Articolo metodologico

Protocollo per l'analisi e il consolidamento degli output TrackMate per la misurazione della motilità cellulare bidimensionale mediante il tracciamento nucleare

DOI:

10.3791/62885

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18 dicembre 2021

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1Department of Biochemistry, University of Colorado Boulder, 2Department of Applied Mathematics, University of Colorado Boulder

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo per la misurazione ad alto rendimento della motilità cellulare nei cheratinociti HaCaT descrive i metodi per la raccolta e l'elaborazione di immagini di nuclei cellulari e l'esecuzione del tracciamento delle particelle utilizzando il plug-in ImageJ TrackMate.

Abstract

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La migrazione cellulare collettiva svolge un ruolo chiave in molti processi biologici fondamentali, tra cui lo sviluppo, la guarigione delle ferite e le metastasi del cancro. Per comprendere la regolazione della motilità cellulare, dobbiamo essere in grado di misurarla facilmente e costantemente in diverse condizioni. Qui descriviamo un metodo per misurare e quantificare la motilità a singola cellula e di massa dei cheratinociti HaCaT utilizzando una colorazione nucleare. Questo metodo include uno script MATLAB per l'analisi dei file di output di TrackMate per calcolare spostamenti, tassi di motilità e angoli di traiettoria in singole celle e in blocco per un sito di imaging. Questo script di analisi della motilità consente un'analisi rapida, semplice e scalabile dei tassi di motilità cellulare dai dati TrackMate e potrebbe essere ampiamente utilizzato per identificare e studiare la regolazione della motilità nelle cellule epiteliali. Forniamo anche uno script MATLAB per riorganizzare i video di microscopia raccolti su un microscopio e convertirli in stack TIF, che possono essere analizzati in blocco utilizzando il plug-in ImageJ TrackMate. Utilizzando questa metodologia per esplorare il ruolo delle giunzioni aderenti e della dinamica citoscheletrica dell'actina nella regolazione della motilità cellulare nei cheratinociti HaCaT, dimostriamo che l'attività di Arp2/3 è necessaria per l'elevata motilità osservata dopo la deplezione di α-catenina nei cheratinociti HaCaT.

Introduzione

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Una regolazione precisa e reattiva della motilità cellulare nelle cellule epiteliali è fondamentale per la guarigione delle ferite e per il rifornimento dello strato epiteliale. L'incapacità di sostenere la motilità può portare a problemi con lo sviluppo embrionale e la guarigione delle ferite1 e la segnalazione della motilità iperattiva è un fattore chiave per le metastasi del cancro2.

Comprendere il controllo cellulare della motilità nei cheratinociti HaCaT offre importanti informazioni su questi processi. Le procedure qui descritte forniscono misurazioni e calcoli coerenti dell'entità media della motilità cellulare a livello di singola cellula o di popolazione. Abbiamo utilizzato questo metodo per misurare la motilità nei cheratinociti HaCaT dopo la perturbazione genetica o il trattamento con inibitori di piccole molecole per comprendere la segnalazione cellulare che controlla i tassi di motilità. Lo script MATLAB fornito misura sia la velocità media che la direzione media della motilità per ogni cellula.

La motilità cellulare collettiva è cruciale per la transizione epitelio-mesenchimale sia nello sviluppo che nelle metastasi tumorali3. Le cellule raggiungono la motilità attraverso la coordinazione di aderenza, polarizzazione, protrusione e retrazione4. Questi processi si basano fortemente sulla regolazione coordinata del citoscheletro dinamico dell'actina. L'attivazione della Rac1 GTPasi a valle di PI3K o di varie tirosin-chinasi recettoriali polarizza la cellula, con conseguente polimerizzazione dell'actina5. La dinamica citoscheletrica dell'actina è regolata da questa e da altre GTPasi mediate da Rho, che sono attivate a valle di vari fattori di crescita. Queste GTPasi mediate da Rho attivano quindi il complesso Arp2/3 che stimola la ramificazione dell'actina6. Queste dinamiche del citoscheletro di actina sono strettamente correlate a un altro regolatore chiave della motilità: le giunzioni intercellulari. Siamo particolarmente interessati a come le giunzioni aderenti, che formano forti aderenze tra le cellule, si coordinano con il citoscheletro di actina per mantenere l'integrità del tessuto7.

