Articolo metodologico

Sequenziamento trasposone-inserzione come strumento per chiarire i fattori di colonizzazione batterica in un simbionte gladioli Burkholderia di Coleotteri Lagria villosa

DOI:

10.3791/62843

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12 agosto 2021

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1Department of Evolutionary Ecology, Institute of Organismic and Molecular Evolution, Johannes Gutenberg University, 2Department of Insect Symbiosis, Max Planck Institute for Chemical Ecology, 3Department of Plant and Environmental Sciences, Section for Organismal Biology, University of Copenhagen

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo è un metodo adattato per identificare i potenziali fattori di colonizzazione degli insetti in un simbionte benefico Burkholderia. L'ospite coleottero è infettato da una libreria mutante casuale generata tramite mutagenesi trasposone e la complessità della libreria dopo la colonizzazione viene confrontata con un controllo coltivato in vitro.

Abstract

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Dedurre la funzione dei geni manipolando la loro attività è uno strumento essenziale per comprendere le basi genetiche della maggior parte dei processi biologici. I progressi della microbiologia molecolare hanno visto l'emergere di diverse tecniche di mutagenesi per la manipolazione dei geni. Tra questi, il sequenziamento trasposone-inserzione (Tn-seq) è uno strumento prezioso per valutare contemporaneamente la funzionalità di molti geni candidati in modo non target. La tecnica è stata fondamentale per identificare i meccanismi molecolari per la colonizzazione degli ospiti eucariotici in diversi microbi patogeni e alcuni simbionti benefici.

Qui, Tn-seq è stabilito come metodo per identificare i fattori di colonizzazione in un simbionte mutualistico Burkholderia gladioli del coleottero Lagria villosa. Per coniugazione, l'inserimento mediato da trasposoni Tn5 di una cassetta di resistenza agli antibiotici viene effettuato in posizioni genomiche casuali in B. gladioli. Per identificare l'effetto delle interruzioni geniche sulla capacità dei batteri di colonizzare l'ospite coleottero, la libreria di trasposoni-mutanti B. gladioli generata viene inoculata sulle uova del coleottero, mentre un controllo viene coltivato in vitro in un terreno di coltura liquido. Dopo aver concesso tempo sufficiente per la colonizzazione, il DNA viene estratto dalle biblioteche coltivate in vivo e in vitro. Seguendo un protocollo di preparazione della libreria del DNA, i campioni di DNA vengono preparati per il sequenziamento di trasposone-inserimento. Vengono selezionati frammenti di DNA che contengono il bordo dell'inserto del trasposone e il DNA batterico fiancheggiante e i siti di mutazione sono determinati sequenziando lontano dal bordo dell'inserto del trasposone. Infine, analizzando e confrontando le frequenze di ciascun mutante tra le librerie in vivo e in vitro, è possibile prevedere l'importanza di specifici geni simbionti durante la colonizzazione dei coleotteri.

Introduzione

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Burkholderia gladioli può impegnarsi in un'associazione simbiotica con i coleotteri Lagria villosa, svolgendo un ruolo importante nella difesa contro gli antagonisti microbici dell'insetto ospite4,5,6. I coleotteri femminili ospitano diversi ceppi di B. gladioli in ghiandole specializzate accessorie al sistema riproduttivo. Al momento della deposizione delle uova, le femmine spalmano le cellule di B. gladioli sulla superficie dell'uovo dove i composti antimicrobici prodotti da B. gladioli inibiscono le infezioni da funghi entomopatogeni4,6. Durante lo sviluppo embrionale tardivo o all'inizio dopo la schiusa delle larve, i batteri colonizzano le invaginazioni cuticolari sulla superficie dorsale delle larve. Nonostante questa localizzazione specializzata e la via di trasmissione verticale dei simbionti, L. villosa può presumibilmente acquisire anche B. gladioli orizzontalmente dall'ambiente4. Inoltre, almeno tre ceppi di B. gladioli sono stati trovati in associazione con L. villosa4,6. Tra questi, B. gladioli Lv-StA è l'unico che è suscettibile di coltivazione in vitro.

B. gladioli Lv-StA ha una dimensione del genoma di 8,56 Mb6 e contiene 7.468 geni. Quale di questi geni è importante per i batteri B. gladioli per colonizzare l'ospite coleottero? Per rispondere a questa domanda, abbiamo usato il sequenziamento transposon-insertion (Tn-seq), un metodo esplorativo per identificare i geni microbici condizionatamente essenziali1,2,3. Una libreria mutante di B. gladioli Lv-StA è stata creata utilizzando un trasposone Tn5. Attraverso la coniugazione da cellule donatrici di Escherichia coli a B. gladioli Lv-StA, è stato trasferito un plasmide pRL27 che trasporta il trasposone Tn5 e una cassetta di resistenza agli antibiotici affiancata da ripetizioni invertite (Figura 1). In tal modo, è stato generato un insieme di mutanti che trasportano individualmente interruzioni di 3.736 geni simbionti (Figura 2).

Il pool mutante è stato infettato su uova di coleottero per identificare i fattori di colonizzazione e, come controllo, è stato anche coltivato in vitro nel mezzo B di King (KB). Dopo aver concesso un tempo sufficiente per la colonizzazione, le larve tratteggiate sono state raccolte e raggruppate per l'estrazione del DNA. Frammenti di DNA contenenti l'inserto di trasposone e la regione genomica fiancheggiante di B. gladioli Lv-StA sono stati selezionati utilizzando un protocollo di preparazione della libreria di DNA modificato per il sequenziamento. L'elaborazione della qualità della lettura seguita dall'analisi con DESeq2 è stata effettuata per identificare geni specifici cruciali per B. gladioli Lv-StA per colonizzare le larve di L. villosa quando trasmesse attraverso la superficie dell'uovo.

