Qui viene presentato un semplice protocollo per la produzione di nanoparticelle di mRNA basate su polimeri poli(beta aminoestere), facili da personalizzare cambiando l'mRNA incapsulato. Viene inoltre descritto il flusso di lavoro per la sintesi dei polimeri, le nanoparticelle e la loro caratterizzazione essenziale in vitro. Viene aggiunta anche una prova di concetto per quanto riguarda l'immunizzazione.
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Articolo metodologico
Sintesi e caratterizzazione di nanoparticelle poli(beta aminoesters) caricate con mRNA a fini vaccinali
In questo articolo
Sommario
Abstract
La vaccinazione è stata uno dei maggiori successi della società moderna ed è indispensabile per controllare e prevenire le malattie. I vaccini tradizionali erano composti da interi o frazioni dell'agente infettivo. Tuttavia, le sfide rimangono e le nuove tecnologie vaccinali sono obbligatorie. In questo contesto, l'uso dell'mRNA a scopo immunizzante ha mostrato prestazioni migliorative, come dimostrato dalla rapida approvazione di due vaccini a mRNA che prevengono l'infezione da SARS-CoV-2. Oltre al successo nella prevenzione delle infezioni virali, i vaccini a mRNA possono anche essere utilizzati per applicazioni terapeutiche sul cancro.
Tuttavia, l'instabilità dell'mRNA e la sua rapida eliminazione dal corpo a causa della presenza di nucleasi rende impossibile la sua consegna nuda. In questo contesto, i nanofarmaci, e in particolare le nanoparticelle polimeriche, sono sistemi critici di rilascio di mRNA. Pertanto, lo scopo di questo articolo è quello di descrivere il protocollo per la formulazione e il test di un candidato vaccino a mRNA basato sulle nanoparticelle polimeriche proprietarie. La sintesi e la caratterizzazione chimica dei polimeri poli(beta aminoesteri) utilizzati, la loro complessazione con mRNA per formare nanoparticelle e la loro metodologia di liofilizzazione saranno discusse qui. Questo è un passo cruciale per ridurre i costi di stoccaggio e distribuzione. Infine, saranno indicati i test necessari per dimostrare la loro capacità di trasfettare in vitro e maturare cellule dendritiche modello. Questo protocollo andrà a beneficio della comunità scientifica che lavora sulla vaccinazione a causa della sua elevata versatilità che consente a questi vaccini di prevenire o curare un'ampia varietà di malattie.
Introduzione
Le malattie infettive hanno rappresentato una grave minaccia per milioni di esseri umani in tutto il mondo e sono ancora una delle principali cause di morte in alcuni paesi in via di sviluppo. La vaccinazione profilattica è stata uno degli interventi più efficaci della società moderna per prevenire e controllare le malattie infettive1,2. Queste pietre miliari critiche della scienza nella rilevanza del20 °secolo sono state osservate dalla recente pandemia mondiale di Covid-19 causata dal virus SARS-CoV-23. Riconoscendo l'importanza di avere vaccini efficienti per limitare la d....
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Protocollo
1. Sintesi del polimero pBAE con oligopeptidi terminali (OM-pBAE)
- Polimerizzazione di C6-pBAE
- Aggiungere 5-ammino-1-pentanolo (38 mmol; MW = 103,16 Da) 1-esilamine (38 mmol; MW = 101,19 Da) in un pallone di vetro a fondo tondo (100 ml). Quindi, aggiungere 1,4-butandiolo diacrilato (82 mmol; MW = 198,22 Da).
- Preriscaldare il bagno di olio siliconico a 90 °C, posizionare il matraccio a fondo tondo nel bagno d'olio e mescolare la miscela con l'aiuto di una barra magnetica per una notte (~18 h). Quindi, prendere il prodotto dal matraccio a fondo tondo e metterlo nel congelatore a -20 °C.
NOTA: Il prodotto è sotto forma di polvere appiccicos....
