I protocolli di analisi basati su cellule di trasferimento di energia di risonanza di Förster risolti nel tempo sono descritti per la quantificazione semplice, specifica, sensibile e robusta del trasduttore di segnale fosforilato endogeno e dell'attivatore della trascrizione (STAT) 1/3/4/5/6 proteine in lisati cellulari in un formato a 384 pozzetti.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Saggi di trasferimento di energia di Förster Resonance risolti nel tempo per la misurazione di proteine STAT fosforilate endogene in cellule umane
In questo articolo
Sommario
Abstract
La via di segnalazione Janus chinasi (JAK)/trasduttore di segnale e attivatore della trascrizione (STAT) svolge un ruolo cruciale nel mediare le risposte cellulari alle citochine e ai fattori di crescita. Le proteine STAT sono attivate dalla fosforilazione tirosina mediata principalmente dai JAB. L'attivazione anomala delle vie di segnalazione STAT è implicata in molte malattie umane, in particolare il cancro e le condizioni immuno-correlate. Pertanto, la capacità di monitorare la fosforilazione della proteina STAT all'interno dell'ambiente di segnalazione cellulare nativo è importante sia per la ricerca accademica che per la scoperta di farmaci. I formati di analisi tradizionali disponibili per quantificare le proteine STAT fosforilate includono il western blotting e il saggio immunoassorbinte enzimatico (ELISA). Questi metodi eterogenei sono laboriosi, a bassa produttività e spesso non affidabili (specifici) nel caso del western blotting. Sono disponibili metodi omogenei (senza lavaggio) ma rimangono costosi.
Qui vengono forniti protocolli dettagliati per la misurazione sensibile, robusta ed economica in un formato a 384 pozzetti di livelli endogeni di STAT1 fosforilato (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694/Y699) e STAT6 (Y641) in lisati cellulari da cellule aderenti o in sospensione utilizzando la nuova piattaforma THUNDER time-resolved Förster resonance energy transfer (TR-FRET). Il flusso di lavoro per il test cellulare è semplice, veloce e progettato per lo screening ad alto rendimento (HTS). Il protocollo di analisi è flessibile, utilizza un campione a basso volume (15 μL), richiede una sola fase di aggiunta del reagente e può essere adattato ad applicazioni a bassa produttività e ad alta produttività. Ogni test immunologico sandwich fosfo-STAT viene convalidato in condizioni ottimizzate con agonisti e inibitori noti e genera i valori attesi di farmacologia e fattore Z. Poiché i saggi TR-FRET sono raziometrici e non richiedono passaggi di lavaggio, forniscono una riproducibilità molto migliore rispetto agli approcci tradizionali. Insieme, questa suite di saggi fornisce nuovi strumenti economici per un'analisi più completa di specifiche proteine STAT fosforilate dopo il trattamento cellulare e lo screening e la caratterizzazione di modulatori specifici e selettivi della via di segnalazione JAK / STAT.
Introduzione
La via di segnalazione JAK/STAT svolge un ruolo chiave nel mediare le risposte cellulari a diverse citochine, interferoni, fattori di crescita e molecole correlate1,2. Il legame di questi ligandi a specifici recettori della superficie cellulare provoca l'attivazione di JAK, che a loro volta attivano le proteine STAT mediante fosforilazione di specifici residui di tirosina. La fosforilazione STAT provoca la loro dimerizzazione e traslocazione nel nucleo, dove esercitano il loro effetto sulla trascrizione dei geni bersaglio regolati. La famiglia STAT è composta da sette membri: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Coltura cellulare
- Mantenere le cellule in un incubatore e coltura a CO2 umidificata a 37 °C / 5% con DMEM integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS) (cellule HeLa e A431) o RPMI integrato con il 15% fbS (cellule U266B1). Coltiva le cellule fino a quando non raggiungono il 70-80% di confluenza, quindi tripsinilizzale e passale o usale per i test.
NOTA: i terreni di coltura contenevano rosso fenolo. Nessuna fame sierica è stata condotta per nessuna linea cellulare prima di condurre i test.
