Qui presentiamo un protocollo basato sul sistema di esca del verme della farina (Tenebrio molitor) che è stato utilizzato per isolare e selezionare funghi entomopatogeni (EPF) da campioni di suolo. Una formula efficace del numero di conidi (ECN) viene utilizzata per selezionare EPF ad alta tolleranza allo stress in base alle caratteristiche fisiologiche per il controllo microbico dei parassiti sul campo.
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Articolo metodologico
Isolamento e selezione di funghi entomopatogeni da campioni di suolo e valutazione della virulenza fungina contro gli insetti nocivi
In questo articolo
Sommario
Abstract
I funghi entomopatogeni (EPF) sono uno degli agenti di controllo microbico per la gestione integrata dei parassiti. Per controllare i parassiti locali o invasivi, è importante isolare e selezionare l'EPF indigeno. Pertanto, il metodo dell'esca del suolo combinato con il sistema di esca per insetti (verme della farina, Tenebrio molitor) è stato utilizzato in questo studio con alcune modifiche. L'EPF isolato è stato quindi sottoposto al test di virulenza contro il parassita agricolo Spodoptera litura. Inoltre, i potenziali ceppi di EPF sono stati sottoposti a identificazioni morfologiche e molecolari. Inoltre, sono stati eseguiti i test di produzione e termotolleranza dei conidi per i promettenti ceppi di EPF e confrontati; questi dati sono stati ulteriormente sostituiti nella formula del numero di conidi effettivi (ECN) per la classificazione di laboratorio. Il sistema esche-vermi della farina del suolo e la formula ECN possono essere migliorati sostituendo le specie di insetti e integrando più fattori di stress per la valutazione della commercializzazione e dell'applicazione sul campo. Questo protocollo fornisce un approccio rapido ed efficiente per la selezione dell'EPF e migliorerà la ricerca sugli agenti di controllo biologico.
Introduzione
Attualmente, i funghi entomopatogeni (EPF) sono ampiamente utilizzati nel controllo microbico di parassiti agricoli, forestali e orticoli. I vantaggi dell'EPF sono le sue ampie gamme di ospiti, la buona adattabilità ambientale, la natura ecocompatibile e il fatto che possa essere utilizzato con altre sostanze chimiche per mostrare l'effetto sinergico per la gestione integrata dei parassiti1,2. Per l'applicazione come agente di controllo dei parassiti, è necessario isolare un gran numero di EPF da insetti malati o dall'ambiente naturale.
Il campionamento di questi organismi dai loro ....
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Protocollo
NOTA: l'intero diagramma di flusso è illustrato nella Figura 1.
1. Isolamento e selezione di potenziali funghi entomopatogeni (EPF)
- Raccogli il campione di terreno
- Rimuovere 1 cm del terreno superficiale e quindi raccogliere il terreno entro la profondità di 5-10 cm utilizzando una pala da ciascun sito di campionamento.
NOTA: i siti di campionamento sarebbero una montagna, una foresta o aree scarsamente popolate per evitare la contaminazione di ceppi di EPF spruzzati artificialmente. Assicurarsi che le aree per la raccolta dei campioni di terreno siano coperte con erba sulla superficie. Il ....
- Rimuovere 1 cm del terreno superficiale e quindi raccogliere il terreno entro la profondità di 5-10 cm utilizzando una pala da ciascun sito di campionamento.
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Risultati
Isolamento e selezione di potenziali funghi entomopatogeni (EPF)
Utilizzando il metodo di costruzione della libreria di funghi entomopatogeni mediati da Tenebrio molitor (EPF), il numero di funghi senza attività di uccisione degli insetti sarebbe escluso; pertanto, l'efficienza di isolamento e la selezione dell'EPF potrebbero essere ampiamente aumentate. Durante l'applicazione di questo metodo, sono state registrate le informazioni dei siti di campionamento, .......
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Discussione
I funghi entomopatogeni (EPF) sono stati utilizzati per il controllo degli insetti. Esistono diversi metodi per isolare, selezionare e identificare EPF30,31,32. Confrontando i diversi tipi di metodi di esca per insetti, Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae sono stati comunemente trovati nelle esche per insetti6,12,13,14.
