Method Article

Saggio di metilazione del DNA accoppiato a endonucleasi a fluorescenza continua per lo screening degli inibitori della DNA metiltransferasi

DOI:

10.3791/62949

⸱

August 5th, 2022

 ,  , 
1Department of Chemistry, Bucknell University, 2Program in Cell Biology/Biochemistry, Bucknell University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le DNA metiltransferasi sono potenziali bersagli di farmaci antitumorali. Qui, viene presentato un protocollo per valutare piccole molecole per l'inibizione della DNA metiltransferasi. Questo test utilizza un'endonucleasi per accoppiare la metilazione del DNA alla generazione di fluorescenza e consente di monitorare l'attività enzimatica in tempo reale.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La metilazione del DNA, una forma di regolazione genica epigenetica, è importante per la normale funzione cellulare. Nelle cellule, le proteine chiamate DNA metiltransferasi (DNMT) stabiliscono e mantengono il modello di metilazione del DNA. Le modifiche al normale modello di metilazione del DNA sono legate allo sviluppo e alla progressione del cancro, rendendo i DNMT potenziali bersagli di farmaci antitumorali. Pertanto, identificare e caratterizzare nuovi inibitori di piccole molecole di questi enzimi è di grande importanza. Questo documento presenta un protocollo che può essere utilizzato per lo screening degli inibitori della DNA metiltransferasi. Il test di cinetica accoppiata continua consente di determinare le velocità iniziali di metilazione del DNA in presenza e assenza di potenziali inibitori di piccole molecole. Il test utilizza l'endonucleasi metil-sensibile Gla I per accoppiare la metilazione di un substrato di DNA emimetilato alla generazione di fluorescenza.

Questo test continuo consente di monitorare l'attività enzimatica in tempo reale. Condurre il test in piccoli volumi in piastre di microtitolazione riduce il costo dei reagenti. Utilizzando questo test, è stato condotto un piccolo esempio di screening per gli inibitori di DNMT1, l'isoenzima DNMT più abbondante nell'uomo. Il prodotto naturale antrachinone altamente sostituito, l'acido laccaico A, è un potente inibitore competitivo del DNA di DNMT1. Qui, esaminiamo tre potenziali inibitori di piccole molecole - antrachinoni o molecole simili all'antrachinone con uno o tre sostituenti - a due concentrazioni per descrivere il protocollo di analisi. Le velocità iniziali vengono utilizzate per calcolare l'attività percentuale osservata in presenza di ciascuna molecola. Uno dei tre composti esaminati mostra un'inibizione concentrazione-dipendente dell'attività di DNMT1, indicando che si tratta di un potenziale inibitore di DNMT1.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La metilazione del DNA è un importante marchio epigenetico che regola l'espressione genica e la struttura della cromatina. La metilazione si verifica prevalentemente nei dinucleotidi CpG - citosina seguita da guanosina; Il gruppo metilico viene aggiunto alla posizione 5 della citosina. Sono necessari corretti modelli di metilazione del DNA, e quindi una corretta espressione genica, per un appropriato sviluppo e funzione cellulare. Molti stati patologici sono stati associati a cambiamenti nel normale modello di metilazione 1,2,3. Ad esempio, esiste un legame tra l'inizio e la progressione del cancro e le alterazioni del modello di metilazione del DNA. Tipicamente, le cellule tumorali mostrano livelli complessivi più bassi di metilcitosina, che contribuisce all'instabilità del genoma. Allo stesso tempo, la metilcitosina presente nel genoma è concentrata nelle regioni promotrici dei geni oncosoppressori, che porta al silenziamento genico di queste importanti proteine. In particolare, i cambiamenti epigenetici sono dinamici e reversibili, a differenza delle mutazioni del DNA associate alla tumorigenesi. Ciò ha reso le proteine coinvolte nella regolazione genica epigenetica interessanti bersagli farmacologici 2,4.

Le DNA metiltransferasi (DNMT) sono le proteine responsabili della generazione e del mantenimento dei modelli di metilazione del DNA. Tre isoenzimi cataliticamente attivi, DNMT1, DNMT3a e DNMT3b, esistono negli esseri umani. Durante lo sviluppo e la differenziazione, le metiltransferasi de novo, DNMT3a e DNMT3b, stabiliscono modelli di metilazione. Entrambi gli enzimi possono legare la proteina DNMT3L cataliticamente inattiva per formare complessi che mostrano una maggiore attività 1,5. Dopo la divisione cellulare, le cellule figlie contengono DNA emimetilato - DNA contenente metilcitosina in un solo filamento del duplex - perché il DNA appena sintetizzato è privo di segni di metilazione. La funzione principale di DNMT1 è quella di metilare questo DNA emimetilato, ristabilendo così il modello di metilazione completo 1,5.

