Migliorare il contenuto tumorale attraverso la macrodissezione tumorale

I tessuti incorporati in paraffina fissata alla formalina (FFPE), raccolti come parte del normale processo diagnostico clinico e conservati nei depositi di tessuti clinici, rappresentano una vasta risorsa per la ricerca umana, compresa la ricerca sul cancro¹. Man mano che la nostra comprensione della malattia umana si approfondisce, sta diventando sempre più chiaro che le malattie, precedentemente ritenute singole entità basate su caratteristiche morfologiche e immunofenotipiche, sono in realtà composte da sottotipi molecolari distinti che richiedono saggi di sottotipizzazione molecolare. Di conseguenza, i saggi genomici ad alta sensibilità in grado di discernere questi sottotipi sono diventati sempre più importanti². Sebbene i tessuti FFPE siano rinomati per essere scarsamente compatibili con le tecniche genomiche a causa di problemi legati alla fissazione, man mano che la tecnologia e i protocolli si evolvono, queste tecniche stanno diventando sempre più compatibili con questo formato di tessuto clinicamente onnipresente ^3,4,5. Tuttavia, i tessuti FFPE sono spesso miscele di materiali tissutali tumorali e non tumorali, in cui la presenza di materiale non tumorale è spesso indesiderata e può, se presente in proporzione elevata, minare e influenzare significativamente i risultati delle analisi genomiche⁶. Infatti, un contenuto minimo di tumore del 60% viene spesso utilizzato per tali analisi, dove i tessuti che non raggiungono questa soglia possono essere esclusi, pur soddisfacendo altrimenti i criteri di studio⁷. Ciò può essere particolarmente problematico nelle impostazioni di malattie rare, dove i tessuti dei pazienti sono preziosi e difficili da raccogliere in numero elevato.

La macrodissezione è un metodo che minimizza gli effetti del basso contenuto tumorale riducendo la quantità di tessuto normale³. La rimozione di tale materiale non tumorale confondente prima dell'estrazione dell'acido nucleico può aumentare significativamente il contenuto percentuale del tumore e quindi la purezza tumorale degli acidi nucleici estratti. La resezione tissutale si basa criticamente sulla revisione patologica di esperti, in cui la regione tumorale viene identificata e cerchiata su una sezione di tessuto colorato di ematossilina ed eosina (H & E) appena generata da un patologo certificato⁸. L'H&E cerchiato viene quindi utilizzato per guidare la rimozione e la raccolta di tessuti indesiderati e bersaglio, rispettivamente. Questo protocollo descrive le fasi della macrodissezione dalla revisione patologica alla raccolta dei tessuti eseguita presso l'AIDS and Cancer Specimen Resource (ACSR) Technical Core Laboratory presso la Mayo Clinic.

Tutti i campioni sono stati raccolti e utilizzati in conformità con i protocolli IRB approvati della Mayo Clinic (PR16-000507 e PR2207-02).

1. Preparazione del campione

1. Accendere il bagno d'acqua di galleggiamento dei tessuti. Impostare la temperatura a 39 °C e lasciare che l'acqua raggiunga la temperatura. Immergere i bastoncini di raccolta in legno a bagnomaria.
2. Identificare e recuperare i blocchi di tessuto FFPE da sezionare.
3. Vetrini per microscopi pre-etichetta che utilizzano un marcatore permanente di grado istologico in grado di resistere ai lavaggi con solvente.
4. Utilizzare un microtomo per sezionare i blocchi FFPE. Tagliare almeno 2 sezioni a faccia intera con uno spessore di 4-5 μm per sezione per ciascun blocco (Figura 1A).
5. Trasferire il nastro appena tagliato di sezioni di tessuto nel bagno di galleggiamento del tessuto preriscaldato per il montaggio a vetrino (Figura 1B, C).
   NOTA: L'acqua calda aiuta a "stirare" le rughe nelle sezioni (Figura 1C).
6. Gestendo ogni sezione in sequenza, utilizzare la pinza per separare una singola sezione dalla barra multifunzione (Figura 1D).
7. Raccogliere la singola sezione su un vetrino per microscopio pre-etichettato.
   1. Immergere il vetrino del microscopio con un angolo sotto la sezione, posizionando il vetrino in modo tale che il bordo della sezione tissutale tocchi il vetrino (Figura 1E).
   2. Una volta a contatto con la sezione tissutale, estrarre lentamente il vetrino dal bagno di galleggiamento per consentire alla sezione tissutale di raddrizzarsi a filo contro il vetrino mentre emerge dall'acqua (Figura 1F).
8. Montare 1 sezione di tessuto per diapositiva e ripetere fino a quando tutte le sezioni sono state raccolte.
9. Lasciare asciugare accuratamente le sezioni di tessuto montate su vetrino a temperatura ambiente (RT).

