72 ore. Rimuovere il mezzo contenente PMA dalle cellule e ricostituire con cRPMI fresco prima dell'infezione da Mtb.
  7. Impostare le singole piastre per ogni punto temporale richiesto.
  8. Cellule seme alla stessa densità (100.000 cellule / ml) in vetrini a 2 pozzetti per determinare la molteplicità dell'infezione (MOI).
  9. Mettere in un incubatore umidificato al 5% di CO2 per 3 giorni a 37 °C.

2. Quantificazione dell'assorbimento di Mtb

  1. Determinazione dell'assorbimento di Mtb da parte dei macrofagi (MOI)
    1. Installare l'armadio di sicurezza biologica di classe II (BSC) il giorno dell'infezione e lavorare su due strati di carta velina per rilevare eventuali fuoriuscite. Impostare i contenitori per gli scarti dei rifiuti secondo le normative locali.
    2. Prelevare 6-8 mL di coltura micobatterica dal matraccio T25 e trasferirlo in un tubo di polipropilene da 15 ml.
      NOTA: tubi di volume più piccolo possono essere utilizzati per esperimenti più piccoli.
    3. Centrifugare il tubo in una centrifuga da banco a temperatura ambiente per 10 minuti a 2890 x g.
    4. Rimuovere con cautela il tubo dalla centrifuga e trasferirlo nell'armadio di sicurezza biologica. Attendere 1 minuto per consentire ai batteri di depositarsi.
      1. Versare il surnatante nel contenitore di scarto del disinfettante, ricapitolare il tubo e risospendere i batteri nel mezzo rimanente toccando il lato del tubo. Attendere 1 minuto per consentire ai batteri di depositarsi.
    5. Aggiungere 2 mL di cRPMI preriscaldato, mescolare delicatamente e trasferire in un tubo conico da 50 mL.
    6. Risospendere i micobatteri con molta attenzione utilizzando un ago da 25 G e una siringa da 5 ml. Per risospendere, aspirare la sospensione di micobatteri nella siringa ed espellere molto delicatamente lungo la parete laterale del tubo per ridurre al minimo la produzione di aerosol. Ripeti 6-8 volte.
      NOTA: Prestare la massima attenzione in quanto si tratta di una coltura ad alta densità di micobatteri. Per evitare il rischio di lesioni da puntura d'ago, utilizzare aghi smussati ove possibile e siringhe Luer lock.
    7. Smaltire l'ago e la siringa in un contenitore per oggetti taglienti nella BSC.
    8. Trasferire la sospensione in un tubo di microfughe da 2 ml (con tappo a vite) e centrifugare a temperatura ambiente per 3 minuti a 100 x g per pellettare eventuali grumi rimanenti. Riportare il tubo nell'armadio di sicurezza e attendere 1 minuto per consentire ai batteri di depositarsi.
    9. Trasferire i primi 1-1,5 ml del surnatante in una nuova provetta. Gettare il tubo originale nel cestino dei rifiuti contenente il disinfettante. Mescolare bene e aggiungere varie quantità di sospensione micobatterica (ad es. 5, 25, 50, 150 μL) ai vetrini a 2 pozzetti e incubare per 3 ore in un incubatore di CO2 a 37 °C.
  2. Colorazione per batteri acidi veloci (AFB)
    NOTA: Dopo 3 ore di incubazione, i macrofagi vengono lavati e fissati con paraformaldeide per inattivare i micobatteri. I vetrini vengono quindi colorati utilizzando un kit Auramine O modificato (vedi Tabella dei materiali) per stimare i micobatteri fagocitati per cellula. A causa della loro parete cellulare cerosa, i micobatteri trattengono il colorante Auramine dopo un lavaggio acido-alcolico. I nuclei dei macrofagi vengono quindi controcolorati con Hoechst. Questo metodo consente di contare il numero di batteri fagocitati per cellula e viene utilizzato per determinare la molteplicità di infezione (MOI) dei macrofagi.