I legami tra l'attività di DNMT e il cancro sono ben stabiliti. La sovraespressione di DNMT1, sia attraverso meccanismi trascrizionali che post-traduzionali, è una conseguenza di diverse vie oncogeniche comuni 6,7,8,9. Gli approcci genetici per ridurre l'attività di DNMT1 utilizzando alleli ipomorfici determinano una diminuzione della formazione di tumore nei topi Apc (Min) 10. Gli oligonucleotidi antisenso che abbattono DNMT1 inibiscono la neoplasia in colture cellulari e modelli tumorali murini11,12. Pertanto, l'inibizione dell'attività DNMT1 sembra un approccio promettente alla terapia del cancro. Tuttavia, i ruoli che gli isoenzimi DNMT3 svolgono non sono così semplici. Le mutazioni di DNMT3a si trovano nella leucemia mieloide acuta13 e nella sindrome mielodisplastica14. Almeno una delle mutazioni identificate ha dimostrato di diminuire l'attività di metilazione del DNA dell'enzima15. Tuttavia, DNMT3b è sovraespresso nel cancro al seno16 e nel cancro del colon-retto17. Con i vari isoenzimi DNMT che svolgono ruoli diversi nella carcinogenesi, l'identificazione di inibitori isoenzimatici specifici sarà fondamentale. Non solo questi composti saranno utili per lo sviluppo di terapie, ma gli inibitori isoenzimatico-specifici sarebbero anche uno strumento inestimabile per analizzare il ruolo di ciascun isoenzima DNMT nell'eziologia del cancro.

In letteratura sono stati riportati diversi inibitori della DNMT. Gli inibitori DNMT noti possono essere suddivisi in due classi: nucleoside e non nucleoside. Gli inibitori nucleosidici sono tipicamente analoghi della citidina. Questi composti sono incorporati nel DNA e intrappolano covalentemente i DNMT. 5-azacitidina e 5-aza-2'-deossicitidina sono stati approvati per il trattamento della sindrome mielodisplastica e della leucemia mieloide acuta 4,18. L'elevata tossicità, la bassa biodisponibilità e l'instabilità chimica di questi composti presentano problemi. Il lavoro in corso sta esaminando l'efficacia della prossima generazione di inibitori nucleosidici; SGI-110, derivato dalla 5-aza-2'-deossicitidina, è un esempio 19,20. Gli inibitori nucleosidici non sono isoenzimo-specifici e inattiveranno qualsiasi isoenzima DNMT incontrato. Pertanto, il trattamento con un agente nucleosidico demetilante determina la deplezione di tutti gli isoenzimi DNMT 4,18. Gli inibitori non nucleosidici non hanno bisogno di essere incorporati nel DNA per esercitare i loro effetti inibitori. Invece, queste molecole si legano direttamente ai DNMT, introducendo la possibilità di inibizione isoenzima-specifica. Diversi inibitori non-nucleosidici sono stati scoperti fino ad oggi, tra cui SGI-1027 21, idralazina 22, procainamide 23, RG108 e derivati 24, e prodotti naturali, (-)-epigallocatechina 3-gallato (EGCG)25 e acido laccaico A 26,27. La maggior parte degli inibitori non nucleosidici scoperti fino ad oggi non sono isoenzimi-selettivi o mostrano preferenze deboli per un isoenzima DNMT. Inoltre, la potenza di queste molecole deve essere migliorata, specialmente nelle cellule 4,18. Pertanto, vi è la necessità di scoprire o sviluppare inibitori DNMT più potenti e isoenzimatici.