Protocollo

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1. Preparazione di supporti e buffer

  1. Preparare i supporti KB e LB e le piastre di agar come indicato nella Tabella 1e l'autoclave a 121 °C, 15 psi, 20 min.
    1. Aggiungere kanamicina sterilizzata con filtro da 50 μg/mL e acido 2,6-diaminopimemico (DAP) sterilizzato con filtro da 50 μM al mezzo LB autoclavato prima di coltivare E.coli WM3064 + pRL27.
    2. Aggiungere kanamicina sterilizzata con filtro da 50 μg/mL all'agar KB autoclavato per versare le piastre necessarie per selezionare i transconigiunti B. gladioli Lv-StA di successo.
  2. Preparare 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) mescolando i seguenti componenti: NaCl 8 g/L, KCl 0,201 g/L, Na2HPO4 1,42 g/L e KH2PO4 0,272 g/L. Sciogliere i sali in acqua distillata e autoclave la miscela a 121 °C, 15 psi, 20 min prima dell'uso. Conservare a temperatura ambiente.
  3. Preparare un tampone Bind-and-wash 2x sciogliendo i seguenti componenti: 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM di acido tetraacetico etilendiammina (EDTA) e 2 M NaCl in acqua distillata. Filtrare la miscela prima dell'uso. Conservare a temperatura ambiente.
  4. Preparare 1x Low-TE sciogliendo 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) e 0,1 mM EDTA in acqua a doppia distillazione. Sterilizzare in autoclave a 121 °C, 15 psi, 20 min. Conservare a temperatura ambiente.

2. Coniugazione per generare la libreria mutante di trasposoni

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Figura 1: Fasi del protocollo di coniugazione. Il ricevente di coniugazione Burkholderia gladioli Lv-StA (rosso) e il donatore Escherichia coli contenente il plasmide pRL27 (rosa) sono coltivati rispettivamente in KB agar e LB, integrati con kanamicina e DAP. Dopo il trasferimento coniugativo del plasmide per 12-18 ore a 30 °C, le cellule transconigiuntiche di B. gladioli vengono selezionate su KB contenenti kanamicina e raggruppate insieme. Abbreviazioni: DAP = acido 2,6-diaminopimelico; Kan = kanamicina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Sotto un cappuccio sterile, inoculare una coltura di donatore fresco di Escherichia coli WM3064 + pRL27 in 10 mL di lb media integrata con kanamicina e DAP. Cellule riceventi di Burkholderia gladioli Lv-StA inoculate in 5 mL di terreno KB. Incubare le colture a 30 °C durante la notte su uno shaker a 250 giri/min.
  2. Dopo la crescita durante la notte, centrifugare 4 mL di ciascuna delle colture a 9.600 × g per 6 minuti per pellettizzare le celle. Scartare il surnatante.
  3. Sotto un cappuccio sterile, lavare le colture cellulari pellette in un mezzo KB contenente DAP e infine risospenare le colture separatamente in 4 ml di terreno KB + DAP.
  4. In un tubo fresco da 15 ml, mescolare 250 μL delle cellule donatrici di E. coli lavate con 1 mL delle cellule riceventi B. gladioli Lv-StA lavate.
  5. Spot 10 μL di questa miscela di cellule di coniugazione su piastre di agar KB contenenti DAP. Lasciare riposare indisturbato la piastra nella cappa sterile a temperatura ambiente per 1 ora. Quindi, incubare le piastre con i punti di coniugazione a 30 °C per 12-18 ore.
    NOTA: Il periodo di coniugazione può essere regolato in base alla specie bersaglio. Tuttavia, un lungo periodo di coniugazione aumenta il rischio di doppie inserzioni o integrazione di plasmidi nel genoma. Per i batteri a crescita lenta, consentire periodi di coniugazione più lunghi.
  6. Dopo l'incubazione, aggiungere 2-4 ml di 1x PBS nelle piastre sotto un cappuccio sterile e utilizzare un raschietto cellulare per rilasciare i punti di coniugazione batterica cresciuti dall'agar. Pipettare la miscela di cellule coniugate in tubi da microfuga da 2 ml.
  7. Pellet le celle mediante centrifugazione a 9.600 × g per 2 min. Scartare il surnatante e lavare il pellet due volte in 1 mL di 1x PBS tubando su e giù. Spese di sospensione del pellet finale in 1200 μL di 1x PBS. Effettuare diluizioni prima della placcatura se il numero di cellule nella miscela è superiore a 1 × 104.
  8. Mescolare bene e distribuire 200 μL della miscela cellulare su grandi piastre di agar KB (6 o più, se necessario) integrate con kanamicina e incubare a 30 °C durante la notte.
    NOTA: le colonie mutanti bersaglio appaiono entro 30 ore sulle piastre di agar selettive. A causa del marcatore di resistenza agli antibiotici, solo le colonie mutate appaiono sulla piastra di agar selettiva. Pertanto, ci si aspetta che tutte le colonie siano transconiodicanti di successo.
  9. Contare il numero totale di colonie transconigiunte su tre piastre ed estrapolare per calcolare il numero approssimativo di mutanti ottenuti in tutte le piastre. Per aumentare le possibilità di ottenere una libreria rappresentativa, assicurarsi che il numero totale di colonie sia diverse volte superiore al numero totale di geni nel genoma. Per confermare il successo della coniugazione, eseguire una PCR mirata alla cassetta di inserimento utilizzando 10-20 colonie di campioni, come descritto nella sezione 3.
    NOTA: L'obiettivo è quello di garantire che il numero di colonie sia almeno 10 volte il numero di geni nell'intero genoma, in questo caso, > 75.000 mutanti. Tuttavia, è generalmente difficile stimare con precisione il numero di colonie che corrisponderebbero a una biblioteca pienamente rappresentativa. Il numero di geni unici mutati non è evidente a questo punto, dato che le interruzioni nei geni essenziali non vengono catturate, ci sono spesso più siti di mutazione diversi per lo stesso gene e le mutazioni generate con i trasposoni Tn5 non sono del tutto casuali.
  10. Sotto un cappuccio sterile, raschiare le colonie dalle piastre aggiungendo 1-2 ml di 1x PBS sull'agar. Mettere a piscina la miscela cellulare raschiata via dalle piastre in tubi da 50 ml. Vortex la libreria per mescolare accuratamente e poi dividere 4 mL della libreria mutante raggruppata in diversi criotubi. Aggiungere 1 mL di glicerolo al 70% alle provette e conservare a -80 °C.

