Il pesce zebra è un modello importante per comprendere lo sviluppo del rene. Qui, un protocollo di ibridazione in situ è ottimizzato per rilevare l'espressione genica nelle larve di zebrafish e nei giovani durante lo sviluppo del mesonephros.
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Articolo metodologico
Sul posto Ibridazione in larve di zebrafish e giovani durante lo sviluppo di Mesonephros
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il pesce zebra forma due strutture renali nel corso della sua vita. Il pronephros (rene embrionale) si forma durante lo sviluppo embrionale e inizia a funzionare a 2 giorni dopo la fecondazione. Costituito da soli due nefroni, il pronephros funge da unico rene durante la vita larvale fino a quando non è richiesta una maggiore funzionalità renale a causa dell'aumento della massa corporea. Per far fronte a questa maggiore domanda, il mesonephros (rene adulto) inizia a formarsi durante la metamorfosi. I nuovi nefroni primari si fondono con il pronephros e formano lumen collegati. Quindi, i nefroni secondari si fondono con quelli primari (e così via) per creare una rete ramificata nel mesonefro. La stragrande maggioranza della ricerca si concentra sul pronephros a causa della facilità di utilizzo degli embrioni. Pertanto, è necessario sviluppare tecniche per studiare larve più vecchie e più grandi e pesci giovani per comprendere meglio lo sviluppo del mesonephros. Qui, un protocollo di ibridazione in situ per l'analisi dell'espressione genica è ottimizzato per la penetrazione della sonda, il lavaggio di sonde e anticorpi e lo sbiancamento dei pigmenti per visualizzare meglio il mesonefro. La linea transgenica Tg(lhx1a-EGFP) viene utilizzata per etichettare le cellule progenitrici e i tubuli distali dei nefroni nascenti. Questo protocollo colma una lacuna nella ricerca sul mesonefro. È un modello cruciale per capire come i nuovi tessuti renali si formano e si integrano con i nefroni esistenti e fornire approfondimenti sulle terapie rigenerative.
Introduzione
L'embrione di zebrafish è un modello importante per lo studio dello sviluppo dei tessuti grazie alle sue piccole dimensioni, alla trasparenza, agli strumenti disponibili e alla sopravvivenza senza nutrirsi fino a cinque giorni1,2. Ha notevolmente contribuito alla comprensione dello sviluppo renale e alla conservazione tra zebrafish e mammiferi3,4,5. Il rene svolge un ruolo essenziale nel mantenimento dell'omeostasi fluida, nel filtraggio del sangue e nell'escrezione dei rifiuti6. Il nefrone, l'....
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Protocollo
L'uso di larve e novellame di zebrafish è approvato dalla IUP IACUC (protocollo #02-1920, #08-1920). I dettagli del contenuto della soluzione sono elencati nella Tabella dei materiali.
1. Allevamento di larve
NOTA: Ci vorranno fino a 21 giorni o più per allevare larve e giovani allo stadio di interesse.
- Prepara il pesce zebra adulto ad accoppiarsi aggiungendo 1 pesce maschio e 1 femmina in una vasca di accoppiamento nel tardo pomeriggio dopo il loro ultimo pasto.
NOTA: non tutte le coppie di pesci si accoppiano. Inizia impostando 20 coppie per determinare il tasso di accoppiamento e ....
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Risultati
Utilizzando la linea transgenica Tg (lhx1a-EGFP), è stato dimostrato che questo protocollo di ibridazione in situ è efficace nell'etichettare le cellule progenitrici renali e varie strutture di nefroni durante lo sviluppo di mesonefro. Come previsto, anche il sistema nervoso centrale è etichettato in questa linea transgenica (non mostrata). Il nefrone mesonefrico iniziale si forma a circa 5,2 mm, dorsale al pronephros (Figura 2A), e il tubulo distale di questo nefrone è eti.......
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Discussione
Il metodo di ibridazione in situ qui descritto ha lo scopo di studiare lo sviluppo del mesonefro. Tuttavia, può essere applicato per studiare lo sviluppo di altri tessuti e organi durante la metamorfosi, come l'intestino, il sistema nervoso, le squame e la pigmentazione14. Le sonde possono essere generate per geni endogeni o marcatori fluorescenti in linee transgeniche.
