Il protocollo descrive la formazione di microcapsule robuste e biocompatibili cariche di DNA come biosensori in vitro multiplex in grado di tracciare diversi ligandi.
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Articolo metodologico
Preparazione di microcapsule multifunzionali a base di seta caricate con plasmidi di DNA codificanti aptameri e ribointerruttori RNA
In questo articolo
Sommario
Abstract
Introduciamo un protocollo per la preparazione di microcapsule di fibroina di seta cariche di DNA tramite il metodo di assemblaggio Layer-by-Layer (LbL) su nuclei sferici sacrificali. Dopo l'adsorbimento di uno strato primario e plasmidi di DNA, la formazione di microcapsule robuste è stata facilitata inducendo fogli di β nella struttura secondaria della seta durante la disidratazione acuta di un singolo strato di seta. Quindi, la stratificazione è avvenuta tramite legami idrogeno multipli e interazioni idrofobiche. Dopo l'adsorbimento di gusci multistrato, le strutture del guscio centrale possono essere ulteriormente funzionalizzate con nanoparticelle d'oro (AuNP) e / o anticorpi (IgG) da utilizzare per il telerilevamento e / o la consegna mirata. La regolazione di diversi parametri chiave durante la deposizione sequenziale di macromolecole chiave su nuclei di silice come la presenza di un primer polimerico, la concentrazione di DNA e proteine della seta, nonché un numero di strati adsorbiti ha portato a microcapsule biocompatibili, cariche di DNA con permeabilità e carichi di DNA variabili. Dopo la dissoluzione dei nuclei di silice, il protocollo ha dimostrato la formazione di microcapsule cave e robuste con plasmidi di DNA immobilizzati sulla superficie interna della membrana della capsula. La creazione di una membrana biocompatibile selettivamente permeabile tra i plasmidi del DNA e l'ambiente esterno ha preservato il DNA durante la conservazione a lungo termine e ha svolto un ruolo importante nel miglioramento della risposta di uscita dai plasmidi spazialmente confinati. L'attività dei modelli di DNA e la loro accessibilità sono state testate durante le reazioni di trascrizione e traduzione in vitro (sistemi cell-free). I plasmidi del DNA che codificano aptameri e riboswitch di illuminazione dell'RNA sono stati attivati con successo con analiti corrispondenti, come è stato visualizzato durante la localizzazione di trascritti di RNA marcati con fluorescenza o proteina GFPa1 nelle membrane del guscio.
Introduzione
Il campo della biologia sintetica offre opportunità uniche per sviluppare capacità di rilevamento sfruttando meccanismi naturali evoluti dai microrganismi per monitorare il loro ambiente e le potenziali minacce. È importante sottolineare che questi meccanismi di rilevamento sono tipicamente legati a una risposta che protegge questi microrganismi dall'esposizione dannosa, regolando l'espressione genica per mitigare gli effetti negativi o prevenire l'assunzione di materiali tossici. Ci sono stati sforzi significativi per progettare questi microrganismi per creare sensori a cellule intere sfruttando queste risposte naturali ma reindirizzandoli a riconoscere nuovi bersagl....
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Protocollo
1. Costruzione del vettore plasmide.
- Costruire un vettore plasmidico (pSALv-RS-GFPa1, 3.4 kb) mediante amplificazione della sequenza codificante di un riboswitch teofillina (ThyRS) accoppiato con GFPa1 dal vettore pJ201:23976-RS-GFPa1 (progettato e creato da DNA2.0) e inserimento nel vettore di espressione di E. coli , pSAL13. Utilizzare primer diretti (5'-CGTGGTACCGGTGATACCAGCATCGTCTTGATG-3') e inversi (5'-CGTGCTCAGCTTAAGCCAGCTCGTAG-3') per amplificare la sequenza codificante di ThyRS accoppiato con GFPa1 ed eseguire una reazione PCR in volume di 50 μL utilizzando DNA polimerasi secondo il protocollo14
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Risultati
Qui, lo studio affronta la funzionalità dei modelli di DNA che codificano diversi design di sensori (due tipi di elementi di trascrizione/traduzione regolati dall'RNA) dopo l'incapsulamento in capsule proteiche della seta. Le microcapsule sono state preparate tramite un assemblaggio Layer-by-Layer (LbL) modellato dei componenti chiave: uno strato primo, plasmidi di DNA che codificano i progetti dei sensori e biopolimero di fibroina di seta (Figura 2). La deposizione di macromolecole in modo .......
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Discussione
Le microcapsule di idrogel selettivamente permeabili caricate con vari tipi di sensori codificati dal DNA possono essere preparate seguendo questo protocollo. Una delle caratteristiche distintive dell'approccio LbL è la capacità di adattare la complessità delle microcapsule durante l'assemblaggio bottom-up, che di solito inizia con l'adsorbimento di specie molecolari su modelli sacrificali. Regolando attentamente le concentrazioni dei componenti iniziali, le condizioni di pH e il numero di strati, è possibile preparare m.......
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Dichiarazioni
I punti di vista e le opinioni qui presentati sono quelli degli autori e non rappresentano necessariamente i punti di vista del DoD o dei suoi componenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione LRIR 16RH3003J dell'Air Force Office of Scientific Research, nonché dal programma Synthetic Biology for Military Environments Applied Research for the Advancement of S&T Priorities (ARAP) dell'Ufficio del Sottosegretario alla Difesa degli Stati Uniti per la Ricerca e l'Ingegneria.