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano che non vi è alcun conflitto di interessi coinvolto in questo lavoro.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata supportata da Grant 109-2313-B-005 -048 -MY3 del Ministero della Scienza e della Tecnologia (MOST).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Agar Grado batteriologico | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGR001 | Adatto nella maggior parte delle applicazioni di coltura cellulare/molecolare e biologiche. |
| AGAROSIO, grado di biotecnologia | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGA001 | Per l'elettroforesi del DNA. |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | BIOMAN | SDB001T | |
| Piralide da sughero in ottone | Dogger | D89A-44001 | |
| Canon kiss x2 | Canon | EOS 450D | Per una morfologia di colonia di ceppi record |
| Incubatrice a temperatura costante | Yihder Co., Ltd. | LE-509RD | Conservazione fungina. |
| cubee Mini-centrifuga | GeneReach | MC-CUBEE | |
| DigiGel 10 Sistema di immagine digitale su gel | TOPBIO | DGIS-12S | |
| Finnpipette F2 0,2 a 2 &; L Pipetta | Thermo Scientific | 4642010 | |
| Finnpipette F2 da 1 a 10 µ L Pipetta | Thermo Scientific | 4642030 | |
| Finnpipette F2 da 10 a 100 µ L Pipetta | Thermo Scientific | 4642070 | |
| Finnpipette F2 da 100 a 1000 µ L Pipetta | Thermo Scientific | 4642090 | |
| Finnpipette F2 da 2 a 20 µ L Pipetta | Thermo Scientific | 4642060 | |
| Finnpipette F2 da 20 a 200 µ L Pipetta | Thermo Scientific | 4642080 | |
| GeneAmp PCR System 9700 | Applied Biosystems | 4342718 | |
| Kit GenepHlow Gel/PCR | Geneaid | DFH100 | |
| Genius Dry Bath Incubator | Major Science | MD-01N | |
| Cilindro graduato personalizzato A 100mL | SIBATA | SABP-1195906 | Misurare il volume dei reagenti. |
| Contatore di conteggio manuale | SDI | NO.1055 | |
| Emocitometro | bioman | AP-0650010 | Calcola il numero di spore |
| Anello di inoculazione | Dogger | D8GA-23000 | |
| coperchio | IDEAHOUSE | RS92004 | |
| Micro vetro di copertura | MUTO PURE CHEMICALS CO., LTD | 24241 | |
| Sistema di imaging per microscopio | SAGE VISION CO., LTD | SGHD-3.6C | |
| Vetrini per microscopio | DOGGER | DG75001-07105 | |
| Mupid-2plus DNA Gel Elettroforesi | ADVANCE | AD110 | |
| Nikon microscopio ottico | SAGE VISION CO., LTD | Eclipse CI-L | |
| Tazza di plastica | IDEAHOUSE | CS60016 | |
| Presto Mini gDNA Yeast Kit | Geneaid | GYBY300 | Kit di estrazione del DNA genomico fungino |
| Sabouraud Brodo di destrosio (Sabouraud Liquid Medium) | HiMedia Azienda leader nel settore delle bioscienze | M033 | Utilizzato per la coltivazione di lieviti, muffe e microrganismi acidurici. |
| Lama per bisturi n. 23 | Swann-Morton | 310 | |
| Manico per bisturi n. 4 | AGARWAL SURGICALS | SSS -FOR-01-91 | |
| Pala | Salva e salva Sicuro | A -1580242 -00 | |
| Silwet L-77 | bioman (phytotech) | S7777 | Tensioattivo |
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuga | Thermo Scientific | 75002403 | |
| Pinzette in acciaio | SIPEL ELECTRONIC SA | GG-SA | |
| Sterile Petri Dish | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | 1621 | Contenitori cilindrici poco profondi con coperchi montati, specifici per uso microbiologico o per colture cellulari. |
| ThermoCell MixingBlock | BIOER | MB-101 | |
| Tween 80 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 164-21775 | |
| TwinGuard ULT Freezer | Panasonic Healthcare Holdings Co., Ltd. | MDF-DU302VX-80 | ° C campione conservato. |
| Armadio verticale da pavimento | Chih Chin | BSC-3 | Coltura operativa fungina. |
| Vortex Genie II | Scientific | SIG560 | |
| Borse portaoggetti con cerniera | Salva & Sicuro | A -1248915 -00 | |
| 100 bp DNA Ladder | Geneaid | DL007-20 | |
| ° C Congelatore | FRIGIDAIRE | Frigidaire | FFFU21M1QW-20° Campione C e reagenti sperimentali conservati. |
| 2X SuperRed PCR Master Mix | TOOLS | TE-SR01 | |
| 50X TAE Buffer | BIOMAN | TAE501000 |
Riferimenti
- Wraight, S. P., Carruthers, R. I. Biopesticides: use and Delivery. , Springer. 233-269 (1999).
- Chase, A., Osborne, L., Ferguson, V. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium. Flor....
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Ristampe e permessi