2. Titolazione dello stimolatore o dell'inibitore utilizzando il protocollo di dosaggio a due piastre con cellule aderen....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Ogni test THUNDER TR-FRET è stato validato farmacologicamente trattando cellule aderenti (HeLa o A431) o in sospensione (U266B1) con attivatori o inibitori specifici della via JAK/STAT e quindi misurando i livelli di specifiche ST fosforilate e totali, se applicabile. I saggi sono stati condotti in formato 384 pozzetti utilizzando il protocollo di trasferimento a due piastre e condizioni di analisi pre-ottimizzate. La Figura 3, la Figura 4, .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Rispetto ai metodi convenzionali per l'analisi delle fosfoproteine come il western blotting e i metodi basati su ELISA, il flusso di lavoro per un test cellulare THUNDER TR-FRET è semplice e veloce, utilizza un campione a basso volume (15 μL), è progettato per HTS in un formato a 384 pozzetti ed è altamente suscettibile all'automazione. Il protocollo di analisi è flessibile e può essere facilmente adattato ad applicazioni a throughput medio e alto. I saggi possono essere eseguiti utilizzando un protocollo di trasferiment.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Interessi in competizione: Jaime Padros, Mireille Caron e Geneviève Chatel sono dipendenti di BioAuxilium Research, che produce i kit di analisi THUNDER TR-FRET utilizzati in questo studio. Inoltre, Jaime Padros e Mireille Caron sono azionisti di BioAuxilium Research. Ciò non altera l'adesione degli autori a tutte le politiche di JoVE sulla condivisione di dati e materiali.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Micropiastra a 96 pozzetti, trasparente, fondo piatto, polistirene, trattamento con coltura tissutale, sterile | Corning | 3595 | Questa è la piastra per la coltura di cellule quando si utilizza il protocollo di analisi a due piastre. È possibile utilizzare altre piastre per colture cellulari Micropiastra |
| a 96 pozzetti, bianca, a basso volume | PerkinElmer | 6007290 | Questa è la piastra per la rilevazione TR-FRET quando si utilizzano i protocolli di analisi a due o una piastra. È possibile utilizzare altre piastre bianche a 384 pozzetti a basso volume |
| Linea cellulare A431 | ATCC | CRL-1555 | |
| Guarnizione adesiva per micropiastre | PerkinElmer | 6050185 | |
| DMSO | Fisher | D159-4 | |
| Dulbecco' s modificato Eagle medium (DMEM) | Wisent | 319-005-CL | THUNDER TR-FRET è compatibile con terreni di coltura contenenti rosso fenolo |
| EnVision Xcite Lettore di piastre multilabel | PerkinElmer | 2104-0020A | I saggi possono essere eseguiti su una varietà di lettori di piastre dotati dell'opzione TR-FRET |
| Erlotinib cloridrato | Sigma | CDS022564 | |
| Falcon fiasche trattate per colture tissutali | Fisher | 13-680-65 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Linea cellulare Wisent | 098-150 | |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| JAK Inhibitor 1 | Cayman Chemical | 15146 | |
| Agitatore a piastre orbitali | Molte opzioni disponibili | Non applicabile | |
| EGF umano ricombinante | PeproTech | AF-100-15 | |
| IFN&alfa umano ricombinante; 2b | ProSpec | CYT-460 | |
| IL-4 umano ricombinante | R& D Systems | 204-IL | |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI) | Wisent | 350-007-CL | THUNDER TR-FRET è compatibile con il terreno di coltura contenente rosso fenolo |
| THUNDER Phospho-STAT1 (Y701) + Total STAT1 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit | BioAuxilium Research | KIT-STAT1PT-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT3 (Y705) + Total STAT3 Cell Signaling Assay Kit | BioAuxilium Research | KIT-STAT3PT-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT4 (Y693) Kit di test di segnalazione cellulare TR-FRET | BioAuxilium Research | KIT-STAT4P-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT5 (Y694/Y699) + Kit di test di segnalazione cellulare Total STAT5 TR-FRET | KIT-STAT5PT-500 | ||
| THUNDER Phospho-STAT6 (Y641) + Kit di test di segnalazione cellulare Total STAT6 TR-FRET | BioAuxilium Research | KIT-STAT6PT-500 | |
| Tripsina/EDTA 0,05% | Wisent | 325-542-CL | |
| U266B1 linea cellulare | ATCC | TIB-196 | |
| Acqua ultrapura | NA | NA Utilizzare | acqua di grado Milli-Q (18 MΩ. cm) per diluire il tampone di lisi e il tampone di rilevamento |
Riferimenti
- Villarino, A., Kanno, Y., O'Shea, J. Mechanisms and consequences of Jak-STAT signaling in the immune system. Nature Immunology. 18 (4), 374-384 (2017).
- Hammarén, H. M., Virtanen, A. T., Raivola, J., Silvennoinen, O. The regulation of JAKs in cytokine signaling and its brea....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