3. PCR ed elettroforesi su gel per confermare il successo degli inserimenti in B. gladioli Lv-StA

  1. Per confermare la presenza dell'inserimento, selezionare le singole colonie mutanti dalle piastre di selezione nel passaggio 2.9 ed eseguire una PCR mirata alla cassetta di inserimento utilizzando i primer elencati nella Tabella 2. Preparare la miscela master PCR secondo la Tabella 3 e impostare le condizioni nel termociclatore come descritto nella Tabella 4.
  2. Eseguire i prodotti PCR su un gel di agarose all'1,6% mediante elettroforesi (250 V, 40 min) per verificare se i frammenti di DNA amplificati sono della lunghezza prevista di 1580 bp.

4. Infezione da piscina mutante su uova di coleottero

  1. Fasi di lavaggio della biblioteca
    1. Scongelare un'aliquota della libreria mutante preparata sul ghiaccio. Centrifugare a 2.683 × g per 10 minuti e rimuovere il surnatante. Sotto un cappuccio sterile, lavare le cellule con 4 mL di 1x PBS per rimuovere qualsiasi mezzo rimanente dalle cellule. Risuscindi le cellule in 4 mL di 1x PBS.
    2. Contare il numero di celle in un'aliquota della libreria utilizzando una camera di conteggio delle celle. Diluire una parte della libreria a 2 × 106 celle/μL in 1x PBS.
    3. Vortice l'aliquota della libreria accuratamente per mescolare l'intera libreria in modo omogeneo prima di prendere il volume richiesto.
  2. Sterilizzazione della frizione dell'uovo e infezione in vivo
    1. Seleziona una frizione per uova L. villosa. Contare il numero di uova e continuare se la frizione contiene più di 100 uova.
    2. Sterilizzare l'intera frizione dell'uovo.
      1. Aggiungere 200 μL di etanolo al 70% e lavare delicatamente le uova per 5 minuti. Rimuovere l'etanolo e lavare le uova due volte con acqua autoclavata.
      2. Aggiungere 200 μL di candeggina al 12% (NaOCl) e lavare delicatamente le uova per 30 s. Rimuovere immediatamente la candeggina e lavare nuovamente le uova tre volte con 200 μL di acqua autoclavata.
    3. Infettare 2 × 106 cellule/μL della libreria mutante lavata sulla frizione dell'uovo sterilizzata (2,5 μL per uovo).
    4. Due giorni dopo che le larve di coleottero infetto si schiudono, raccogliere 100larve di 2 ° instar per tubo di microfuga da 1,5 ml e conservare a -80 ° C.
  3. Controllo della libreria mutante in vitro
    1. Sotto un cappuccio sterile, inoculare 250 μL di 2 × 106 cellule/μL della libreria mutante lavata in 10 mL di mezzo KB contenente kanamicina.
    2. Incubare la coltura mutante in vitro a 30 °C per 20 ore.
      NOTA: Calcolare la durata dell'incubazione in base al numero approssimativo di generazioni di WT B. gladioli Lv-StA in vivo durante la colonizzazione.
    3. Dopo l'incubazione di 20 ore, aggiungere un volume uguale di glicerolo al 70% alla coltura mutante in vitro e conservarlo a -80 °C.

5. Coleotteri infetti ed estrazione del DNA della libreria mutante in vitro

NOTA: le estrazioni del DNA sono state eseguite utilizzando un kit di purificazione del DNA e dell'RNA secondo il protocollo del produttore brevemente delineato di seguito.

  1. Omogeneizzare le larve raggruppate (massimo 4 mg per tubo di microfuga) aggiungendo 1-2 ml di azoto liquido e schiacciando con un pestello.
  2. Scongelare le colture mutanti coltivate in vitro da stock di glicerolo sul ghiaccio. Pellet le celle centrifugando a 9.600 × g per 10 minuti prima della lisi cellulare.
  3. Aggiungere 300 μL di soluzione di lisi tissutale e cellulare ai campioni in vitro e in vivo. Aggiungere 5 μL di 10 mg/mL di Proteinasi K, incubare la miscela a 60 °C per 15 minuti, quindi mettere su ghiaccio per 3-5 minuti.
  4. Aggiungere accuratamente 150 μL di reagente di precipitazione proteica ai lizzate e al vortice. Pellet i detriti proteici centrifugando a 9.600 × g per 10 min.
  5. Trasferire il surnatante in un tubo di microfuga da 1,5 ml. Aggiungere 500 μL di isopropanolo al surnatante e invertire delicatamente i tubi almeno 40 volte prima di incubare a -20 °C per 1 ora o durante la notte.
  6. Pellet il DNA precipitato mediante centrifugazione a 9.600 × g per 10 min. Scartare il surnatante e aggiungere etanolo ghiacciato al 70% al pellet di DNA.
  7. Centrifuga a ≥10.000 × g per 5 min. Scartare il surnatante e lasciare asciugare i campioni all'aria per almeno 1 ora.
  8. Sospendare il DNA dai campioni in vitro e in vivo in 100 μL di tampone Low-TE.
  9. Conservare i campioni a -20 °C.

6. Preparazione della libreria di sequenziamento

NOTA: Il protocollo e i reagenti per la preparazione della libreria del DNA sono adattati e modificati dalle istruzioni fornite dal produttore del kit di preparazione della libreria del DNA.

