Fabbricazione microfluidica di microcapsule Core-Shell che trasportano sferoidi di cellule staminali pluripotenti umane

Summary

Questo articolo descrive l'incapsulamento di cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) utilizzando un dispositivo di messa a fuoco del flusso coassiale. Dimostriamo che questa tecnologia di incapsulamento microfluidico consente una formazione efficiente di sferoidi hPSC.

Abstract

Le colture tridimensionali (3D) o sferoidi di cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) offrono i vantaggi di migliori risultati di differenziazione e scalabilità. In questo articolo, descriviamo una strategia per la formazione robusta e riproducibile di sferoidi hPSC in cui un dispositivo di messa a fuoco del flusso coassiale viene utilizzato per intrappolare le hPSC all'interno di microcapsule core-shell. La soluzione principale conteneva sospensione monocellulare di hPSC ed è stata resa viscosa dall'incorporazione di poli(glicole etilenico) ad alto peso molecolare (PEG) e mezzi gradienti di densità. Il flusso di guscio comprendeva PEG-4 braccio-maleimmide o PEG-4-Mal e scorreva lungo il flusso centrale verso due giunzioni petrolifere consecutive. La formazione di goccioline si è verificata alla prima giunzione dell'olio con la soluzione del guscio che si avvolge attorno al nucleo. La reticolazione chimica del guscio si è verificata alla seconda giunzione dell'olio introducendo un reticolante di-tiolo (1,4-ditiotreitolo o DTT) a queste goccioline. Il reticolante reagisce con i gruppi funzionali della maleimmide tramite la chimica dei clic, con conseguente formazione di un guscio di idrogel attorno alle microcapsule. La nostra tecnologia di incapsulamento ha prodotto capsule da 400 μm di diametro ad una velocità di 10 capsule al secondo. Le capsule risultanti avevano un guscio di idrogel e un nucleo acquoso che permetteva alle singole cellule di assemblarsi rapidamente in aggregati e formare sferoidi. Il processo di incapsulamento non ha influenzato negativamente la vitalità delle hPSC, con una vitalità >95% osservata 3 giorni dopo l'incapsulamento. Per confronto, le hPSC incapsulate in microparticelle di gel solido (senza un nucleo acquoso) non formavano sferoidi e avevano una vitalità <50% 3 giorni dopo l'incapsulamento. La formazione sferoide di hPSC all'interno di microcapsule core-shell si è verificata entro 48 ore dall'incapsulamento, con il diametro sferoide in funzione della densità di inoculazione cellulare. Nel complesso, la tecnologia di incapsulamento microfluidico descritta in questo protocollo era adatta per l'incapsulamento delle hPSC e la formazione di sferoidi.

Introduction

C'è un notevole interesse per le colture 3D di cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) a causa del miglioramento della pluripotenza e del potenziale di differenziazione offerti da questo formato^{di coltura 1,2,3}. Le hPSC sono tipicamente formate in sferoidi o altri formati di coltura 3D per mezzo di bioreattori, microwell, idrogel e scaffold polimerici ^4,5,6. L'incapsulamento offre un altro mezzo per organizzare singole hPSC in sferoidi. Una volta incapsulati, gli sferoidi hPSC possono essere maneggiati con facilità e trasferiti in piastre di microtitolazione per la differenziazione, la modellazione della malattia o esperimenti di test antidroga. L'involucro di hPSC in uno strato di idrogel protegge anche le cellule dai danni da taglio e consente di coltivare sferoidi in un bioreattore ad alti tassi di agitazione⁷.