È fondamentale che le larve rimangano intatte per osservare gli organi e i tessuti nel loro .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Il finanziamento è stato fornito dalla Pennsylvania Academy of Science, dal Commonwealth of Pennsylvania Biologists e dall'Indiana University of Pennsylvania (School of Graduate Studies and Research, Department of Biology e Cynthia Sushak Undergraduate Biology Fund for Excellence). La linea transgenica Tg (lhx1a-EGFP) è stata fornita dal Dr. Neil Hukriede (Università di Pittsburgh).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Anticorpo anti-fluoresceina | Roche/Sigma-Aldrich | 11426338910 | |
| sbiancante | 0,8% KOH, 0,9% H2O2 in PBST | ||
| Reagente bloccante | Roche/Sigma-Aldrich | 11096176001 | Utilizzare per la soluzione bloccante, preparare secondo le istruzioni del produttore |
| Filtro cellulare | Fisher Scientific | 22-363-549 | 100 μ m |
| E3 medium | 5 mM NaCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, 0,17 mM KCl, 0,0001% blu di metilene | ||
| Manipolatore di ciglia | Fisher Scientific | NC1083208 | Utilizzare per manipolare le larve |
| Soluzione di fissaggio | 4% paraformaldeide, 1% DMSO in PBS; calore a 65 gradi; C agitando fino a quando la polvere non si scioglie, quindi aggiungere DMSO dopo che si è raffreddato | ||
| Sintesi della sonda di fluoresceina | Roche/Sigma-Aldrich | 11685619910 | |
| Fiala di vetro | Fisher Scientific | 03-338B | |
| Incapsulamento di Hatchfry | Soluzione di Argent | ||
| Hyb- | 50% formammide, 5X SSC, 0,1% Soluzione di Tween-20 | ||
| Hyb+ | HYB-, 5 mg/mL di torula RNA, 50 ug/mL di eparina | ||
| MAB (10X) | 1 M di acido maleico, 1,5 M di NaCl, pH 7,5 | ||
| MABT | 1X MAB, 0,1% Tween-20 | ||
| Acido maleico | Sigma-Aldrich | M0375 | |
| Paraformaldeide | Sigma Aldrich | 158127 | |
| PBS (10X)8 | % NaCl, 0,2% KCl, 1,44% Na2HPO4, 0,24% KH2PO4 | ||
| PBST | 1X PBS, 0,1% Tween-20 | ||
| PBST2 | 1X PBS, 0,2% Tween-20 | ||
| Cibo | Mescolare 2 g di spirulina e encapsulon di avannotti in 50 ml di acqua del sistema di pesce e agitare bene | ||
| Proteinasi K | Sigma-Aldrich | P5568 | Utilizzare per permeabilizzare le larve |
| Soluzione di proteinasi K | 20 μ g/mL, 1% di DMSO concentrazione finale in PBST | ||
| Spirulina polvere microfine | Argent | ||
| SSC (20X) | 3 M NaCl, 0,3 M acetato di sodio anidro, pH 7, autoclave | ||
| SSCT (0,2X) | Diluire da 20X SSC, 0,1% Tween-20 | ||
| SSCT (2X) | Diluire da 20X SSC, 0,1% Tween-20 | ||
| Tampone | di colorazione100 mM Tris pH 9,5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween-20 | ||
| Soluzione colorante | 200 μ g/mL di cloruro di iodonitrotetrazolio, 200 μ g/mL di sale disodico di 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato, in tampone di colorazione | ||
| Soluzione di arresto | 1 mM EDTA, pH 5,5, in PBST | ||
| Torula (lievito) RNA | Sigma-Aldrich | R6625 | |
| Tricaina | Sigma Aldrich | E10521 | 2%, pH 7 |
| Tampone | 50% formammide, 2X SSC, 0,1% Tween-20 |
Riferimenti
- Kinth, P., Mahesh, G., Panwar, Y. Mapping of zebrafish research: a global outlook. Zebrafish. 10 (4), 510-517 (2013).
- Grunwald, D. J., Eisen, J. S. Headwaters of the zebrafish - emergence of a new model vertebrate. Nature Reviews. Genetics. 3 (9), 717-724 (2002).<....
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Ristampe e permessi