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Figura 2: Schema delle fasi di preparazione della libreria del DNA. Dopo la tranciatura e la legatura dell'adattatore, il protocollo modificato include una fase di selezione delle perle di streptavitina per arricchire i frammenti di DNA contenenti la cassetta di inserimento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Diluire i campioni a una concentrazione di 20 ng/μL e un volume di 100 μL e tenerli sul ghiaccio.
  2. Taglio del DNA campione in vivo e in vitro utilizzando un ultrasuoni. Impostare l'ultrasuoni al 70% di potenza. Vorticosamente i campioni brevemente e cesoia per 1 min 30 s.
    NOTA: le impostazioni per l'ultrasuoni saranno diverse tra gli strumenti. In questo caso, la dimensione del frammento era di 200-400 bp, che è appropriata per questo approccio di sequenziamento di 150 bp, paired-end (vedi passo. 9.1). I parametri di taglio possono essere regolati in base alle esigenze dello sperimentatore.
  3. Controllare se il DNA è stato tranciato all'intervallo di dimensioni desiderato (in questo caso, 200-400 bp). Caricare 5 μL del DNA non scuoiato e tranciato dopo la miscelazione con colorante di carico del gel in un rapporto 1:1 su un gel di agarose all'1,6% a 250 V per 40 minuti (Figura 3A,B).
  4. Preparazione delle estremità del frammento necessarie per la legatura dell'adattatore
    1. A 50 μL di DNA tranciato, aggiungere i reagenti di preparazione finale indicati nel kit di preparazione della libreria: 3 μL della miscela enzimatica e 7 μL di tampone di reazione e mescolare bene mediante pipettaggio. Impostare un termociclatore con coperchio riscaldato a ≥ 75 °C e incubare i campioni per 30 minuti a 20 °C e 30 minuti a 65 °C. Tenere a 4 °C.
  5. Legatura dell'adattatore
    1. Per la legatura dell'adattatore, aggiungere i seguenti reagenti ai prodotti della fase di preparazione finale: 30 μL Ligation Master Mix, 1 μL Ligation Enhancer e 2,5 μL adattatore diluito. Mescolare accuratamente mediante pipettaggio e incubare il campione per 15 minuti a 20 °C nel termociclatore con il coperchio riscaldato spento.
    2. Dopo 15 min, aggiungere 3 μL dell'enzima (uracil DNA glicosilasi + DNA glicosilasi-liasi Endonucleasi VIII) (vedi tabella dei materiali). Mescolare bene mediante pipettaggio e incubare il campione per 15 minuti a 37 °C in un termociclatore con il coperchio riscaldato a ≥47 °C.
      NOTA: il protocollo può essere sospeso in questa fase e i campioni possono essere conservati a -20 °C.
  6. Selezione dimensionale di frammenti di DNA legati con adattatore di 250 bp
    1. Vorticare la soluzione di perle magnetiche (vedi tabella dei materiali)e posizionarla a temperatura ambiente per 30 minuti prima dell'uso.
    2. Aggiungere 0,3x di perle a 96,5 μL della miscela di DNA legato e mescolare pipettando accuratamente. Incubare la miscela di perle per 5 min.
      NOTA: La presenza di sali e polietilenglicole nella miscela di perline facilita la precipitazione di frammenti di DNA sulle perline. Un basso rapporto tra perle e molecole di DNA porta al legame solo di frammenti di DNA più grandi alle perle. In questo caso, i frammenti di DNA di lunghezza superiore a 250 bp sono legati alle perle.
    3. Posizionare i tubi su un supporto magnetico per tirare giù le perle e rimuovere frammenti di DNA di dimensioni indesiderate. Lasciare che le perle si depositino per 5 minuti e poi trasferire il surnatante chiaro in un nuovo tubo di microfuga (mantenere il surnatante).
    4. Aggiungere 0,15 volte le perle fresche al surnatante e mescolare pipettando bene. Incubare la miscela di perle per 5 minuti e quindi posizionare i tubi su un supporto magnetico per tirare giù le perle legate al DNA bersaglio. Attendere 5 minuti e poi scartare il surnatante (tenere le pere).
      NOTA: Questo rapporto tra pere e DNA porta al legame di frammenti della dimensione desiderata di 250 bp.
    5. Con le perle sul supporto magnetico, aggiungere 200 μL di etanolo all'80% (appena preparato) e attendere 30 s. Pipettare fuori e scartare l'etanolo lavare accuratamente senza disturbare le perle sul supporto magnetico. Ripetere questo passaggio.
    6. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere le tracce di etanolo dalle pere e quindi asciugare all'aria le pere per 2 minuti fino a quando non appaiono lucide ma non completamente asciutte. Non asciugare eccessivamente le pere.
    7. Rimuovere i tubi dal supporto magnetico e aggiungere 17 μL di 10 mM Tris-HCl o 0,1x TE (Low-TE). Mescolare per pipettaggio ~ 10 volte e incubare la miscela a temperatura ambiente per 2 minuti.
    8. Posizionare i tubi sul supporto magnetico e attendere 5 minuti. Una volta che le pere si sono depositate, trasferire il surnatante del DNA in un nuovo tubo.
  7. PCR I per aggiungere il tag biotina ai frammenti di DNA contenenti la cassetta di inserimento
    1. Aggiungere un tag primer biotinilato ai frammenti di DNA contenenti la cassetta di inserimento Tn5 utilizzando il primer biotinilato specifico per il trasposone (Tabella 5) e un primer indice. Preparare la miscela master PCR secondo la Tabella 6 e seguire le condizioni PCR per il termociclatore elencate nella Tabella 7.
  8. Pulizia della PCR I senza selezione delle dimensioni
    1. Vortice 0,9x perle e metterle a temperatura ambiente per almeno 30 minuti prima della pulizia.
    2. Aggiungere 0,9x perle ai prodotti PCR e mescolare accuratamente.
    3. Posiziona le perle su un supporto magnetico per tirare giù le perle.
    4. Rimuovere il surnatante trasparente e lavare due volte il DNA legato al perla con 200 μL di etanolo all'80% appena preparato.
    5. Rimuovere l'etanolo dopo le fasi di lavaggio e asciugare all'aria le pere fino a quando non sembrano lucide ma non troppo asciutte.
    6. Aggiungere 32 μL di 10 mM Tris-HCl o 0,1X TE (Low-TE) e incubare le perle per 5 min. Rimettere la miscela sul supporto magnetico e trasferire il surnatante in un tubo di microfuga fresco.
  9. Legare frammenti di DNA biotinilato alle perle di streptavitina
    1. Spese 32 μL di perle di streptavicina in 1x tampone Bind-and-wash. Lavare le perle con il tampone tre volte mentre vengono poste su un supporto magnetico.
    2. Aggiungere 32 μL di 2x tampone Bind-and-wash e risuscilare le perle. A questo, aggiungere 32 μL dei prodotti PCR 1 ripuliti. Mescolare accuratamente e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.
    3. Posizionare la miscela di perle-DNA su un supporto magnetico per 2 minuti. Pipettare il surnatante come DNA etichettato con biotina contenente il bordo di inserzione si lega alla streptavitina sulle perle.
    4. Lavare le perle con 500 μL di 1x tampone Bind-and-wash e quindi lavare le perle con 200 μL di Low-TE. Spese di sospensione delle perle legate al DNA in 17 μL di Low-TE.
  10. PCR II per aggiungere adattatori ai frammenti contenenti il bordo della cassetta di inserimento
    1. Preparare una miscela principale, come mostrato nella Tabella 8, utilizzando i primer indice e i primer PCR universali modificati elencati nella Tabella 5. Aggiungere 15 μL delle perle di streptavitina legate al DNA dal passaggio precedente al mix PCR. Vedere la Tabella 7 per le condizioni del ciclo termico.
  11. Pulire i prodotti PCR senza selezione delle dimensioni come indicato nel passaggio 6.8 di questo protocollo. Eluire i prodotti finali del DNA in 30 μL di acqua di grado molecolare.
  12. Conservare i campioni a -20 °C e utilizzarli per il sequenziamento.