2. Revisione patologica

1. Eseguire la colorazione H&E su una sezione di tessuto rappresentativa per ciascun blocco⁹.
2. Invia gli H& E appena macchiati per la revisione patologica da parte di un patologo certificato.
   NOTA: Durante la revisione, il patologo determina e registra la percentuale di contenuto tumorale in ciascun tessuto e circonda l'area tumorale su ciascun vetrino H& E (vedere Figura 2 e Figura 3, Riga 1). La Tabella 1 delinea la percentuale di contenuto tumorale per cellularità determinata durante la revisione patologica degli H&E per i campioni A-E mostrati in Figura 3, Riga 1. Le sezioni con contenuto tumorale <60% richiedono la macro-dissezione⁷. Il numero di sezioni necessarie per l'estrazione dell'acido nucleico dipende dalla dimensione dell'area tumorale cerchiata. Se nella sezione 1 del protocollo sono state tagliate sezioni insufficienti e sono possibili ulteriori tagli, potrebbe essere necessario tagliare sezioni aggiuntive.

3. Deparaffinizzazione

1. In una cappa aspirante, preriempire due piatti di colorazione del vetro con istologia non diluita grado d-Limonene o un solvente a base di d-Limonene e 1 piatto di colorazione del vetro con etanolo molecolare non diluito a prova di 200.
   ATTENZIONE: Evitare il contatto del d-limonene con la pelle e gli occhi, evitare l'inalazione di vapore o nebbia e tenere lontano da fonti di accensione. Tenere l'etanolo lontano da calore, scintille e fiamme libere, evitare la fuoriuscita e il contatto con la pelle o gli occhi, ventilare bene ed evitare di respirare vapori.
   NOTA: riempire le stoviglie a sufficienza per immergere le diapositive a scaffalature (Figura 4A); Sono necessari 250 ml per riempire le piastre di colorazione a 20 vetrine mostrate. Sostituire i lavaggi di d-limonene ed etanolo dopo ogni 40 vetrini. Il D-limonene (C₁₀H₁₆) è un agente deceramizzante alternativo, altrettanto efficace e meno tossico allo xilene che sta diventando sempre più comune nelle metodologie istologiche e produce acido nucleico di buona qualità dopo l'estrazione 10,11,12,13,14. Sebbene questo protocollo possa essere eseguito utilizzando alternative più biofriendly¹⁵, i loro effetti, se presenti, sulla qualità dell'acido nucleico estratto rimangono da determinare.
2. Racchiudere i vetrini montati su tessuto FFPE non macchiato nei portaslitte copino in vetro (Figura 4A, inserto).
3. Immergere gli scivoli a cremagliera in d-Limonene lavare 1 per 2 min; agitare delicatamente per i primi 20 s.
   NOTA: per ridurre al minimo il riporto tra i lavaggi, quando si rimuove il rack di diapositive da un lavaggio, lasciare che il rack si scarichi brevemente prima di tamponare delicatamente il fondo del rack su carta velina per rimuovere il lavaggio in eccesso.
4. Immergere le guide a cremagliera in lavaggio D-Limonene non diluito 2 per 2 min; agitare delicatamente per i primi 20 s. Rimuovere, scolare e tamponare nuovamente il rack.
5. Immergere le diapositive a cremagliera nel lavaggio a etanolo per 2 minuti; agitare delicatamente per i primi 20 s. Rimuovere il rack e posizionarlo su un tessuto assorbente per drenare. Lasciare asciugare all'aria le diapositive per almeno 10 minuti, ma non più di 2 ore.