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Risultati
Sintesi e caratterizzazione dei polimeri
La procedura di sintesi OM-pBAE è riportata nella Figura 2. Come mostra la Figura 2A, il primo passo per ottenere l'OM-pBAE è sintetizzare il C6-pBAE aggiungendo le ammine (1-esilamine e 5-ammino-1-pentanolo, rapporto 1:1) al diacrilato (1,4-butandiolo diacrilato). Questa reazione viene effettuata a 90 °C per 20 ore e con agitazione costante. Successivamente, una soluzione di oligopeptidi viene aggiunt.......
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Discussione
Dopo lo scoppio della pandemia di Covid-19 lo scorso anno, l'importanza dei vaccini in termini di controllo delle malattie infettive si è manifestata come componente critica8. Gli sforzi degli scienziati di tutto il mondo hanno permesso il rilascio sul mercato di molti vaccini. Per la prima volta nella storia, i vaccini a mRNA hanno dimostrato il loro successo precedentemente ipotizzato, grazie alla loro rapida progettazione a causa della loro capacità di adattarsi a qualsiasi nuovo antigene entro.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare né alcun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Viene riconosciuto il sostegno finanziario di MINECO/FEDER (sovvenzioni SAF2015-64927-C2-2-R, RTI2018-094734-B-C22 e COV20/01100). CGF ha riconosciuto la sua IQS PhD Fellowship.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1,4-butandiolo diacrilato | Sigma Aldrich | 123048 | |
| 1-esilammina | Sigma Aldrich | 219703 | |
| 5-ammino-1-pentanolo | Sigma Aldrich | 411744 | |
| acetone | Panreac | 141007 | |
| CD11b anticorpo | BD | 550993 | |
| CD86 | Bioligend | 105007 | |
| Cloro idrossiido | Panreac | 181023 | |
| Cloroformio-d | Sigma Aldrich | 151823 | |
| Cys-His-His-His peptide | Ontores | Custom | |
| Cys-Lys-Lys-Lys peptide | Ontores | Custom | |
| D2O | Sigma Aldrich | 151882 | |
| reagente DEPC per acqua priva di Rnasi | Sigma Aldrich | D5758 | Questo reagente è importante per trattare l'acqua MilliQ per rimuovere eventuali RNasi dei tamponi |
| Dietiletere | Panreac | 212770 | |
| dimetilsolfossido | Sigma Aldrich | 276855 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| mRNA EGFP | TriLink Technologies | L-7601 | |
| mRNA OVA | TriLink Tecnologie | L-7610 | |
| Kit RiboGreen | ThermoFisher | R11490 | |
| acetato di sodio | Sigma Aldrich | 71196 | |
| saccarosio | Sigma Aldrich | S0389 | |
| Acido trifluoroacetico | Sigma Aldrich | 302031 | |
| Tripsina-EDTA | Fisher Scientific | 11570626 | |
| α- mouse AlexaFluor488 anticorpo | Abcam | Ab450105 | |
| Equipment | |||
| Analizzatore di tracciamento di nanoparticelle | Malvern Panalytical | NanoSight NS300 | |
| Spettrometro di risonanza magnetica nucleare | Varian | 400 MHz | |
| ZetaSizer | Malvern Panalytical | Nano ZS | Per potenziale zeta e determinazione delle dimensioni idrodinamiche |
| Software | |||
| NanoSight Software NTA | Malvern Panalytical | MAN0515-02-EN-00 | |
| Software NovoExpress | Agilent | Non specificato | |
| Software ZetaSizer | Malvern Panalytical | DTS Applicazione | Per analizzare la carica superficiale e le dimensioni idrodinamiche |
Riferimenti
- Chumakov, K., Benn, C. S., Aaby, P., Kottilil, S., Gallo, R. Can existing live vaccines prevent COVID-19. Science. 368 (6496), 1187-1188 (2020).
- Zhang, C., Maruggi, G., Shan, H., Li, J. Advances in mRNA vaccines for infectious diseases. Frontiers in Immunology. 10, 1-13 (2019).
- W....
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Ristampe e permessi