Abbiamo precedentemente dimostrato che i cheratinociti HaCaT che esprimono un knockdown di α-catenina mediato da shRNA dimostrano tassi di motilità più elevati rispetto a quelli che esprimono un controllo shRNA non mirato8. Desideriamo utilizzare gli strumenti di analisi della motilità che abbiamo sviluppato per comprendere ulteriormente il meccanismo di questa elevata motilità in seguito alla deplezione di α-catenina. La α-catenina è un componente citosolico richiesto delle giunzioni aderenti9. Partecipa alle giunzioni aderenti attraverso la sua interazione con la ß-catenina, che lega come monomero10,11. Tuttavia, la α-catenina può anche dissociarsi dalle giunzioni aderenti per formare un omodimero che lega e raggruppa i filamenti di actina, inibendo l'attività di Arp2/310,11. Sebbene la α-catenina non interagisca direttamente con l'actina mentre è legata alla ß-catenina, può comunque facilitare o rafforzare la coordinazione tra le giunzioni aderenti e il citoscheletro attraverso il legame con la vinculina, che stabilizza i filamenti di actina12.

Sebbene il plug-in TrackMate per ImageJ sia un metodo consolidato per il tracciamento delle particelle che può essere utilizzato per tracciare i nuclei cellulari, abbiamo scoperto che gli strumenti disponibili per l'analisi, l'analisi e il consolidamento degli output di TrackMate per calcolare la motilità cellulare per più siti di imaging non erano integrati ed erano difficili da usare per coloro che non avevano esperienza in più linguaggi di programmazione. Tinevez e Herbert offrono un'introduzione all'uso di TrackMate, ma la sezione di analisi dello spostamento quadratico medio richiede una notevole abilità MATLAB13. I metodi esistenti per estrarre i tassi di motilità dai video di microscopia time-lapse offrono analisi tridimensionali più complesse, ma richiedono maggiori competenze di programmazione14,15. Pathfinder, un software di tracciamento cellulare e di analisi della motilità precedentemente sviluppato nel nostro laboratorio, misura la velocità e la direzione della migrazione cellulare, ma è eseguibile solo su macchine Windows e richiede un ambiente Java Runtime limitante16. Poiché TrackMate è uno strumento affidabile e ben documentato, abbiamo sviluppato un metodo semplice per generare, analizzare e organizzare grandi set di dati TrackMate bidimensionali utilizzando MATLAB. Il nostro script rimuove anche i punti dati interi ripetuti che a volte si verificano negli output di TrackMate dopo che una cellula tracciata esce dal sito di imaging, consentendo l'inclusione di cellule con elevata motilità e/o direzionalità nell'analisi senza l'inclusione di questi punti dati spuri. Forniamo anche uno script per riorganizzare le immagini raccolte su ImageXpress Micro XL in pile TIFF che possono essere analizzate in blocco utilizzando TrackMate.

In questo protocollo, le cellule vengono seminate in una piastra di imaging a 96 pozzetti. Dopo aver lasciato abbastanza tempo alle cellule di aderire al fondo della piastra, le trattiamo con la colorazione nucleare di Hoechst e con qualsiasi piccola molecola i cui effetti sulla motilità siano di interesse. Raccogliamo immagini dei nuclei cellulari nel corso di cinque o più ore, dopodiché le sequenze di immagini vengono elaborate in stack TIFF sottratti dallo sfondo utilizzando MATLAB. Questi stack TIFF vengono analizzati utilizzando il plug-in ImageJ TrackMate, che registra e tiene traccia di ogni singola cella attraverso i punti temporali17. Dopo aver generato le tracce cellulari per tutti i siti di imaging, utilizziamo uno script MATLAB personalizzato per rimuovere i punti dati spuri che si verificano dopo che le cellule lasciano il campo di imaging e calcolare i tassi di motilità medi per ciascun sito di imaging. Lo script analizza solo le celle tracciate per un numero minimo di punti temporali specificato dall'utente e consente all'utente di filtrare le celle in base alla distanza complessiva e/o alla direzione percorsa. Il risultato è lo spostamento medio, la direzione di marcia media, lo spostamento complessivo e la direzione di viaggio generale per ciascuna cellula, che vengono utilizzati per calcolare le medie di massa di tali valori per tutte le cellule in un sito di imaging. Questo protocollo può essere eseguito in blocco su esperimenti di imaging di grandi dimensioni, il che si presta all'analisi della motilità a rendimento relativamente elevato (Figura 1).