Un ostacolo alla scoperta di nuovi inibitori di piccole molecole di DNMT sono i laboriosi saggi tradizionalmente utilizzati per esaminare l'attività DNMT28. I saggi sono generalmente discontinui con più passaggi. L'attività enzimatica dei DNMT viene ancora regolarmente analizzata utilizzando S-adenosil metionina radioattiva (SAM)29,30,31,32,33,34. Sono stati sviluppati anche saggi non radioattivi per la metilazione del DNA. Ad esempio, sono stati descritti saggi che utilizzano endonucleasi di restrizione metil-sensibile ed elettroforesi per separare i prodotti della digestione35,36. Questi tipi di saggi discontinui e multistep non sono facilmente suscettibili di scoperta di farmaci. Dalla metà degli anni 2000, sono stati sviluppati diversi saggi di metilazione del DNA con un throughput più elevato28. Un saggio di prossimità a scintillazione è stato utilizzato per lo screening degli inibitori DNMT137. Un altro test che utilizza un'endonucleasi di restrizione metil-sensibile è stato utilizzato per lo screening degli inibitori DNMT3a25,38. Mentre entrambi i test hanno consentito una maggiore produttività rispetto ai tradizionali test di metilazione del DNA, i test richiedono più passaggi e non consentono l'osservazione dell'attività di metilazione in tempo reale. Più recentemente, è stato descritto un saggio cinetico continuo che accoppia la formazione di S-adenosilomocisteina (SAH), un prodotto della reazione di metilazione, al cambiamento spettroscopico a 340 nm associato all'ossidazione NADPH39. Questo test utilizza tre enzimi di accoppiamento per generare un segnale spettroscopico.

Abbiamo sviluppato un saggio di metilazione del DNA accoppiato a endonucleasi basato sulla fluorescenza che utilizza un singolo enzima di accoppiamento disponibile in commercio e può generare dati in tempo reale (Figura 1). Un oligonucleotide a forcina contenente tre metilcitosine viene utilizzato come substrato. Il DNA del substrato contiene un fluoroforo all'estremità 5' e un quencher all'estremità 3'. La metilazione del sito CpG emimetilato genera il sito di scissione per l'endonucleasi Gla I - GCGC completamente metilato. La scissione Gla I dell'oligonucleotide prodotto rilascia il fluoroforo dal quencher e genera fluorescenza in tempo reale. Il test può essere utilizzato per esaminare l'attività di qualsiasi isoforma di DNMT; tuttavia, si osserva una maggiore attività con DNMT1 poiché questo isoenzima metila preferenzialmente il DNA emimetilato 1,5. Un'attività ancora più robusta si osserva se il dominio RFTS (Replication Foci Targeting Sequence) autoinibitorio viene rimosso da DNMT1. Questo dominio, che si trova nella regione regolatoria N-terminale, si lega al sito catalitico e impedisce il legame del DNA. La rimozione dei primi ~ 600 amminoacidi si traduce in un enzima troncato che è significativamente più attivo dell'enzima a lunghezza intera (aumento di ~ 640 volte in kcat / Km)40. Questa forma attivata dell'enzima, denominata DNMT1 privo di RFTS (aminoacidi 621-1616), consente una più facile identificazione degli inibitori grazie al suo maggiore potere catalitico. Questo articolo presenta un protocollo per utilizzare DNMT1 privo di RFTS nei saggi per lo screening di potenziali inibitori di piccole molecole. Utilizzando il saggio continuo accoppiato all'endonucleasi, la velocità iniziale viene determinata in presenza e assenza di alcune piccole molecole. Ogni potenziale inibitore viene esaminato a due concentrazioni per cercare l'inibizione DNMT1 dipendente dalla concentrazione. La percentuale di attività osservata in presenza delle piccole molecole è stata calcolata in ciascun caso.

figure-introduction-1
Figura 1: Saggio di metilazione del DNA. Come substrato viene utilizzato un DNA a forcina emimetilata con un fluoroforo all'estremità 5' e un quencher all'estremità 3'. DNMT1 catalizza il trasferimento del gruppo metilico dalla S-adenosilmetionina al sito CpG non metilato, generando S-adenosilomocisteina e DNA completamente metilato. Il prodotto del DNA contiene il sito di scissione per l'endonucleasi Gla I, che fende i siti GCGC completamente metilati. La scissione del DNA del prodotto rilascia il fluoroforo 5' dal quencher 3', generando fluorescenza. Abbreviazioni: Fl = fluoroforo; Q = quencher; DNMT1 = DNA metiltransferasi 1; SAM = S-adenosilmetionina; SAH = S-adenosilomocisteina. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparare soluzioni di analisi per lo schermo

NOTA: Le concentrazioni dei substrati utilizzati in questo test possono essere adattate. Per DNMT1 privo di RFTS, i valori di Km determinati sperimentalmente per il substrato del DNA hairpin e SAM sono 1-2 nM e 2 μM, rispettivamente26,40.