La sequenza del vettore plasmidico per ThyRS (pSALv-RS-GFPa1, 3.4 kb) è stata generosamente fornita dal Dr. J. Gallivan. I bozzoli del baco da seta di Bombyx mori sono stati generosamente donati dal Dr. D.L. Kaplan della Tufts University, MA.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| (Z)-4-(3,5-difluoro-4-idrossibenzilidene)-2-metil-1-(2,2,2-trifluoroetil)-1H-imidazol-5(4 H)-one (DFHBI-1T) | Lucerna | DFHBI-1T | |
| 5x T4 DNA ligasi tampone | ThermoFisher Scientific | 46300-018 | |
| 6x colorante di caricamento su gel blu | New England BioLabs | B7021S | |
| piastre a 96 pozzetti, circolari nere | Corning | 3601 | |
| Agarosio | Sigma-Aldrich | A9539 | BioReagent, per biologia molecolare, |
| sale sodico di ampicillina | Sigma-Aldrich | A0166 | polvere o cristalli, BioReagent, adatto per colture cellulari |
| Enzimi di restrizione BlpI | New England BioLabs | R0585S | |
| Corning Filtro sottovuoto monouso / Sistemi di stoccaggio | FisherScientific | 09-761-1 | |
| Dimetilsolfossido, DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | reagente ACS, ≥ 99,9% |
| Plasmide di DNA, pET28c-F30-2x Broccoli (5,4 kb), BrocApt. | Addgene | Plasmid #66788 | |
| DyLightTM550 Kit di marcatura degli anticorpi (Invitrogen) | ThermoFisher Scientific | 84530 | |
| Sistema di estrazione di E. coli S30 per DNA circolare | Provette | L1020 | |
| Falcon, 15 mL | FisherScientific | 14-959-53A | |
| Provette da centrifuga coniche Falcon, 50 mL | 14-432-22 | ||
| Fisherbrand Provette per microcentrifuga, 1,5 mL | FisherScientific | 05-408-129 | |
| Acido fluoridrico, reagente HF | Sigma-Aldrich | 695068 | ACS, 48% |
| di Kanamicina solfato | Sigma-Aldrich | 60615 | miscela di Kanamicina A (componente principale) e Kanamicina B e C |
| Enzimi di restrizione KpnI | New England BioLabs | R0142S | |
| Piastra di agar LB integrata con 100 µ g/mL di ampicillina | Sigma-Aldrich | L5667 | piastre di agar pre-versate con 100 µ g/mL |
| di piastra agar ampicillina LB integrata con 50 µ g/mL di kanamicina | Sigma-Aldrich | L0543 | piastre di agar pre-versate con 50 µ g/mL di brodo di kanamicina |
| LB (grado Lennox) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Bromuro di litio, LiBr | Sigma-Aldrich | 213225 | ReagentPlus, ≥ 99% |
| Efficienza massima DH5-&alfa; ceppo di E. coli competente | ThermoFisher Scientific | 18258012 | |
| Metanolo | MilliporeSigma | 322415 | anidro, 99,8% |
| MilliQ-acqua | EMD MilliPore | Milli-Q Sistema di purificazione dell'acqua di riferimento | |
| MinElute Kit di purificazione PCR | Qiagen | 28004 | |
| N-(3-Dimetilamminopropil)-N′-etilcarbodiimmide cloridrato, EDC | Sigma-Aldrich | E1769 | |
| PBS (soluzione salina tamponata con fosfato) | ThermoFisher Scientific 10010023 | 1x PBS, pH 7,4 | |
| Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltà | New England Biolabs | M0530S | |
| Polietilenimmina, | Sigma-Aldrich | 408727 | Mw medio ~25.000 |
| Kit di sintesi proteica in vitro PURExpress Kit di estrazione su | New England BioLabs | E6800S | |
| QIAEX II | Qiagen | 20021 | |
| Kit di miniprep QIAprep Spin | Qiagen | 27104 | |
| Scala DNA a 2 log a caricamento rapido (0,1-10,0 kb) | New England BioLabs | N0469S | |
| SiO? Microsfere di silice, 4,0 &; m | Poliscienze, Inc. | 24331-15 | Soluzione acquosa al 10% |
| Cassette per dialisi Slide-A-Lyzer G2, 3,5K MWCO, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 87724 | |
| Carbonato di sodio, Na?CO? | Sigma-Aldrich 222321 | reagente ACS, anidro, ≥ 99,5%, polvere | |
| Spectra/Por Float-A-Lyzer G2 Dispositivi per dialisi | FisherScientific | 08-607-008 | Spettro G235058 |
| SYBR Sicuro DNA gel colorante | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| T4 DNA ligasi (5 U/µ L) | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
| Teofillina | Sigma-Aldrich | T1633 | anidra, ≥ 99%, polvere |
| Tris acetato-tampone EDTA (tampone TAE) | Sigma-Aldrich | T6025 | Contiene 40 mM di Tris-acetato e 1 mM di EDTA, pH 8,3. |
| Acqua distillata ultrapura senza DNasi/RNasi | FisherScientific | 10-977-023 | |
| Kit MaxiPrep per plasmidi ZymoPURE II | ZymoResearch | D4202 |
Riferimenti
- Slomovic, S., Pardee, K., Collins, J. J. Synthetic biology devices for in vitro and in vivo diagnostics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14429-14435 (2015).
- Harbaugh, S. V., Goodson, M. S., Dillon, K., Zabarnick, S., Kelley-Loughnane, N.
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Ristampe e permessi