7. Sequenziamento e analisi

  1. Sequenziare la libreria utilizzando la tecnologia di sequenziamento ad alta velocità effettiva. Regolare la profondità di sequenziamento in base alle dimensioni della libreria di trasposoni, come indicato di seguito. Valuta la qualità di lettura con FastQC7. Selezionate le letture contenenti lo spigolo di inserimento Tn5 all'estremità 5' della lettura e rimuovete la sequenza di spigoli di inserimento utilizzando Cutadapt8 e/o Trimmomatic9.
    NOTA: qui, è stato utilizzato un approccio di sequenziamento accoppiato per indirizzare 150 bp per lettura e un totale di 8 Mio di letture. Per ottenere un set di dati rappresentativo, assicurarsi che il numero totale di letture sequenziate superi il numero massimo possibile di mutanti nella libreria, ovvero il numero totale stimato di colonie dal passaggio 2.9. Come riferimento, questo protocollo mirava a 40 volte la dimensione massima possibile della libreria. Altri studi di successo che utilizzano Tn-seq per uno scopo simile hanno sequenziato un numero totale di letture vicino a 25 volte il numero effettivo di inserzioni uniche nella corrispondente libreria mutante22,23.
  2. Considerando che le mutazioni alle estremità dei geni non sono funzionalmente dirompenti, tagliare il 5% su entrambe le estremità delle annotazioni geniche del file GFF del genoma di riferimento. Mappare le letture tagliate al genoma di riferimento usando Bowtie210.
  3. Calcola il numero di inserimenti dal numero di posizioni univoche di 5' nel file BAM di allineamento.
  4. Utilizzando FeatureCounts11, ottenere il numero di geni colpiti per ogni campione replicato.
  5. Utilizzando il pacchetto DESeq212 in RStudio, calcola la differenza nelle abbondanze mutanti tra le diverse condizioni.

Risultati

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I batteri associati all'ospite possono impiegare diversi fattori per stabilire un'associazione, compresi quelli che mediano l'adesione, la motilità, la chemiotassi, le risposte allo stress o i trasportatori specifici. Mentre fattori importanti per le interazioni patogeno-ospite sono stati riportati per diversi batteri13,14,15,16,17,18,compresi i membri del genere Burkholderia19,20,meno studi hanno esplorato i meccanismi molecolari utilizzati dai simbionti benefici per la colonizzazione21,22,23 . Utilizzando il sequenziamento dell'inserzione di trasposoni, l'obiettivo era identificare i fattori molecolari che consentono a B. gladioli di colonizzare i coleotteri L. villosa.

La mutagenesi mediata dal trasposone è stata eseguita utilizzando il plasmide pRL27, che trasporta un trasposone Tn5 e una cassetta di resistenza alla kanamicina affiancata da siti di ripetizione invertita. Il plasmide è stato introdotto nelle cellule target B. gladioli Lv-StA mediante coniugazione con il ceppo E. coli WM3064 del donatore di plasmidi (come mostrato in Figura 1). Dopo la coniugazione, la miscela di coniugazione contenente cellule riceventi di B. gladioli e donatori di E. coli è stata placcata su piastre di agar selettive contenenti kanamicina. L'assenza di DAP sulle piastre ha eliminato le cellule di E. coli del donatore e la presenza di kanamicina selezionata per i transconigiunti B. gladioli Lv-StA di successo. La libreria di mutanti B. gladioli Lv-StA ottenuta dalla raccolta delle 100.000 colonie transconigiuchide è stata preparata per il sequenziamento utilizzando un kit di preparazione della libreria di DNA modificato e primer personalizzati. La Figura 2 evidenzia le fasi di preparazione della libreria del DNA. Il sequenziamento ha prodotto 4 Mio di letture accoppiate; 3.736 geni su 7.468 geni in B. gladioli Lv-StA sono stati interrotti.

Per identificare i mutanti che erano difettosi nella colonizzazione nell'ospite, la libreria mutante B. gladioli Lv-StA è stata infettata sulle uova di coleottero e coltivata in vitro in mezzo KB come controllo. La dimensione del collo di bottiglia della colonizzazione in vivo è stata calcolata prima dell'esperimento. Un numero noto di cellule di B. gladioli Lv-StA è stato infettato su uova di coleottero e il numero di cellule colonizzatrici in larve di prima stella appena nate è stato ottenuto placcando una sospensione da ciascuna larva e contando le unità formanti colonie per individuo. Questi calcoli sono stati fatti per garantire che il numero di cellule colonizzanti sia sufficiente per valutare tutti o un'alta percentuale dei mutanti nella libreria per la loro capacità di colonizzare l'ospite. Inoltre, il tempo di crescita tra condizioni in vitro e in vivo è stato normalizzato in base al numero di generazioni batteriche per rendere comparabili questi campioni.