    1. Rimuovere il mezzo dal vetrino della camera di vetro dopo aver pipettato su e giù tre volte per rimuovere i batteri che non sono stati fagocitati.
    2. Lavare una volta con 2 ml di PBS a temperatura ambiente.
    3. Conservare scorte di paraformaldeide al 4%, disciolta in PBS in aliquote a -20 °C per un massimo di 6 mesi. Scongelare un'aliquota di paraformaldeide al 4% immediatamente prima dell'uso. Diluire al 2% di paraformaldeide con PBS e aggiungere 2 ml per pozzetto.
    4. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. La slitta della camera di vetro può essere rimossa dall'armadio di sicurezza in questa fase per la colorazione.
    5. Lavare il vetrino sotto un getto delicato di acqua di rubinetto.
    6. Erogare una quantità sufficiente di Auramina sul vetrino per coprire le cellule utilizzando una pipetta di trasferimento di plastica e incubare per 1 minuto a temperatura ambiente al buio (coprire con un foglio di alluminio).
    7. Lavare il colorante in eccesso dal vetrino con acqua di rubinetto e aggiungere il decoloratore / quencher per 1 minuto al buio.
    8. Lavare via l'eccesso con acqua di rubinetto e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente con Hoechst 33342 (10 μg/mL in PBS) al buio.
    9. Lavare via la macchia Hoechst con acqua di rubinetto, rimuovere le camere, drenare l'acqua in eccesso dal vetrino, aggiungere una goccia di antisbiadimento e copricopertina e asciugare all'aria.
    10. Esaminare il vetrino al microscopio fluorescente utilizzando l'obiettivo olio 100x. I micobatteri diventano verdi fluorescenti sotto il filtro FITC. I nuclei diventano blu fluorescente sotto il filtro DAPI (Figura 1C).
    11. Determinare il MOI contando il numero di micobatteri fagocitati per cellula e la percentuale di cellule infette.
    12. Calcolare il volume di sospensione micobatterica necessaria per ottenere il MOI richiesto in base alla superficie di un pozzetto nella piastra; Ad esempio, la superficie dei vetrini della camera di vetro utilizzati in questo esperimento è di 4 cm2. Un basso MOI (circa 1-2 bacilli / cellula) è auspicabile per esperimenti condotti per diversi giorni (ad esempio, 5 giorni).
  3. Infezione dei macrofagi
    1. Mescolare bene la sospensione di micobatteri e aggiungere la quantità necessaria alle cellule su piastre a 12 pozzetti una volta determinato il volume richiesto per ottenere il MOI desiderato.
    2. Incubare a 37 °C per 3 ore per consentire la fagocitazione dei micobatteri.
    3. Rimuovere i batteri extracellulari lavando i pozzetti con RPMI caldo o HBSS più volte.
    4. Lisare i macrofagi in un pozzetto (campione di 3 ore) per determinare il tempo percentuale di positività (TTP) dell'inoculo iniziale (campione di 3 ore) come descritto nel passaggio 3 di seguito.
    5. Aggiungere cRPMI fresco e le dosi di farmaco necessarie o il controllo del veicolo ai pozzetti rimanenti, incubare le piastre nell'incubatore di CO2 a 37 °C per il tempo necessario (a seconda del disegno sperimentale, ma di solito a intervalli diversi tra 1 e 8 giorni).