La nostra metodologia per l'incapsulamento delle cellule staminali si è evoluta nel tempo. In primo luogo, ci siamo concentrati sulle microparticelle di idrogel solido e abbiamo dimostrato successo nell'incapsulamento e nella coltivazione di cellule staminali embrionali di topo (mESC)⁸. Tuttavia, è stato notato che le cellule staminali embrionali umane (hESC) avevano una bassa vitalità quando incapsulate in tali microparticelle di idrogel, presumibilmente a causa della maggiore necessità per queste cellule di ristabilire i contatti cellula-cellula dopo l'incapsulamento. Abbiamo ragionato sul fatto che la microcapsula eterogenea, che possiede un nucleo acquoso, può essere più adatta per l'incapsulamento di cellule che si basano sul rapido ristabilimento dei contatti cellula-cellula. Il concetto di dispositivo microfluidico di focalizzazione del flusso coassiale per la produzione di microcapsule acquose a nucleo / guscio idrogel è stato adattato da He et ^al.9, ma invece dell'alginato impiegato nell'approccio originale, un idrogel a base di PEG è stato incorporato nel guscio. Abbiamo prima dimostrato il successo dell'incapsulamento e della formazione sferoide di epatociti primari in microcapsule¹⁰ del guscio centrale e più recentemente descritto incapsulamento di cellule hES e iPS⁷. Come delineato nella Figura 1A, le capsule sono fabbricate in un dispositivo di messa a fuoco del flusso in cui i flussi di flusso del guscio e del nucleo passano da un lato all'altro al flusso coassiale prima dell'espulsione nella fase dell'olio. Il flusso del nucleo contiene cellule e additivi che aumentano la viscosità della soluzione (PEG MW 35kD non reattivo e iodixanolo - nome commerciale OptiPrep) mentre il flusso del guscio contiene molecole reattive (PEG-4-Mal). Il flusso continuo coassiale viene discretizzato in goccioline che mantengono l'architettura core-shell. La struttura del guscio centrale è resa permanente dall'esposizione al reticolante di-tiolo (DTT), che reagisce con PEG-4-Mal tramite la chimica del clic e provoca la formazione di una pelle o di un guscio di idrogel sottile (~ 10 μm). Dopo che l'emulsione è stata rotta e le capsule sono state trasferite in una fase acquosa, le molecole di PEG si diffondono dal nucleo e vengono sostituite da molecole d'acqua. Ciò si traduce in microcapsule a nucleo acquoso e guscio idrogel.

Di seguito sono fornite istruzioni dettagliate su come realizzare dispositivi microfluidici, come preparare le cellule e come eseguire l'incapsulamento delle hPSC.