  1. Preparare 600 μL di ciascuna condizione di analisi da testare in provette da microcentrifuga su ghiaccio.
    NOTA: il volume totale della soluzione di analisi necessaria dipende dal numero di repliche condotte. Ogni condizione di analisi è stata eseguita in triplice copia per questo protocollo.
    1. Aggiungere ddH2 O e 5x tampone di metilazione (250 mM Tris pH 7,5, 5 mM MgCl2, 500 mM glutammato di potassio, 5 mM ditiotreitolo (DTT), 25% glicerolo) a ciascuna provetta per ottenere una concentrazione finale di 1x tampone. Per i saggi contenenti 20 μM di composto, aggiungere 472 μL di ddH2O e 120 μL di tampone 5x. Per i saggi contenenti 50 μM di composto, aggiungere 470 μL di ddH2O e 120 μL di tampone 5x.
    2. Aggiungere 3,15 μL di 20 mg/ml di albumina sierica bovina (BSA) a ciascun campione.
    3. Aggiungere 2 μL di substrato di DNA a forcina da 3,15 μM e 1,33 μL di 4,75 mM SAM a ciascun campione.
      NOTA: La concentrazione di substrati nella miscela della soluzione di analisi è 1,05 volte le concentrazioni finali desiderate.
    4. Aggiungere inibitore a una concentrazione finale di 21 μM (1,26 μL di 10 mM) o 52,5 μM (3,15 μL di 10 mM) ai campioni appropriati. Aggiungere una quantità equivalente di dimetilsolfossido (DMSO) a un campione di controllo.
      NOTA: La concentrazione di inibitore utilizzata nello schermo può essere variata. La concentrazione finale massima di DMSO deve essere ≤5% (v/v). Concentrazioni di DMSO fino al 5% (v/v) non hanno alcun effetto sull'attività osservata nel saggio26.
  2. Miscelare le soluzioni mediante vortice (3.000 giri/min) per 3 s. Centrifugare i campioni per alcuni secondi in una mini centrifuga da tavolo (1.200 × g) per assicurarsi che la soluzione venga raccolta sul fondo del tubo.
  3. Aliquot 95 μL di ciascuna soluzione di saggio in 6 pozzetti consecutivi in una piastra nera a semiarea da 96 pozzetti (Figura 2).
    NOTA: Questi test di screening sono stati eseguiti in due lotti. In primo luogo, sono stati esaminati 20 campioni di inibitori μM (4 condizioni totali), seguiti dai campioni di inibitori di 50 μM (4 condizioni totali).

figure-protocol-1
Figura 2: Impostazione della piastra di analisi. Ogni soluzione di analisi è aliquotata in sei pozzetti nella piastra nera a 96 pozzetti: controllo DMSO (blu), composto 1 (verde), composto 2 (rosso) e composto 3 (giallo). Sia DNMT1 che Gla I privi di RFTS saranno aggiunti a tre pozzi. Come controllo, solo Gla I sarà aggiunto agli altri tre pozzi. Abbreviazioni: RFTS = Replication Foci Targeting Sequence; DNMT1 = DNA metiltransferasi 1; DMSO = dimetilsolfossido. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

2. Preparare soluzioni enzimatiche per lo screening

NOTA: DNMT1 privo di RFTS può essere espresso in E. coli e purificato fino all'omogeneità. Le procedure di espressione e purificazione per DNMT1 privo di RFTS sono state descritte in precedenza41. Il volume di enzima necessario dipende dal numero di saggi condotti. Qui, quattro diversi test vengono eseguiti in ogni set; Ogni saggio è completato in triplice copia.