Dopo la schiusa delle uova, 1.296 larve sono state raccolte in 13 piscine. Le corrispondenti colture mutanti in vitro sono state coltivate e conservate come scorte di glicerolo. Il DNA delle librerie mutanti cresciute in vivo e in vitro è stato estratto e frammentato in un ultrasuoni. La Figura 3 mostra la distribuzione dimensionale del DNA tranciato, dove la maggior parte dei frammenti si estende tra 100 e 400 bp, come previsto. Questo passaggio è stato seguito dal protocollo di preparazione della libreria del DNA modificato per il sequenziamento. In ogni fase del protocollo, la concentrazione di DNA rimanente è stata controllata per garantire che i passaggi siano stati eseguiti correttamente e per tracciare le perdite di DNA. Un controllo di qualità (vedi la Tabella dei Materiali)prima del sequenziamento ha rivelato che le librerie di DNA contenevano frammenti di DNA inaspettatamente grandi (>800 bp), e questo era più pronunciato nelle librerie in vivo. Data la difficoltà di ottimizzare il clustering dei frammenti nelle corsie di sequenziamento, è stato necessario aumentare la profondità di sequenziamento a 10 Mio di letture accoppiate nelle librerie in vivo per raggiungere il numero desiderato di letture. L'analisi dei risultati del sequenziamento ha rivelato che una media di 4 Mio di letture nelle librerie in vivo e 3,1 Mio di lettura nelle librerie in vitro contenevano il bordo di Transposon nella fine di 5' di Read-1(Tabella 9),il che era soddisfacente per questo esperimento. La distribuzione delle 24.224 inserzioni uniche attraverso il genoma di B. gladioli nella libreria originale è mostrata nella Figura 4. Un'analisi condotta utilizzando DESeq2 ha rivelato che l'abbondanza di 271 mutanti era significativamente diversa tra le condizioni in vivo e in vitro.

figure-results-1
Figura 3: Gel di acarosio di un mutante e librerie di DNA. (A) Gel di agarose con DNA non segnato di un mutante in corsia x e una scala da 1 kbp per la scala. (B) Gel con libreria di DNA tranciato. Le dimensioni della banda della scala nella prima corsia sono indicate sul lato sinistro. Le prime tre corsie a, b e c contengono frammenti di DNA tranciati delle librerie in vivo. Le corsie d, e, f e g contengono frammenti di DNA tranciati delle librerie in vitro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 4: Posizione di siti di inserzione unici nella biblioteca originale attraverso i quattro replicons nel genoma Burkholderia gladioli Lv-StA. Ogni barra lungo l'asse x si trova in un sito di inserimento. L'altezza di una barra lungo l'asse y corrisponde al numero di letture associate a quel sito. Si noti che i due cromosomi e due plasmidi sono mostrati a tutta lunghezza e quindi hanno scale diverse sull'asse x. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

King's B medio/ agar
Peptone (soia)20 g/L
K2HPO4 1,5 g/L
MgSO4.7H2O1,5 g/L
Agar15 g/L
Disciolto in acqua distillata
LB medio/agar
Triptone10 g/L
Estratto di lievito5 g/L
NaCl10 g/L
Disciolto in acqua distillata

Tabella 1: Componenti multimediali.

No.PrimerSequenzaTemperatura di ricottura PCR (°C)
1tpnRL17-1RC5'-CGTTACATCCCTGGCTTGTT-3'58.2
2tpnRL13-2RC5'-TCGTGAAGAAGGTGTTGCTG-3'

Tabella 2: Primer per confermare il successo della coniugazione.

ComponenteVolume (μL)
Acqua purificata hpLC4.92
10x Buffer S (alta specificità)1
MgCl2 (25 mM)0.2
dNTPs (2 mM)1.2
Primer 1 (10 pmol/μL)0.8
Primer 2 (10 pmol/μL)0.8
Taq (5 U/μL)0.08
Mastermix totale9
Sagoma1

Tabella 3: Master mix PCR per confermare il successo della coniugazione. Abbreviazioni: HPLC = cromatografia liquida ad alte prestazioni; dNTPs = deossinucleoside trifosfato.

PassiTemperatura °COreCicli
Denaturazione iniziale953 minuti1
Denaturazione9540 anni
Ricottura58.240 annida 30 a 35 anni
Estensione721-2 minuti
Estensione finale724 minuti1
Tenere4∞

Tabella 4: Condizioni PCR per confermare il successo della coniugazione.

PrimerSequenzaTm °CUsareFonte
Primer biotinilato specifico per il trasposone5'-Biotina-ACAGGAACACTTAACGGCTGACATG
-3'		63.56.7.1. PCR ICostume
Primer PCR universale modificato5'- AATGATACGGCGACCACCGAGATC
TACACTCTTTCCCTACACGACGCTC
TTCCGATCTGAATTCATCGATGATGAT
GGTTGAGATGTGT – 3'		626.10.1. PCR IICostume
Introduzione all'indiceFare riferimento al manuale del produttore6.7.1. PCR I e 6.10.1. PCR IINEBNext Multiplex Oligos per Illumina (Index primers set 1)
AdattatoreFare riferimento al manuale del produttore6.5. Legatura dell'adattatoreKit di preparazione della libreria DNA NEBNext Ultra II per Illumina

Tabella 5: Primer e adattatore per PCR I e II durante la preparazione della libreria del DNA.

Mix PCR(μL)
Frammenti di DNA legati all'adattatore15
NEBNext Ultra II Q5 master mix25
Indice primer (10 pmol/ μL)5
Primer biotinilato specifico per il trasposone (10 pmol/μL)5
Volume totale50

Tabella 6: Preparazione della libreria del DNA -PCR I master mix.

PassiTemperaturaOreCicli
Denaturazione iniziale98 °C30 anni1
Denaturazione98 °C10 s6 a 12
Ricottura65 °C30 anni
Estensione72 °C30 anni
Estensione finale72 °C2 minuti1
Tenere16 °C∞

Tabella 7: Preparazione della libreria del DNA -Condizioni PCR I e II.