Protocol

1. Fabbricazione del dispositivo

1. Realizza i progetti per il dispositivo di microincapsulazione e il dispositivo di dissociazione utilizzando il software CAD^10,11.
2. Spin-coat i tre strati di SU-8 fotoresistono sequenzialmente su un wafer di silicio (Figura 2A) per ottenere strutture con le altezze desiderate: 60, 100 e 150 μm.
   NOTA: il processo per gli stampi superiore e inferiore è identico.
   1. Spin coat un wafer di silicio pulito da 10 cm con fotoresiste negativo SU-8 2025 a 1.100 rpm per creare il primo strato da 60 μm. Dopo una cottura morbida a 65 °C per 3 min e 95 °C per 10 min su una piastra calda, esporre lo stampo utilizzando un allineatore senza maschera caricando il file di progettazione del pattern del canale centrale sul PC μPG 101. Quindi, procedere con la cottura post-esposizione a 65 °C per 3 min e a 95 °C per 10 min.
   2. Ruotare il secondo strato SU-8 2025 (40 μm) a 1.500 rpm ed esporre caricando il file CAD appropriato per il modello di canale della shell.
      NOTA: le cotture morbide e post-esposizione erano simili al passaggio precedente.
   3. Ruotare il terzo strato su SU-8 2025 a 1.400 giri / min per raggiungere un'altezza di 50 μm e ripetere il processo di cui sopra ma esporre le strutture per la fase dell'olio.
   4. Sviluppa lo stampo con tutti e tre gli strati in un unico passaggio immergendolo nello sviluppatore SU-8 fino a quando non viene rimosso tutto il fotoresist non esposto.
   5. Cuocere duramente lo stampo su una piastra calda a 160 °C per 10 minuti per migliorare l'adesione e sigillare piccole crepe che potrebbero apparire dopo lo sviluppo.
   6. Esporre lo stampo al clorotrimetilsilano per evitare il legame con l'elastomero nella fase successiva e posizionarlo in piastre di Petri da 15 cm fino all'uso.
3. Preparare lo stampo del dispositivo di dissociazione nello stesso modo, come descritto nella Figura 1D e nella Figura 2B. Rivestire uno strato di fotoresiste SU-8 su un wafer di silicio, come descritto in precedenza nel passaggio 1.2.3, per ottenere strutture con l'altezza desiderata: 50 μm. Condurre la cottura morbida e post-esposizione, lo sviluppo e la cottura dura in modo simile al passaggio precedente.
   NOTA: una serie di montanti di forma triangolare copriva l'intera camera, con la spaziatura tra i montanti che diminuiva man mano che la larghezza della camera diminuiva verso l'uscita. I montanti triangolari erano 200 μm per lato con un passo che andava da 400 μm (all'ingresso) a 30 μm (all'uscita).
4. Preparare gli stampi mediante litografia morbida utilizzando polidimetilsilossano (PDMS).
   1. Mescolare la base di elastomero PDMS e l'agente polimerizzante dell'elastomero in un rapporto 10:1 w/w in una centrifuga planetaria. Versare la miscela su entrambi gli stampi master di microincapsulazione e sullo stampo master di dissociazione per creare uno strato di 3-4 mm.
      NOTA: Una miscela di 50 g di base di elastomero con 5 g di agente polimerizzante è sufficiente per coprire uno stampo principale con spessore di 3 mm.
   2. Posizionare le piastre di Petri contenenti gli stampi in un essiccatore sottovuoto per 15 minuti per degassare il PDMS non polimerizzato.
   3. Spostare le piastre di Petri in forno e cuocere a 80 °C per un minimo di 60 min.
   4. Togliere gli stampi master dal forno e lasciarli raffreddare. Usando un coltello di precisione, tagliare con cura il PDMS seguendo la forma del wafer e staccare i pezzi PDMS dallo stampo master.
   5. Ritagliare le lastre PDMS tagliando i bordi di ciascun dispositivo con un bisturi, quindi perforare le porte fluidiche di ingresso / uscita nel dispositivo di dissociazione e solo nel dispositivo microfluidico superiore utilizzando aghi in acciaio inossidabile. Coprire i dispositivi con nastro adesivo per evitare contaminazioni.
      NOTA: il calibro dell'ago è di 14 G e 15 G rispettivamente per le porte di ingresso e di uscita.
   6. Per l'incollaggio, trattare i lati modellati dei pezzi PDMS superiore e inferiore con plasma O₂ su un'incisore al plasma per 2 minuti.
   7. Allineare entrambe le parti PDMS sotto uno stereoscopio dopo aver aggiunto un sottile strato separatore di acqua distillata direttamente nei microcanali (2 μL).
   8. Posizionare il dispositivo PDMS allineato nel forno a 80 °C durante la notte per completare l'incollaggio e ripristinare il PDMS al suo stato idrofobo originale. Conservare i dispositivi fino a nuovo utilizzo.
      NOTA: ciò si traduce in un dispositivo di messa a fuoco del flusso coassiale con tre diverse altezze di 120 μm per il nucleo, 200 μm per il guscio e 300 μm per i canali dell'olio.
   9. Per utilizzare il dispositivo subito dopo il legame al plasma, iniettare con cura ma con fermezza 30 μL di soluzione di rivestimento idrofobo nei canali fluidici per ottenere un rivestimento idrofobo. Quindi, spurgare immediatamente l'aria nei canali fino a quando non si osservano residui della soluzione di rivestimento idrofobo nel dispositivo.
   10. Legare il dispositivo di dissociazione trattando prima il lato modellato del dispositivo e un vetro scorrevole pulito con plasma O₂ per 2 minuti, quindi assemblarli per un'ulteriore polimerizzazione nel forno a 80 ° C durante la notte.
       NOTA: i dispositivi possono essere conservati fino a nuovo utilizzo.

