Saggio delle idrolasi nucleosidiche trifosfato in Toxoplasm gondii e Neospora caninum per lo screening ad alto rendimento utilizzando un braccio robotico

Riho Kurata; Masamitsu Harada; Jun Nagai; Xiaofeng Cui; Takayuki Isagawa; Hiroaki Semba; Yasuhiro Yoshida; Norihiko Takeda; Koji Maemura; Tomo Yonezawa

doi:10.3791/62874

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Articolo metodologico

Saggio delle idrolasi nucleosidiche trifosfato in Toxoplasm gondii e Neospora caninum per lo screening ad alto rendimento utilizzando un braccio robotico

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DOI:

10.3791/62874

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22 luglio 2022

Riho Kurata^*¹ , Masamitsu Harada^*² , Jun Nagai^*³ , Xiaofeng Cui^*⁴ , Takayuki Isagawa⁵ , Hiroaki Semba⁶ , Yasuhiro Yoshida⁷ , Norihiko Takeda⁸ , Koji Maemura⁹ , Tomo Yonezawa³

¹Education and Research Center for Pharmaceutical Sciences, Faculty of Pharmacy, Osaka Medical and Pharmaceutical University, ²Independent Scholar, Tokyo, Japan, ³Division of Functional Genomics and Therapeutic Innovation, Research Center for Advanced Genomics, Graduate School of Biomedical Sciences, Nagasaki University, ⁴School of Chemistry, Chemical Engineering and Life Sciences, School of Materials and Engineering, Wuhan University of Technology, ⁵Data Science Center, Jichi Medical University, ⁶Department of Cardiovascular Medicine, The Cardiovascular Institute, ⁷Department of Immunology and Parasitology, University of Occupational and Environmental Health, ⁸Division of Cardiology and Metabolism, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical University, ⁹Department of Cardiovascular Medicine, Graduate School of Biomedical Sciences, Nagasaki University Hospital

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Le infezioni da Toxoplasma gondii e Neospora caninum si riscontrano nell'uomo e negli animali e portano a gravi problemi di salute. I due parassiti condividono nucleosidi trifosfato idrolasi simili e svolgono un ruolo importante nella propagazione e nella sopravvivenza. Abbiamo stabilito un test di alto livello degli enzimi che richiedono l'uso di un braccio robotico.

Abstract

I parassiti protozoi infettano gli esseri umani e molti animali a sangue caldo. Il Toxoplasma gondii, un importante parassita protozoo, si trova comunemente nei pazienti sieropositivi, nei riceventi di trapianto di organi e nelle donne in gravidanza, causando la grave condizione di salute della toxoplasmosi. Un altro importante protozoo, Neospora caninum, che ha molte somiglianze con il Toxoplasma gondii, causa gravi malattie negli animali, così come l'encefalomielite e la miosite-poliradicolite nei cani e nelle mucche, con conseguente nascita di vitelli morti. Tutti questi presentavano nucleosidi trifosfato idrolasi (NTPasi) simili. Neospora caninum ha una NcNTPasi, mentre Toxoplasma gondii ha una TgNTPasi-I. Si ritiene che gli enzimi svolgano un ruolo cruciale nella propagazione e nella sopravvivenza. Al fine di stabilire composti e/o estratti che prevengano l'infezione da protozoi, abbiamo preso di mira questi enzimi per la scoperta di farmaci. Il passo successivo è stato quello di stabilire un nuovo test, altamente sensibile e altamente accurato, combinando un test enzimatico biochimico convenzionale con un test fluorescente per determinare il contenuto di ADP. Abbiamo anche convalidato che il nuovo test soddisfa i criteri per eseguire lo screening ad alto rendimento (HTS) nei due enzimi protozoari. Abbiamo eseguito l'HTS, identificato 19 composti e sei estratti da due librerie di composti sintetici e una libreria di estratti derivati da batteri marini, rispettivamente. In questo studio, è stata introdotta una spiegazione dettagliata su come eseguire l'HTS, comprese le informazioni sulla preparazione di reagenti, dispositivi, braccio robotico, ecc.

Introduzione

La robotica si è affermata come strumenti sofisticati e potenti per ottenere scoperte significative in vari campi oltre all'industria e all'ingegneria di fabbricazione, come la biochimica, la biologia molecolare e la ricerca clinica, e in particolare HTS ^1,2,3. Il Toxoplasma gondii è un importante parassita e un eucariote parassita unicellulare⁴ che causa seri problemi di salute nell'uomo⁵ e in molti animali omeotermi⁴, con conseguenti infezioni che portano alla ....