Mix PCR(μL)
DNA selezionato per perle15
NEBNext Ultra II Q5 master mix25
Introduzione all'indice5
Primer PCR universale modificato5
Volume totale50

Tabella 8: Preparazione della libreria del DNA -Mix masterPCR II.

BibliotecheInvivo-1 ·Invivo-2 ·Invivo-3 ·Invitro-1Invitro-2Invitro-3Biblioteca originale
No. di letture (PE)56,57,71039,19,05130,65,84935,73,49428,83,44036,61,95646,09,410
No. di letture contenenti Tn – bordo su 5' fine di Read-154,15,88037,31,16929,36,24733,00,49927,35,70533,50,40241,53,270
Bowtie2 tasso di allineamento complessivo (%) (solo Read-1)95.53%83.71%89.87%80.79%78.00%73.06%74.92%
Numero di inserimenti univoci8,5394,1347,18318,93018,42120,43824,224
Numero di geni colpiti157599314502793259730373736

Tabella 9: Riepilogo dell'output di sequenziamento e della frequenza di inserimento del trasposone per libreria. Abbreviazione: PE = paired-end.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

È stata generata una libreria mutante di trasposone di B. gladioli per identificare importanti fattori di colonizzazione dell'ospite nell'interazione simbiotica tra coleotteri L. villosa e batteri B. gladioli. I passaggi principali del protocollo sono stati la coniugazione, l'infezione dell'ospite, la preparazione della libreria del DNA e il sequenziamento.

Poiché molti ceppi di Burkholderia sono suscettibili di modificazione genetica mediante coniugazione24,25,il plasmide che trasporta il trasposone e la cassetta di inserimento antibiotico è stato coniugato con successo nel ceppo target B. gladioli Lv-StA di E. coli. I precedenti tentativi di trasformazione mediante elettroporazione hanno prodotto molto bassi o quasi nessun trasformanti di B. gladioli. Si consiglia di ottimizzare la tecnica di trasformazione per l'organismo bersaglio per produrre in modo efficiente un gran numero di trasformanti.

Un ciclo di coniugazione e 40 punti di coniugazione hanno interrotto 3.736 geni in B. gladioli Lv-StA. Col senno di poi, sarebbero necessari più cicli di coniugazione per interrompere la maggior parte dei 7.468 geni e ottenere una libreria satura. In particolare, il tempo di incubazione durante la coniugazione non è stato permesso di superare le 12-18 ore, che è la fine della fase di crescita esponenziale di B. gladioli. Consentire la coniugazione oltre la fase di crescita esponenziale delle cellule batteriche riduce le possibilità di successo di ottenere transconigiunti26. Pertanto, il periodo di coniugazione deve essere regolato in base alla crescita delle specie batteriche.

Per eseguire con successo un esperimento che coinvolge l'infezione di librerie mutanti in un ospite, è importante valutare la dimensione del collo di bottiglia della popolazione batterica durante la colonizzazione e la diversità dei mutanti nella libreria prima dell'infezione1,2,27. In preparazione per l'esperimento, abbiamo stimato il numero minimo di coleotteri che devono essere infettati per avere un'alta probabilità che ogni mutante nella biblioteca venga campionato e lasciato colonizzare. Sono stati calcolati anche il tempo approssimativo di generazione batterica in vivo e il numero di generazioni per la durata dell'esperimento. La coltura in vitro è stata poi cresciuta fino a un numero comparabile di generazioni regolando il tempo di incubazione. Per un esperimento di infezione simile in altri ospiti non modello, è auspicabile la capacità di mantenere una coltura di laboratorio e una fonte costante degli organismi ospiti.

A seguito della crescita della libreria mutante in vivo e in vitro e della raccolta di campioni, è stato effettuato un protocollo di preparazione della libreria di DNA modificato per il sequenziamento dell'inserzione di trasposoni. La modifica del protocollo ha comportato la progettazione di primer PCR personalizzati e l'aggiunta di passaggi PCR per selezionare i frammenti di DNA contenenti la cassetta di inserimento. Poiché il protocollo è stato personalizzato, cicli PCR aggiuntivi nel protocollo hanno aumentato il rischio di sovraesplosione e di ottenere frammenti ibridi adattatore-adattatore nelle librerie finali. Quindi, si consiglia una fase di pulizia finale (senza selezione delle dimensioni) dopo le due PCR, in quanto aiuta a rimuovere questi frammenti. La distribuzione dimensionale delle librerie di DNA era ancora più ampia del previsto. Tuttavia, l'aumento della profondità di sequenziamento ha fornito dati sufficienti che sono stati filtrati durante l'analisi bioinformatica, ottenendo risultati soddisfacenti.

Poiché la mutagenesi mediata dal trasposone genera migliaia di inserzioni casuali in un singolo esperimento, è possibile generare una libreria satura di mutanti che contiene tutti tranne quei mutanti in cui i geni essenziali per la crescita batterica sono stati interrotti. Molto probabilmente non abbiamo lavorato con una libreria mutante satura, date le stime dei geni essenziali in altri studi su Burkholderia sp. 28,29. Una libreria non satura aiuta tuttavia ad esplorare vari geni candidati per ulteriori studi utilizzando la mutagenesi mirata. Prima degli esperimenti, è anche importante ricordare che alcuni trasposoni hanno specifici siti bersaglio di inserzione che aumentano l'abbondanza di mutanti in determinati loci nel genoma30. I trasposoni Mariner sono noti per colpire i siti AT per l'inserzione31e i trasposoni Tn5 hanno un bias GC32,33. Includere passaggi durante l'analisi bioinformatica per riconoscere gli hotspot per gli inserimenti di trasposoni aiuterà a valutare qualsiasi bias di distribuzione.