2. Preparazione delle soluzioni

1. Soluzioni stock. In primo luogo, preparare soluzioni stock (soluzioni concentrate) che saranno diluite a concentrazioni più basse per l'uso effettivo.
   NOTA: le soluzioni stock vengono utilizzate per risparmiare tempo di preparazione, conservare i materiali, ridurre lo spazio di stoccaggio e migliorare l'accuratezza durante la preparazione di una soluzione di lavoro in concentrazioni inferiori.
   1. Preparare 30 mL di soluzione 2x core (16% PEG e 34% density gradient media): mescolare 4,8 g di 35 kDa PEG, 10,2 mL di density gradient media e 19,8 mL di DMEM/F12 media. Filtrare questa soluzione di base utilizzando un filtro a siringa da 0,22 μm.
   2. Preparare 50 ml di olio minerale con tensioattivo al 3%: mescolare 48,5 ml di olio minerale e 1,5 ml di tensioattivo. Conservare in condizioni sterili dopo la filtrazione attraverso un filtro a siringa da 0,22 μm.
   3. Preparare 50 ml di olio minerale con tensioattivo allo 0,5%: mescolare 49,75 ml di olio minerale e 0,25 ml di tensioattivo. Mantenere in condizioni sterili.
   4. Preparare 1 M ditioteritolo (DTT): sciogliere 1,5425 g di DTT in 10 ml di acqua distillata. Mantenere in condizioni sterili.
   5. Preparare 1 M di trietanolamina (TEA): aggiungere 66,4 μL di TEA in 433,6 μL di acqua distillata. Mantenere in condizioni sterili.
   6. Preparare 1% Pluronic F127 (PF127): sciogliere 100 mg di PF127 in 10 ml di acqua distillata. Mantenere in condizioni sterili.
2. Soluzioni di lavoro
   1. Preparare un'emulsione reticolante mescolando 4,5 mL di olio minerale con tensioattivo al 3% e 300 μL di 1 M DTT (rapporto 1:15). Vortice la soluzione per 2 min e sonicare per 45-60 min in un bagno ad ultrasuoni a 20 °C. Caricare questa soluzione su una siringa da 5 ml con un ago da 27 G.
      NOTA: L'emulsione è generata dalla miscela sonicante olio/acqua.
   2. Preparare la soluzione di olio schermante caricando l'olio minerale con tensioattivo allo 0,5% su una siringa da 5 ml con un ago da 27 G.
   3. Preparare la soluzione di guscio (8% p/v PEG-4-Mal e 15 mM TEA) aggiungendo 32 mg di PEG-4-Mal in 400 μL di 1x DPBS per formare una soluzione all'8% p/v e vorticare la soluzione per 2 min. Quindi, aggiungere 6 μL di 1 M TEA (concentrazione finale 15 mM TEA). Infine, centrifugare a 13.000 x g per 5 minuti attraverso un filtro di rotazione e tenerlo al buio sul bilanciere per 30 minuti. Quindi, caricare questa soluzione su una siringa da 1 mL con un ago da 27 G.
      NOTA: Lasciare riposare il contenitore PEG-4-Mal a temperatura ambiente per 10 minuti prima di aprire il coperchio e soffiare il gas N₂ per sostituire L'O₂ con N₂ prima di chiudere il coperchio. Vortex TEA prima di aggiungere alla soluzione.
3. Preparare la sospensione cellulare in soluzione di base
   1. Trattare le hPSC con tripsina per 5-10 minuti a 37 °C. Quindi, raccoglili dai piatti. Spegnere la tripsina con il mezzo dopo il distacco cellulare, quindi trasferire le cellule in un tubo conico da 15 ml.
   2. Centrifugare la sospensione di celle sfuse (400 x g, 5 min). Aspirare accuratamente il surnatante e quindi risospesare il pellet cellulare utilizzando un volume minimo di terreno di crescita. Contare le celle utilizzando un contatore di celle automatizzato.
      NOTA: le aliquote cellulari tipiche contengono 12-20 x 10⁶ celle e sono sufficienti per produrre 400 μL della soluzione del nucleo.
   3. Prelevare 12-20 x 10⁶ celle dalla sospensione di massa cellulare e centrifugare la sospensione cella/media (400 x g, 5 min).
   4. Aspirare accuratamente il mezzo dal pellet cellulare. Quindi, aggiungere 200 μL di mezzi e 200 μL di 2x soluzione PEG (concentrazione finale 30-50 x 10⁶ celle/mL) e mescolare delicatamente.
      NOTA: Basse concentrazioni cellulari (meno di 20 x 10⁶ cellule/ml) hanno provocato molte capsule vuote.
   5. Aggiungere 30 μL di PF127 all'1% alla soluzione.
   6. Inserire una micro barra agitatrice (2 mm x 7 mm) in una siringa da 1 mL, quindi caricare la soluzione del nucleo contenente la cella sulla siringa con un ago da 27 G. Mantenere la soluzione fredda con ghiaccio durante l'intero processo di incapsulamento.