  1. Preparare 75 μL di ciascuna soluzione enzimatica in provette da microcentrifuga su ghiaccio.
    NOTA: saranno necessarie due soluzioni enzimatiche. Una soluzione conterrà DNMT1 e Gla I; l'altro conterrà solo Gla I.
    1. Aggiungere ddH2 O e 5x tampone di metilazione (250 mM Tris pH 7,5, 5 mM MgCl2, 500 mM glutammato di potassio, 5 mM DTT, 25% glicerolo) a ciascuna provetta per ottenere una concentrazione finale di 1x tampone. Per la soluzione enzimatica Gla I, aggiungere 15 μL di tampone 5x e 58,8 μL ddH2O. Per la soluzione enzimatica DNMT1+Gla I, aggiungere 15 μL di tampone 5x e 58,2 μL ddH2O.
    2. Aggiungere 1,2 μL di 10 U/μL Gla I a ciascuna soluzione per una concentrazione finale di 0,16 U/μL.
    3. Aggiungere 0,6 μL di DNMT1 privo di RFTS da 5 μM per una concentrazione finale di 40 nM alla soluzione DNMT1+Gla I.
  2. Picchiettare delicatamente per mescolare le soluzioni. Centrifugare i campioni per alcuni secondi in una mini centrifuga da tavolo (1.200 × g) per assicurarsi che la soluzione venga raccolta sul fondo del tubo.
  3. Aliquot 12 μL di ciascuna soluzione enzimatica in 6 pozzetti in una piastra a 96 pozzetti con fondo conico (Figura 3).

figure-protocol-2
Figura 3: Impostazione della piastra enzimatica. Le soluzioni Gla I (grigio) e DNMT1+Gla I (blu) sono ciascuna suddivisa in sei pozzetti nella piastra da 96 pozzetti. Utilizzando un pipet multicanale, l'enzima può essere aggiunto a una fila di soluzioni di analisi contemporaneamente. Per ogni condizione di analisi (sei pozzi), tre pozzi riceveranno DNMT1 + Gla I e tre pozzi riceveranno Gla I da solo. Abbreviazione: DNMT1 = DNA metiltransferasi 1. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

3. Eseguire il test e analizzare i dati.

  1. Preriscaldare il lettore di piastre a 37 °C. Inserire la piastra nera contenente le soluzioni di analisi. Agitare la piastra (orbitale doppia a 425 cpm per 5 s) e leggere la fluorescenza con una lunghezza d'onda di eccitazione di 485 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 528 nm. Incubare la piastra a 37 °C per 5 min.
    NOTA: In alternativa, è possibile utilizzare filtri con cutoff di lunghezza d'onda appropriati per le letture di fluorescenza.
  2. Rimuovere la piastra di analisi. Aggiungere 5 μL di soluzione enzimatica a ciascun pozzetto e mescolare mediante pipettaggio su e giù.
    NOTA: utilizzare pipet multicanale in modo che una riga di campioni possa essere avviata contemporaneamente.
  3. Inserire la piastra nel lettore di piastre. Registrare la fluorescenza ogni 53 s per 30 minuti. Agitare la piastra (orbitale doppia a 425 cpm per 4 s) prima di ogni lettura.
  4. Saggi di controllo Gla I triplicati medi per ciascuna condizione. Sottrarre la traccia media della reazione di controllo contenente Gla I dalle tracce triplicate ottenute in presenza di DNMT1 privo di RFTS. Determinare l'errore medio e standard della media per le repliche corrette.
  5. Tracciare la traccia di reazione corretta media e adattare la porzione lineare iniziale a una linea per determinare la velocità iniziale.
  6. Determinare la percentuale di attività dividendo la velocità osservata in presenza di un composto per la velocità osservata nella reazione di controllo contenente DMSO e moltiplicando per 100.