Sebbene soggetto a battute d'arresto, un esperimento di sequenziamento dell'inserzione di trasposone ben progettato può essere un potente strumento per identificare molti geni condizionatamente importanti nei batteri all'interno di un singolo esperimento. Ad esempio, una dozzina di geni in Burkholderia seminalis importanti per la soppressione della necrosi delle foglie di orchidea sono stati identificati combinando mutagenesi trasposone e genomica34. Oltre alla Burkholderia,diversi geni e trasportatori di adesione e motilità sono stati identificati come importanti fattori di colonizzazione nei simbionti di Snodgrassella alvi di Apis mellifera (Ape mellifera)22e nei simbionti Vibrio fischerii di Euprymna scolopes (calamari bobtail hawaiani)23 utilizzando l'approccio di mutagenesi trasposone-inserzione.

Come approccio alternativo, la mutagenesi del trasposone può essere seguita dallo screening per i singoli mutanti utilizzando mezzi selettivi invece del sequenziamento. Sono possibili screening fenotipici o biosaggi per identificare carenze, come la motilità, la produzione di metaboliti secondari bioattivi o auxotrofie specifiche. Ad esempio, lo screening di una libreria mutante di trasposone burkholderia insecticola (riassegnata al genere Caballeronia35)è stata fondamentale per identificare che i simbionti impiegano geni di motilità per colonizzare Riptortus pedestris, il loro ospite insetto36. Inoltre, utilizzando la mutagenesi trasposonica e lo screening fenotipico, il cluster di geni biosintetici per il metabolita secondario bioattivo carioinencina è stato identificato in Burkholderia caryophylli37. Un mutante auxotrofico di Burkholderia pseudomallei è stato identificato dopo mutagenesi e screening del trasposone ed è un possibile candidato vaccino attenuato contro la melioidosi, una malattia pericolosa nell'uomo e negli animali38. Pertanto, la mutagenesi e il sequenziamento del trasposone sono un approccio prezioso nello studio dei tratti molecolari dei batteri che sono importanti per le interazioni con i rispettivi ospiti in associazioni patogene o mutualistiche.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi relativo allo studio.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Siamo grati a Junbeom Lee per aver fornito il ceppo E. coli WM3064 + pRL27 per la coniugazione e la guida nella procedura, Kathrin Hüffmeier per aver aiutato con la risoluzione dei problemi durante la generazione della libreria mutante e il Prof. André Rodrigues per supportare la raccolta degli insetti e l'acquisizione dei permessi. Ringraziamo anche Rebekka Janke e Dagmar Klebsch per il supporto nella raccolta e nell'allevamento degli insetti. Riconosciamo le autorità brasiliane per aver concesso i seguenti permessi per l'accesso, la raccolta e l'esportazione di esemplari di insetti: autorizzazione SISBIO Nr. 45742-1, 45742-7 e 45742-10, processo CNPq nº 01300.004320/2014-21 e 01300.0013848/2017-33, IBAMA Nr. 14BR016151DF e 20BR035212/DF). Questa ricerca è stata sostenuta da finanziamenti della German Science Foundation (DFG) Research Grants FL1051/1-1 e KA2846/6-1.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
2,6- Acido DiaminopimelicoAlfa AesarB22391Per E.coli WM3064+ pRL27
Agar - AgarRoth5210
AgarosioBiozym840004
AMPure beads XP (perle magentiche + polietilenglicole + sali)Beckman CoulterA63880Selezione della taglia al passaggio 6.6
Candeggina (NaOCl) 12%Roth9062
Bowtie2 v.2.4.2Strumento bioinfromatico per la lettura della mappatura. Riferimento 10 nel manoscritto principale.
Buffer-SPeqlabPEQL01-1020Per PCR
Raschietto cellulareSarstedt83.1830
Cutadapt v.2.10Strumento bioinformatico per la rimozione di sequenze di adattatori specifici dalle letture. Riferimento 8 nel manoscritto principale.
Pacchetto RStudio DESeq2per la valutazione dell'abbondanza differenziale dei mutanti. Solitamente utilizzato per l'analisi dell'RNAseq. Riferimento 12 nel manoscritto principale.
Scala DNA 100 bpRothT834.1
dNTPTechnologyR0182PCR per confermare il successo della coniugazione
EDTA, sale disodicoRoth8043
Epicentre MasterPure Kit completo di purificazione del DNA e dell'RNALucigenMC85200
Bromuro di etidioRoth2218.1
FastQC v.0.11.8Strumento bioinformatico per la valutazione della qualità dei dati di sequenziamento. Riferimento 7 nel manoscritto principale.
FeatureCounts v.2.0.1Strumento bioinformatico per ottenere conteggi di lettura per caratteristica genomica. Riferimento 11 nel manoscritto principale.
GliceroloRoth7530
K2HPO4RothP749
Kanamicina solfatoServa26899
KClMerck4936
KH2PO4Roth3904
MgSO4.7H2ORothPO27
Na2HPO4RothP030
NaClMerck6404
NEBNext Multiplex Oligos per Illumina (Index primers set 1)New England BiolabsE7335S
NEBNext Ultra II DNA library prep kit per IlluminaNew England BiolabsE7645S
Peptone (soia)Roth2365Per Burkholderia gladioli Lv-StA KB-medium
peqGOLD 'Hot' Taq- DNA polimerasiVWRPEQL01-1020PCR per confermare il successo della coniugazione
Piastre di Petri - 145 x 20 mmRothXH90.1Per la selezione di piastre di Petri transconiuganti
- 90 x 16 mmRothN221.2
Qiaxcel (StarSEQ GmbH, Germania)Controllo di qualità dopo la preparazione della libreria di DNA
Perle di streptavidinaRothHP57.1
Taq DNA polimerasiVWR01-1020
Trimmomatic v.0.36Strumento bioinformatico per il taglio di letture di bassa qualità e anche sequenze di adattatori. Riferimento 9 nel manoscritto principale.
Tris -HClRoth9090.1
TriptoneRoth2366Per Escherichia coli WM3064+pRL27 LB Ultrasuoni medi
BandelinGM 70 HDPer il taglio
dell'enzima USER (uracile DNA glicosilasi + DNA glicosilasi-liasi Endonucleasi VIII)New England BiolabsE7645SFase di legatura 6.5.2
Estrattodi lievitoRoth2363
Life

Riferimenti

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