3. Configurazione sperimentale

1. Posizionare il dispositivo a goccia PDMS incollato, quattro pezzi di microtubi di ingresso lunghi 20 cm e un pezzo di microtubi di ingresso lunghi 5 cm (0,38 mm ID x 1,1 mm O.D.), un pezzo di tubo di uscita da 10 cm (0,5 mm ID x 1,5 mm O.D.) e sei pezzi di tubi di raccordo da 0,5 cm (1 mm ID x 1,8 mm O.D.) sotto una sorgente luminosa germicida (tipicamente integrata negli armadi di sicurezza biologica) e sterilizzare per 30 Min.
2. Utilizzare una pinza per inserire il tubo nelle porte di ingresso fluidiche e nelle porte di dissociazione.
3. Utilizzare i tre pezzi di microtubi di ingresso lunghi 20 cm per il guscio, l'olio, gli ingressi di emulsione reticolante e un pezzo per l'ingresso del dispositivo di dissociazione. Quindi, inserire l'estremità opposta dei tubi all'ago della siringa con la soluzione corrispondente. Nel frattempo, collegare l'ingresso principale del dispositivo microfluidico e l'uscita del dispositivo di dissociazione con un microtubo di 5 cm (Figura 1C).
   NOTA: i microtubi di ingresso devono essere fissati saldamente all'interno dei tubi di raccordo, che sono stati inseriti nell'ultimo passaggio.
4. Inserire un tubo di uscita nella porta di uscita fluidica e posizionare l'estremità opposta in un serbatoio di raccolta.
5. Posizionare il dispositivo su uno stadio del microscopio e collegare il tubo per evitare di muoversi. Allineare e focalizzare il microscopio sull'ugello del dispositivo per l'ispezione del flusso.
6. Posizionare ogni siringa su diverse pompe a siringa e fissarla correttamente (Figura 1B). Programmare ogni pompa secondo i protocolli del produttore alle seguenti portate: nucleo (3-5 μL/min), guscio (3-5 μL/min), olio schermante (20-80 μL/min) e olio reticolante (40-60 μL/min). Avviare il flusso in tutte le pompe.
7. Attendere che ogni fluido entri nel dispositivo e riempire i canali mentre si spinge fuori l'aria rimanente.
   NOTA: se c'è una grande quantità di aria nel tubo di ingresso, aumentare temporaneamente ogni portata fino a quando l'aria non viene completamente rimossa. Tieni presente che una portata eccessiva potrebbe portare al fallimento del legame PDMS-PDMS.
8. Quando la formazione della capsula è stabilizzata (Figura 3), posizionare l'estremità opposta del tubo di raccolta su un nuovo tubo conico con 5 mL di mezzo mTeSR.
   NOTA: Il mezzo contiene 10 μM di inibitore ROCK, 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina.
9. Dopo aver raccolto un numero sufficiente di capsule, incubare a 37 °C con il 5% di CO₂ per 10 minuti. Le capsule che risiedono nella fase oleosa saranno nella parte superiore del tubo (vedere Figura 4A). Picchiettando delicatamente sul tubo le capsule si sedimentano sul fondo. Dopo questo, la maggior parte dell'olio e dei mezzi può essere aspirata.
10. Raccogliere le capsule dal fondo del tubo conico, posizionarle su un colino cellulare (dimensione dei pori di 100 μm) e lavare con abbondanti quantità di mezzi. Quindi, raccogliere le microcapsule utilizzando 2 mL di terreno in una piastra di coltura a 6 pozzetti facendo scorrere il fluido attraverso il filtro mentre viene invertito sopra la piastra del pozzo (vedere la Figura 4A).