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Protocollo

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1. Coltura cellulare e preparazione della piastra ai fosfori

  1. Coltura di cellule HaCaT in terreno di coltura cellulare (Dulbecco's Modified Eagle's Medium integrato con 2 mM di L-glutammina, 100 U/mL di penicillina/streptomicina e 10% (v/v) di siero fetale bovino) a 37 °C e 5% di anidride carbonica in un incubatore umidificato.
  2. Seminare il numero desiderato di cellule per pozzetto (utilizziamo 5000 - 20.000 cellule/pozzetto) in una piastra di imaging a 96 pozzetti, come una micropiastra di polistirene nero a 96 pozzetti. A tre pozzetti, aggiungere solo terreno (senza cellule).
  3. Appoggiare la piastra su una superficie completamente piana per 20 - 30 minuti in modo che le cellule possano attaccarsi al fondo della piastra con una distribuzione spaziale uniforme.
  4. Trasferire la piastra in un incubatore per colture cellulari umidificato (37 °C, 5% di anidride carbonica) per 4-6 ore per consentire alle cellule di aderire completamente al fondo della piastra.
  5. Rimuovere il terreno dalla piastra e sostituirlo con il terreno di coltura cellulare con 2 μg/mL di colorante Hoechst (una diluizione 1:5000 di 1 mg/mL di soluzione madre).
  6. Riporre la piastra nell'incubatore per colture cellulari umidificate (37 °C, 5% di anidride carbonica) per 2 ore.
  7. Lavare delicatamente la piastra tre volte con 100 μL di soluzione salina tamponata con fosfato per pozzetto prima di aggiungere 90 μL di terreno di imaging (Dulbecco's Modified Eagle's Medium privo di rosso fenolo integrato con 2 mM di L-glutammina, 100 U/mL di penicillina/streptomicina e 10% (v/v) di siero fetale bovino) a ciascun pozzetto).
  8. Se si misurano gli effetti di inibitori di piccole molecole o di altri effettori, trattare le cellule immediatamente prima dell'imaging.

2. Imaging

  1. Visualizzare la lastra (compresi i pozzetti di soli terreni) con un ingrandimento 10x in un microscopio con una camera ambientale umidificata a 37 °C e 5% di anidride carbonica.
    NOTA: Gli script di analisi in questo protocollo sono scritti per i dati raccolti su un microscopio a campo largo ImageXpress Micro XL di Molecular Devices.
  2. Raccogli le immagini in base alla risoluzione temporale richiesta dall'esperimento. Per ottenere i migliori risultati, registrare almeno 4 punti temporali all'ora per almeno 5 ore. Se si misurano gli effetti di inibitori di piccole molecole o di altre perturbazioni sulle cellule, eseguire l'imaging per almeno 5 ore dopo il tempo previsto per vedere un effetto. Per i nostri scopi, immaginiamo per 100 punti temporali di 8 minuti per un tempo totale di imaging di 13 ore e 20 minuti.