4. Controllo aggiuntivo del saggio — aggiunta sequenziale di enzimi

  1. Preparare 550 μL di soluzione di dosaggio in una provetta da microcentrifuga su ghiaccio. Aggiungere 110 μL di tampone di metilazione 5x, 3,88 μL di substrato di DNA hairpin da 3,15 μM, 6,43 μL di 47,5 mM SAM, 3,06 μL di 20 mg/mL BSA e 426,6 μL di ddH2O.
  2. Miscelare la soluzione mediante vortice (3.000 giri/min) per 3 s. Centrifugare i campioni per alcuni secondi in una mini centrifuga da tavolo (1.200 × g) per assicurarsi che la soluzione venga raccolta sul fondo del tubo.
  3. Aliquot 90 μL della soluzione di analisi in 6 pozzetti consecutivi in una piastra nera a semiarea da 96 pozzetti.
  4. Preparare le soluzioni enzimatiche DNMT1 su ghiaccio. Aggiungere 4 μL di tampone di metilazione 5x, 0,76 μL di DNMT1 privo di RFTS da 5 μM e 15,24 μL di ddH2O in una provetta. Aggiungere 4 μL di tampone di metilazione 5x e 16 μL di ddH2O in un'altra provetta.
  5. Picchiettare delicatamente per mescolare le soluzioni. Far girare i campioni per alcuni secondi in una mini centrifuga da tavolo (1.200 × g) per assicurarsi che la soluzione venga raccolta sul fondo del tubo.
  6. Aggiungere 5 μL della soluzione contenente DNMT1 a tre pozzetti nella piastra nera a metà area a 96 pozzetti. Aggiungere 5 μL della soluzione di controllo del tampone agli altri tre pozzetti.
  7. Inserire la piastra di microtitolazione nel lettore di piastre preriscaldato a 37 °C. Agitare la piastra (orbitale doppia a 425 cpm per 3 s) e leggere la fluorescenza con una lunghezza d'onda di eccitazione di 485 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 528 nm. Ripetere il frullato e leggere ogni 60 s per 30 minuti.
  8. Mentre la piastra di analisi si trova nel lettore di piastre, preparare la soluzione di Gla I su ghiaccio. Aggiungere 8 μL di tampone di metilazione 5x, 0,64 μL di 10 U/μL Gla I e 31,4 μL di ddH2O in una provetta per microcentrifuga. Picchiettare delicatamente per mescolare la soluzione. Centrifugare il campione per alcuni secondi in una mini centrifuga da tavolo (1.200 × g) per assicurarsi che la soluzione venga raccolta sul fondo del tubo.
  9. Aliquot 6 μL della soluzione di Gla I in 6 pozzetti in una piastra a 96 pozzetti con fondo conico.
  10. Dopo la lettura iniziale di 30 minuti, rimuovere la piastra nera dal lettore di piastre. Aggiungere 5 μL di soluzione di Gla I in tutti e 6 i pozzetti e mescolare mediante pipettaggio su e giù.
    NOTA: utilizzare un pipettaggio multicanale in modo che tutti i pozzetti possano essere avviati contemporaneamente.
  11. Riposizionare la piastra nera nel lettore di piastre. Registrare la fluorescenza ogni 35 s per 35 minuti. Agitare la piastra (orbitale doppia a 425 cpm per 3 s) prima di ogni lettura.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNMT1 attivo è un prerequisito per questa analisi. Il DNMT1 privo di RFTS è stato espresso in E.coli e purificato fino ad omogeneità seguendo procedure precedentemente pubblicate41. Per garantire che l'enzima purificato fosse attivo, è stato utilizzato un saggio discontinuo accoppiato a endonucleasi per esaminare l'attività di metilazione del DNA36. Questo test utilizza un DNA duplex a 32 coppie di basi con un singolo CpG emimetilato posizionato in un sito di sciss...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Per identificare e caratterizzare gli inibitori delle DNA metiltransferasi, deve essere misurata l'attività dell'enzima. Esistono diversi metodi per esaminare l'attività della DNA metiltransferasi. L'attività è comunemente monitorata utilizzando la radioattività; il trasferimento del gruppo metilico marcato di SAM può essere quantificato 29,30,31,32,33,34.

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori ringraziano la Bucknell University e il Dipartimento di Chimica per il loro sostegno a questo lavoro.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Micropiastra a fondo piatto nero a 96 pozzetti a 96 pozzettiCorning3694
Piastre a fondo conico in polistirene a 96 pozzettiThermoFisher249570
Albumina sierica bovinaNEBB9000S
composto 1ChemBridge5812086; risospeso in DMSO in 10
mM composto 2Composto di screening ChemBridge6722175; risospeso in DMSO in 10 mM
compostoChemBridge5249376composto di screening; risospeso in DMSO a 10 mM
DitiotreitoloSigmaD0632
Gla ISibEnzimaE494endonucleasi metil-sensibile
GliceroloRPIG22025
Cloruro di magnesioOligonucleotide SigmaM0250
(5'-FAM-CCTATGCGmCATCAGTTTTCTGATGmCGmCATAGG-3'-Iowa Black Quencher)DNAforcina estinto internamentesintetizzato IDT
Glutammato di potassioSigmaG1501
S-adenosilmetioninaSigmaA4377cofattore metil-donatore (substrato)
Tris BaseRPICodice: T60040
Composto di screening 3 a (substrato)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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