4. Coltura e analisi di hPSC in microcapsule

1. Cultura di base
   1. Incubare le capsule di cellule staminali in un piatto di coltura a 6 pozzetti a 37 °C con il 5% di CO₂.
   2. Cambiare i supporti a giorni alterni raccogliendo le capsule su un filtro filtrante cellulare, lavandole con mezzi in eccesso e riutilizzandole in un nuovo pozzo in piastre a 6 pozzetti con 2 mL di supporto come è stato fatto nel passaggio 3.10.
   3. Coltivare le capsule per almeno 10 giorni.
2. Eseguire il test vivo/morto per determinare la vitalità delle cellule staminali incapsulate.
   1. Scongelare soluzioni di saggio vivo/morto (ethidium homodimer-1 e calcein AM).
   2. Aggiungere 4 μL dell'omodimero-1 all'etidio da 2 μM e 1 μL delle soluzioni di calceina AM da 4 μM a 2 ml di DPBS sterile. Vortice per garantire la miscelazione completa.
   3. Raccogliere circa 100 microcapsule su un filtro cellulare e risciacquarle con DPBS sterile per consentire la diffusione del mezzo dalle capsule.
   4. Raccoglierli nuovamente in una piastra di coltura a 12 pozzetti utilizzando 1 mL della soluzione preparata al punto 4.2.2. Incubare a 37 °C per 20 min.
   5. Visualizza le cellule al microscopio a fluorescenza.
      NOTA: la vitalità cellulare viene quantificata calcolando la percentuale di cellule vive, che vengono visualizzate come verdi, tra il numero totale di cellule.
3. Caratterizzazione delle dimensioni sferoidi.
   1. Quando lo si desidera, posizionare la piastra del pozzo con microcapsule al microscopio e misurare il diametro degli sferoidi mostrati sul relativo software con apposite barre di scala.
   2. Misurare e analizzare la dimensione dello sferoide.

Results

Seguendo il protocollo sopra menzionato, il lettore sarà in grado di fabbricare dispositivi microfluidici e produrre microcapsule portatrici di cellule. La Figura 3A mostra esempi di microcapsule ottimali e non ottimali fabbricate utilizzando la generazione di goccioline microfluidiche. Diverse formulazioni di PEG-4-Mal hanno portato a capsule di morfologia variabile: le capsule rugose erano associate a scarsa gelificazione, bassa integrità meccanica e non resistevano alla coltivazione in un...