3. Elaborazione delle immagini

  1. Utilizza lo script MATLAB personalizzato fornito "ImageReorganizer.m" per rimuovere le immagini in miniatura e riorganizzare i file immagine in base al pozzetto anziché al punto temporale. ImageXpress genera i file in questa organizzazione di cartelle: "[Nome esperimento] > [AAAA-MM-GG] > [Numero esecuzione] > Timepoint_[Punto temporale] > [File immagine]". Una volta che le immagini sono state riorganizzate, questo script esegue la sottrazione dello sfondo sulle immagini da ciascun punto temporale utilizzando le immagini sfocate medie e gaussiane dei pozzetti solo multimediali da quel punto temporale. Questo script organizza quindi le immagini sottratte dallo sfondo in uno stack TIFF per ogni sito di imaging. Ogni stack TIFF è denominato "[Well]_[Site].tif".
    1. Se l'esperimento si è esteso per più di un giorno, combina il contenuto delle cartelle [Numero esecuzione] per tutti i giorni in modo che tutte le sottocartelle "Timepoint_[Punto temporale]" si trovino nella stessa cartella "[Numero esecuzione]".
    2. Si noti che questo script richiede la funzione MATLAB int2strz18. Immettere il percorso locale di questa funzione dopo "addpath" alla riga 2.
    3. Immettere le righe per i pozzetti solo multimediale come "emptyrows" alla riga 9 e le colonne come "emptycolumns" alla riga 10.
    4. Inserire le righe per i pozzetti sperimentali come "righe" alla riga 15 e le colonne come "colonne" alla riga 16. Inserire il numero di siti di imaging per pozzetto e i "siti" alla riga 17.
    5. Inserisci il percorso della cartella "[Run number]" nella barra del percorso in MATLAB ed esegui lo script.

4. Tracciamento delle celle

NOTA: TrackMate può essere eseguito su tutti gli stack TIFF in una directory designata utilizzando una versione leggermente modificata dello script Run_TrackMate_Headless.groovy di Tinevez et al.17 o può essere eseguito manualmente per ogni singolo stack TIFF. Eseguiamo FIJI manualmente su alcuni stack TIFF di esempio per assicurarci di utilizzare i parametri corretti prima di eseguire lo script Groovy su tutti gli stack TIFF utilizzando tali parametri.

  1. Per eseguire il plug-in TrackMate in FIJI per tutti gli stack TIFF in una cartella, scaricare e utilizzare lo script Run_TrackMate_Headless.groovy di Tinevez et al.17 in base al protocollo fornito. Utilizziamo una versione leggermente modificata di questo script, che ci consente di raggruppare facilmente sia i file di input che i nomi dei file di output e di inserire tutti i parametri utilizzando un'unica interfaccia utente grafica per l'input. Di seguito sono riportate istruzioni dettagliate per l'utilizzo di questo script modificato, che viene fornito qui come TrackMate_Headless_Mod.groovy.
    1. Aprire lo script in FIJI selezionando File>Apri e quindi navigando fino alla posizione dello script TrackMate_Headless_Mod.groovy.
    2. Seleziona Esegui.
    3. Immettere la directory in cui si trovano gli stack TIFF (l'output predefinito da "StackGenerator.m" deve essere "[Nome esperimento] > [AAAA-MM-GG] >> stack") come "Directory di input".
    4. Crea una directory di output e inserisci il suo percorso come "Directory di output". L'impostazione predefinita per "Estensione file" dovrebbe essere ".tif;" in caso contrario, inserisci ".tif" come "Estensione file".
    5. Per eseguire TrackMate solo su un sottoinsieme di file nella directory, utilizzare lo spazio di input dopo "Il nome del file contiene" per includerli. In caso contrario, lasciare vuoto lo spazio.
    6. Seleziona "Mantieni la struttura della directory durante il salvataggio".
    7. Inserisci "Raggio spot", "Soglia di qualità", "Distanza massima tra i fotogrammi", "Distanza massima di collegamento" e "Distanza massima di chiusura dello spazio" in pixel in base alle impostazioni desiderate. In genere utilizziamo rispettivamente 3,5, 18, 2, 15 e 40 per nuclei HaCaT con ingrandimento 10x.
    8. Seleziona OK. Questo script deve produrre un file XML per ogni stack TIFF nella directory di output designata.
  2. In alternativa, esegui manualmente il plug-in TrackMate in FIJI per ogni stack TIFF secondo il protocollo descritto in Tinevez et al.13
    1. Apri una pila TIFF nelle FIJI e apri il plug-in TrackMate selezionando Plug-in >Tracking > TrackMate nella barra dei menu.
    2. Se viene visualizzata una finestra popup viene visualizzato il messaggio "Sembra che questa immagine abbia 1 punto temporale ma [numero di punti temporali] viene tagliato. Vuoi scambiare Z e T?" seleziona Sì.
    3. In TrackMate v4.0.1, utilizza le impostazioni predefinite ad eccezione di "Diametro blob stimato" (usiamo 7.000 pixel per i nuclei HaCaT con ingrandimento 10x) e soglia (usiamo 18.000, ma questo varierà in base al microscopio utilizzato e all'intensità del colorante Hoechst).
    4. Utilizzare la funzione Anteprima per garantire un rilevamento ottimizzato delle particelle e regolare le impostazioni del diametro e della soglia del blob in base alle esigenze.
    5. Per "Distanza massima di chiusura dello spazio", le impostazioni predefinite spesso funzionano per la motilità HaCaT basale, ma potrebbe essere necessario aumentare la distanza massima di chiusura dello spazio fino a 40,0 pixel in condizioni che migliorano la motilità.
    6. Conferma visivamente che il rilevamento è ottimizzato con spazi minimi nelle tracce delle celle.
    7. In Seleziona un'azione [sic], scegli Esporta tracce in file XML ed esegui.
    8. Ripetere l'operazione per tutte le pile TIFF.