3. Raccolta di campioni per il sistema di rilevamento della coltura liquida

NOTA: Il giorno dell'infezione, i micobatteri extracellulari vengono rimossi mediante lavaggio e i micobatteri intracellulari vengono raccolti mediante lisi di un pozzetto di macrofagi (campione di 3 ore) per determinare la quantità iniziale fagocitata come controllo di base per l'infezione. In tempi successivi sia il substrato, il lisato cellulare e i lavaggi vengono combinati per misurare la crescita micobatterica totale. La crescita extracellulare e intracellulare può anche essere valutata separatamente, se lo si desidera.

  1. Raccolta di 3 ore di campione per determinare TTP
    1. Lavare via i micobatteri extracellulari da tutti i pozzetti dopo le prime 3 ore di infezione come descritto al punto 2.3.3. Aggiungere 1 mL di fluido fresco al pozzetto di controllo di 3 ore per equalizzare il volume di lisato con quelli dei punti temporali successivi.
      NOTA: vedere il punto 3.2.7 se i micobatteri extracellulari devono essere esclusi dall'analisi.
  2. Raccolta di campioni
    1. Riscaldare il brodo MB e le bottiglie di coltura degli strumenti per portarle a temperatura ambiente.
    2. Trasferire il mezzo dalla piastra a 12 pozzetti ai corrispondenti tubi conici marcati.
    3. Aggiungere 500 μL di tampone di lisi sterile (0,1% Triton x-100 in PBS filtrato attraverso un filtro sterile da 0,2 μm) a ciascun pozzetto per 10 minuti.
    4. Raschiare delicatamente le cellule dal pozzetto con un raschietto sterile e combinare con il mezzo nel tubo conico appropriato.
    5. Lavare il pozzetto con 0,5 ml di PBS sterile e trasferire nel tubo appropriato.
    6. Passare delicatamente ogni campione attraverso un ago e una siringa (25 G) 6-8 volte per rompere i grumi. Diluire i campioni 1:10 in brodo MB; Campione da 100 μL + 900 μL MB di terreno.
    7. Nei tempi/giorni richiesti (di solito da 1 a 8 giorni), prelevare i campioni rimanenti seguendo i passaggi 3.2.1-3.2.6 di cui sopra.
      NOTA: I ricercatori potrebbero preferire escludere i micobatteri extracellulari dalla loro analisi, nel qual caso, nel punto 3.2.2 sopra, il mezzo da ciascun pozzetto viene scartato e i macrofagi vengono lavati più volte prima di aggiungere tampone di lisi.
  3. Inoculazione e caricamento di bottiglie per colture di strumenti
    NOTA: I dettagli dello strumento di coltura liquida e dei relativi materiali di consumo sono forniti nella tabella dei materiali.
    1. Sterilizzare il tappo di gomma del flacone per la coltura dello strumento con carta velina imbevuta di alcool al 70% e lasciarlo asciugare all'aria.
      NOTA: questo passaggio deve essere eseguito nel BSC.
    2. Preparare i flaconi trasferendo una quantità sufficiente di integratori nutrizionali per tutti i campioni in un tubo conico (0,5 ml/bottiglia). Utilizzare un ago e una siringa per iniettare 0,5 ml di integratore alimentare nel flacone di coltura dello strumento.
    3. Pipettare 500 μL del campione diluito (1:10) in una provetta con fondo a V da 1 mL.
    4. Utilizzare un ago e una siringa per iniettare i 500 μL di campione nel flacone di coltura dello strumento assegnato.
    5. Sterilizzare il tappo di gomma del flacone per la coltura dello strumento con carta velina imbevuta di alcool al 70% e lasciarlo asciugare all'aria. Pulire le bottiglie con carta velina imbevuta di alcool al 70% prima di essere rimosse dalla BSC.
    6. Trasportare con cura le bottiglie dall'armadio di biosicurezza allo strumento per il caricamento.
    7. Premere il pulsante di caricamento sul sistema di rilevamento microbico automatizzato.
    8. Scansiona i codici a barre sui flaconi per la coltura degli strumenti e posizionali nell'incubatore del sistema di rilevamento a 37 °C per un massimo di 42 giorni. Leggi e registra il tempo impiegato per raggiungere la positività dallo schermo dello strumento.
      NOTA: Il codice a barre consente allo strumento di identificare la bottiglia e collegare le letture di riflettanza con una particolare bottiglia.
    9. Calcolare il tempo percentuale di positività (TTP) confrontando il TTP dell'inoculo intracellulare iniziale (Giorno 0) con quello dei macrofagi coltivati per i tempi indicati. Una variazione positiva della percentuale TTP significa crescita micobatterica13.
      Ad esempio, per il giorno 3:
      Variazione percentuale nel tempo di positività = figure-protocol-1

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Risultati

Lo strumento automatizzato di coltura liquida utilizzato in questo studio monitora i livelli di CO2 ogni 10 minuti. Un cambiamento di colore nel sensore nella parte inferiore della bottiglia dello strumento viene misurato colorimetricamente ed espresso come unità di riflettanza. Il software dello strumento applica quindi algoritmi di rilevamento per calcolare il tempo di positività (TTP), cioè il numero di giorni dall'inoculazione fino a quando le colture vengono contrassegnate come positive (