Discussion

Il processo di incapsulamento qui descritto si traduce nella formazione riproducibile di sferoidi hPSC. Il formato a microcapsula facilita l'erogazione di sferoidi nei pozzetti di una piastra di microtitolazione per esperimenti volti a migliorare/ottimizzare i protocolli di differenziazione o testare terapie. Gli sferoidi a cellule staminali incapsulati possono anche essere utilizzati in colture di sospensioni in cui il guscio di idrogel protegge le cellule dai danni indotti dal taglio⁷.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,22 µ m Filtri per siringhe	Genesee Scientific	25-244
1 ml siringa luer-lock tip	BD	309628
1x DPBS	Corning	23220003
PEG maleimmide a 4 bracci, 10kDa	Laysan Inc.	164-68
Siringa da 5 ml punta luer-lock	BD	309646
PIASTRA NON TRATTATA A 6 POZZETTI	USA Scientific	CC7672-7506
Aquapel Applicator Pack	Aquapel Glass Treatment	47100
Software CAD	Autodesk	AutoCAD v2020
CELL STRAINER 100 &; m dimensione dei pori	cardinale	335583
Clorotrimetilsilano	Aldrich	386529-100mL
Countess II FL Contatore di celle automatizzato Tecnologia	di vita	A27974
Piastra riscaldante digitale	Piastra
Miscelatore digitale a vortice	Fisher	Scientific 215370
Acqua distillata	Gibco	15230-162
Ditiotheritol (DTT)	Sigma	D0632-10G
DMEM/F12 media	gibco	11320-033
Falcon 15 mL Provette per centrifuga coniche	Fisher scientific	14-959-53A
Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuga	dal vivo	13-100-675
HERACELL VIOS 160i Incubatore a CO2	Thermo Scientific	50144906
Microscopio motorizzato a fluorescenza invertita	Olympus	Olympus IX83
Laurell Spin Coaters	Laurell Technologies	WS-650MZ-23NPPB
Kit di colorazione per mammiferi vivi/morti	Fisher	L3224
Nastro	magico Graffe	483535
Micro tubi medici (0,015" ID x 0,043" OD)	Scientific Commodities, Inc	BB31695-PE/2
Micro agitatore	Daigger Scientific	EF3288E
MilliporePinza per filtro Sigma Fisher	scientific	XX6200006P
Olio minerale	Sigma	M8410-1L
mTeSR 1 Mezzo basale	STEMCELL TECHNOLOGY	85850
Aghi-Acciaio inossidabile  14 Gauge	Alimentazione CML	901-14-025
Aghi-Acciaio inossidabile  15 Gauge	Alimentazione CML	901-15-050
OptiPrep	STEMCELL TECHNOLOGY	7820
Forno	Thermo Scientific	HERA THERM Forno
Penicillina: Streptomicina (10.000 U/mL Penicillina G, 10mg/mL Streptomicina)	Gemini	400-109
Petri Piatto 150X20 Sfiato Sterile	Sarstedt, Inc.	82.1184.500
Sistema di pulizia al plasma	Yield Engineering System, Inc.	YES-G500
Pluronic F-127	Sigma	P2443-250G
Poli(glicole etilenico) 35kDa	Sigma	94646-250G-F
PrecisionGlide Needle 27G	BD	305109
Inibitore della roccia Y-27632 diidrocloride	SELLECK CHEM	S1049-10mg
Wafer di silicio 100mm	University Wafer	452
Vetrino scorrevole (75 mm e acuto; 25 mm)	CardinalHealth	M6146
Span 80	Sigma	S6760-250ML
SpeedMixer	Thinky	ARE-310
Spin-X Centrifuga Tubo Filtro (0,22 & micro; m)	Costar	8160
SU-8 2025	Kayaku Advanced Materials	Y111069 0500L1GL
SU-8 sviluppatore	Kayaku Advanced Materials	Y020100 4000L1PE
Design chirurgico Royaltek Lame per bisturi chirurgiche in acciaio inossidabile	fisher scientific	22-079-684
SYLGARD TM 184 Kit elastomero siliconico (PDMS)	Dow Corning	2065622
Pompa a siringa	New Era Pump System, Inc	NE-4000
Trietanolammina	Sigma-aldrich	T58300-25G
TrypLE Express	Gibco	12604-013
Tygon Tubing (0,02" ID x 0,06" OD)	Tubi Cole-Parmer	06419-01
Tygon (0,04" ID x 0,07" OD)	Cole-Parmer	06419-04
Pulitore ad ultrasuoni FS20D	Fisher Scientific	CPN-962-152R
Essiccatore sottovuoto	Bel-Art	F42025-0000
Zeiss Stemi DV4 Stereomicroscopio 8x-32x	ZEISS	435421-0000-000
μ Scrittore laser PG 101	Heidelberg Instruments	HI 1128