5. Quantificazione dei tassi di motilità

NOTA: Utilizzare lo script MATLAB personalizzato fornito "TrackMateAnalysis.m" per rimuovere le tracce non riuscite e quantificare la motilità per tutti i file di output TrackMate. Lo script rimuove le tracce che si spostano fuori dal fotogramma (le cui tracce di posizione sono impostate per impostazione predefinita su numeri interi) e le tracce che vengono tracciate per un numero inferiore a un numero designato di punti temporali. Lo script rimuove le tracce che si spostano fuori dal fotogramma (le cui tracce di posizione sono impostate per impostazione predefinita su numeri interi) e le tracce che vengono tracciate per un numero di punti temporali inferiore a quello programmabile. L'output è lo spostamento medio per punto temporale per le singole cellule e per tutte le cellule in un sito di imaging. (Output di esempio: 'Output.mat')

  1. Si noti che questo script richiede la funzione MATLAB fornita "import_trackmate_xml.m." Inserire il percorso locale di questa funzione dopo "addpath" alla riga 4.
  2. Alla riga 7, indicare il numero minimo di punti temporali su cui una particella deve essere tracciata per essere inclusa nell'output consolidato.
  3. Sulle righe 12 e 13, indicare l'intervallo di distanze percorse (in pixel) che deve essere incluso nell'analisi filtrata. Per includere tutte le possibili distanze percorse, inserire un intervallo compreso tra 0 e la larghezza del campo di imaging.
  4. Sulle righe 14 e 15, indicare l'intervallo di traiettorie (in gradi) che devono essere incluse nell'analisi filtrata. Per includere tutte le traiettorie possibili, immettere un intervallo compreso tra 0 e 360.
  5. Eseguire lo script nella cartella contenente tutti i file XML di output di TrackMate.
    NOTA: Lo script genera e salva una struttura di celle MATLAB contenente tutti i dati generati in questa analisi. Tables{1,:} elenca i nomi dei file XML di output di Trackmate per ogni sito di imaging analizzato da questo script. Tables{2,:} è una sottostruttura contenente le posizioni (pixel), gli spostamenti (pixel) e gli angoli di viaggio (gradi, dove 0° indica una direzione di viaggio verso destra all'interno del sito di imaging) per tutte le singole celle in ogni punto temporale. Contiene anche la distanza totale percorsa (pixel), la motilità media (pixel/punto temporale), l'angolo medio di viaggio (gradi) per ogni cella in tutti i punti temporali, nonché l'angolo totale di viaggio tra il primo e l'ultimo punto temporale per ogni cella. La 3ae la 4ariga delle tabelle contengono rispettivamente i valori di motilità della deviazione media e standard (pixel/punto temporale) per tutte le cellule in tutti i punti temporali in ciascun sito di imaging. La 5ae la 6ariga contengono rispettivamente i valori di deviazione media e standard per la distanza totale percorsa (pixel) da tutte le celle in tutti i punti temporali in ciascun sito di imaging. Le righe7 e 8 contengono i valori di deviazione media e standard per l'angolo di corsa complessivo (gradi) tra il primo e l'ultimo punto temporale per tutte le cellule in un sito di imaging. Mentre le righe 3-8 delle tabelle contengono questi valori per tutte le celle che soddisfano i criteri minimi di tracciamento dei punti temporali, le righe 9-14 contengono gli stessi valori, ma solo per le celle che soddisfano i criteri di filtro indicati dall'utente.