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Discussione

Gli autori hanno utilizzato il metodo di coltura liquida descritto in questo protocollo per monitorare la crescita di Mtb in macrofagi derivati da monociti e macrofagi alveolari e cellule THP-1 differenziate con PMA11,16,17. Questa tecnica può anche essere modificata per l'uso con cellule non aderenti12. Più recentemente, lo strumento è stato utilizzato anche in studi preclinici per valutare l'acido retin...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato dalla Science Foundation Ireland (SFI 08/RFP/BMT1689), dall'Health Research Board in Irlanda [HRA-POR/2012/4 e HRA-POR-2015-1145] e dal Royal City of Dublin Hospital Trust.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
IX51 Microscopio a fluorescenzaOlympus, GiapponeRilevamento e imaging N/A
microprovetta da 2 mL, fondo piatto, tappo a vite, sterileSarstedt, North Carolina, USA72.694.006Infezione da Mtb di macropaghi
Siringa da 5 mL, Luer lockBD Biosciences, San Jose, CA, USASZR-150-031KInfezione da Mtb di macropahges/CFU
Provetta da 50 mL, sterileSarstedt, Nord Carolina, USA62.547.254Infezione da Mtb di macropahges
all-trans-Retinoic Acid (ATRA) ≥ 98% (HPLC)Sigma Aldrich, Missouri, USAR2625Candidato alla terapia diretta all'ospite
Sistema di rilevamento microbico 3D BacT/ALERTBiomerieux (Hampshire, Regno Unito)247001Sistema di rilevamento colorimetrico basato su brodo
BACT/ALERT MP  Integratore di nutrienti BACT/ALERT MPBiomerieux (Hampshire, Regno Unito)414997Saggio di rilevamento colorimetrico basato sul brodo
Bottiglie di coltura BACT/ALERT MPBiomerieux (Hampshire, Regno Unito)419744Saggio di rilevamento colorimetrico basato sul brodo
BD BBL Middlebrook ADC Enrichment, 20 mLBD Biosciences, San Jose, CA, USAM0553Coltura liquida di Mycobacterium
BDL Middlebrook OADC Enrichment, 20mLBD Biosciences, San Jose, CA, USAM0678Unità formanti colonie
Raschietto cellulare, 25 cmSarstedt, North Carolina, USA83.1830Raccolta di lisati lmacrofagici
Filtro per siringa Corning, 0,2 &; mCorning Incorporated, Germania431219Sterilizzazione del tampone di lisi
Vetro di copertura (borosilicato), 24 x 50 mm, spessore #1,5VWR International Limited631 - 0147
Cicloesimide, dal microbicoSigma Aldrich, Missouri, USAC7698Unità formanti colonie
Dako Montaggio fluorescente medioAgilent Technologies Ireland LimitedS3023Antifade supporto di montaggio
Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfatoSigma Aldrich, Missouri, USAD8537Infezione da Mtb di macropaghi
Fetale Siero bovino, GibcoThermo Fisher, Massachusetts, USA10270106Coltura cellulare di macrofagi
Glicerolo, DifcoBD Biosciences, San Jose, CA, USA228220Unità formanti colonie
Hoescht 33342 (bisBenzimide H 33342 tricloridrato)Sigma Aldrich, Missouri, USAB2261Colorante nucleare
IFNγ,R& umano ricombinante D Systems Inc, Minnesota, USA285-IFCandidato alla terapia diretta all'ospite
Vetrino a camera a 2 pozzetti Labtek, sterile, NuncThermo Fisher, Massachusetts, USATKT-210-150RInfezione da Mtb di macropaghi
L-Asparagina, anidroSigma Aldrich, Missouri, USAA4159Unità formanti colonie
LinezolidSigma Aldrich, Missouri, USAPZ0014Antibiotico
Ago ipodermico Microlance 25 GBD Biosciences, San Jose, CA, USA300400Infezione da Mtb di macropahges/CFU
Middlebrook 7H10 Agar BaseBD Biosciences, San Jose, CA, USAM0303Unità formanti colonie
Middlebrook 7H9 Brodo BaseBD Biosciences, San Jose, CA, USAM0178Coltura liquida di micobatterio
Colorazione modificata O e decoloranteScientific Device Laboratory, IL, USA345-250Colorazione AFB
ParaformaldeideSigma Aldrich, Missouri, USA158127Infezione da Mtb di macropahges
Piastre di Petri, 92 x 16 mm (20/sacchetto)Sarstedt, North Carolina, USA82.1473.001Unità formanti colonie
Forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA)Sigma Aldrich, Missouri, USAP8139Coltura cellulare di macrofagi
Polisorbato 80, DifcoBD Biosciences, San Jose, CA, USA231181Mycobacterium coltura liquida
RPMI-1640, GibcoThermo Fisher, Massachusetts, USA52400025Coltura cellulare di macrofagi
Spalmatore di cellule sterili, a forma di LFisherbrand, Thermo Fisher, MA, USARB-44103Unità formanti colonie
Pallone T25 TC, collo angolato, tappo filtrante, sterile, NuncThermo Fisher, Massachusetts, USA156367Coltura liquida di Mycobacterium
Linea cellulare THP-1ATCC, Virginia, USAATCC TIB-202Coltura cellulare di macrofagi
AFB

Riferimenti

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