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Risultati

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Per garantire che il nostro script di analisi fosse affidabile e coerente, abbiamo misurato la motilità dei cheratinociti HaCaT in tre esperimenti indipendenti. Abbiamo scoperto che mentre la deviazione standard delle motilità cellulari era variabile tra gli esperimenti (probabilmente a causa della sensibilità delle cellule HaCaT alla confluenza e agli stimoli meccanici), la motilità media è stata replicata in modo coerente in più esperimenti senza differenze statisticamente significative tra le repliche secondo il test ...

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Discussione

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La metodologia e gli strumenti di analisi sopra descritti forniscono un mezzo semplice e scalabile per misurare e quantificare la motilità dei cheratinociti HaCaT che utilizza MATLAB e richiede un'esperienza di programmazione minima. Questo protocollo richiede che i nuclei delle cellule vengano colorati e visualizzati nel corso di almeno 5 ore. Sebbene la raccolta dei dati possa essere eseguita su qualsiasi microscopio adatto, questo protocollo fornisce uno script per l'elaborazione dell...

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Dichiarazioni

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X.L. e l'Università del Colorado Boulder hanno un interesse finanziario nello sviluppo di inibitori HDAC per terapie e possiedono azioni in OnKure. X.L. è cofondatore e membro del consiglio di amministrazione di OnKure, che ha concesso in licenza inibitori HDAC proprietari dall'Università del Colorado Boulder. OnKure non è coinvolta né nel disegno sperimentale né nel finanziamento di questo studio.

Ringraziamenti

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Ringraziamo Daniel Messenger, Lewis Baker, Douglas Chapnick, Adrian Ramirez, Quanbin Xu e altri membri dei laboratori Liu e Bortz per le loro intuizioni e consigli. Ringraziamo Jian Tay per aver condiviso la sua esperienza in MATLAB e per aver scritto la funzione per l'importazione XML. Ringraziamo Joseph Dragavon di BioFrontiers Advanced Light Microscopy Core per il suo supporto alla microscopia e all'imaging. Ringraziamo Theresa Nahreini e Nicole Kethley della Cell Culture Core Facility per il loro supporto alle colture cellulari. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del National Cancer Institute e del National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases del National Institutes of Health (R01AR068254) a X. L. e al National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) R01GM126559 a D.B. e X. L. G.E.W. e E.N.B. sono stati sostenuti da una borsa di formazione pre-dottorato del NIGMS (T32GM08759). ImageXpress Micro XL è stata supportata dal National Center for Research Resources (S10 RR026680). FACSAria è stato sostenuto dal National Institutes of Health (S10OD021601).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Micropiastre in polistirina nera a fondo chiaro a 96 pozzetti trattate con TC, confezionate singolarmente, con coperchio, steriliCorning3603
Dulbecco's modified eagle medium (alto D-glucosio)Life Technologies Corporation/Thermo Fisher Scientific12800-082
Siero fetale bovinoSigma-Aldrich IncF0926
Fluorobrite Dulbecco's modified eagle medium (D-glucosio alto, 3,7 g/L di bicarbonato di sodio, senza L-glutammina, senza rosso fenolo)Gibco/Thermo Fisher ScientificA18967-01
GlutaminePlusR& D Systems Inc.R90210
Hoechst 33342, tricloridrato, triidratoInvitrogen/Thermo Fisher ScientificH21492
Penicillina streptomicinaLife Technologies Corporation/Thermo Fisher Scientific15140-122
Soluzione salina tamponata con fosfatoGibco/Thermo Fisher Scientific14190-144

Riferimenti

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