3. Macrodissezione

1. Sul banco, preriempire un barattolo di vetro Coplin con 50 ml di glicerolo al 3% in acqua priva di DNasi/RNasi
   NOTA: Sostituire il lavaggio del glicerolo dopo ogni 40 diapositive.
2. Pre-etichetta e preriempizione di microtubi da 1,5 mL con 160 μL di tampone per la digestione dei tessuti per microtubo.
   NOTA: Le estrazioni di acido nucleico eseguite dopo la macrodissezione hanno utilizzato un kit di estrazione FFPE DNA/RNA (Table of Materials). Pertanto, il tampone di digestione tissutale utilizzato in questo protocollo comprendeva 10 μL di proteinasi K e 150 μL di tampone PKD.
3. Traccia i segni patologici sull'H & E sul retro dei vetrini di tessuto deparaffinato.
   NOTA: rispetto ai tessuti non deparaffinizzati (Figura 3, Riga 2 e Figura 4B), i tessuti deparaffinizzati sono bianchi e altamente visibili (Figura 3, Riga 3 e Figura 4C). È questa maggiore visibilità e discernibilità delle caratteristiche del tessuto deparaffinizzato che consente la macrodissezione. Posiziona l'H & E a faccia in giù sulla panca e posiziona la parte anteriore del vetrino deparaffinato contro il retro dell'H&E recensito dal patologo abbinato (Figura 4D). Allineare il tessuto deparaffinizzato con il tessuto H&E (Figura 4E). Tracciare i segni del patologo è un passo fondamentale nel processo di macrodissezione e bisogna fare attenzione a riprodurre questi segni nel modo più accurato possibile. Ciò può essere particolarmente difficile per tessuti piccoli e/o disconnessi come i campioni B, D ed E (Figura 3, Figura 4E e Figura 4E nell'inserto i). Per facilitare il tracciamento, si dovrebbe usare un marcatore a punta fine o ultrafine (Figura 4E, inserto ii) per tracciare i segni disegnati dal patologo. Le salviette a base di etanolo possono essere utili per rimuovere gli errori e consentire il ritracciamento se necessario.
4. Ruotare il tessuto di scorrimento deparaffinizzato ora marcato a faccia in su e tracciare la linea del marcatore con l'angolo di una lama di rasoio pulita per pre-tagliare i bordi dell'area tumorale.
5. Maneggiando ogni vetrino in sequenza, immergere i vetrini deparaffinizzati nella soluzione di glicerolo al 3%. Assicurarsi che il tessuto sia completamente sommerso prima di rimuovere lentamente il vetrino (Figura 4F).
   NOTA: Lo scopo della immersione del glicerolo è quello di smorzare il tessuto per aiutare la raccolta dei tessuti, ma anche per ridurre l'accumulo di carica statica che può causare repulsione tra il tessuto e il microtubo di plastica in cui deve essere posizionato il tessuto raccolto.
6. Pulire delicatamente la parte posteriore del vetrino con un fazzoletto per rimuovere la soluzione di glicerolo in eccesso e posare il vetrino sul banco, asciugato lateralmente a faccia in giù. Lasciare asciugare brevemente i tessuti per 1-2 minuti.
   NOTA: Il trasferimento del glicerolo in eccesso nel processo di estrazione può influire negativamente sulla resa e sulla qualità delle estrazioni di acido nucleico. I tessuti dovrebbero essere leggermente umidi ma non visibilmente bagnati quando vengono raccolti.
7. A seconda di dove si trova l'area tumorale di interesse sul vetrino, utilizzare il bordo piatto della lama del rasoio per (a) raccogliere direttamente il tessuto tumorale, usando il rasoio per raschiare / raccogliere il tessuto di interesse dal vetrino, o (b) rimuovere e scartare il tessuto non tumorale prima di raccogliere il tessuto tumorale di interesse (Figura 3).
   NOTA: il tessuto raccolto tende a raccogliersi o arrotolarsi nella parte inferiore della lama (Figura 4G)
8. Utilizzare un bastoncino di legno per rimuovere il tessuto raccolto dalla lama (Figura 4H e inserto) e trasferirlo nell'apposito microtubo pre-marcato e preriempito (Figura 4I).
   NOTA: Il tampone di digestione serve a "tirare" il tessuto dal piccone di legno nel liquido.
9. Procedere all'estrazione dell'acido nucleico.
   NOTA: Le estrazioni di acidi nucleici sono state completate utilizzando il kit di estrazione FFPE DNA/RNA secondo le istruzioni del produttore e gli acidi nucleici risultanti sono stati quantificati utilizzando uno spettrofotometro UV-vis. L'RNA risultante è stato eseguito sul test DLBCL90 16 basato sul profilo di espressione^genica digitale.

Sono stati sezionati un totale di 5 blocchi di tessuto FFPE per linfoma diffuso a grandi cellule B (DLBCL) e le sezioni risultanti sono state macrodissezionate o non prima dell'estrazione dell'acido nucleico. L'RNA estratto è stato eseguito sul test DLBCL9016. I campioni macrosezionati sono stati eseguiti due volte, una volta utilizzando 5 μL di concentrazione di RNA ma non più di 300 ng di input di RNA totale e una volta utilizzando 5 μL di stock di RNA diluito per abbinare gli input di RNA delle rispettive controparti non sezionate. I risultati di DLBCL90 sono descritti nella Tabella 2.

DLBCL è composto da 3 distinti sottotipi di cellule di origine (COO) con diversa reattività terapeutica, vale a dire GCB, ABC e un gruppo intermedio noto come non classificato o UNC17,18. Traslocazioni che coinvolgono MYC, BCL2 e o BCL6 da soli o in combinazione (doppio o triplo colpo) sono spesso osservate anche in DLBCL, in particolare nel sottotipoGCB 19. Il test DLBCL90 è un'espansione del suo predecessore, il test clinico Lymph2Cx, ed è quindi in grado di determinare il sottotipo DLBCL COO, ma è stato sviluppato principalmente per identificare campioni che ospitano traslocazioni a doppio colpo (DH) che coinvolgono BCL2 utilizzando l'espressione genica digitale come alternativa all'ibridazione in situ a fluorescenza (FISH)16,20. I risultati della Tabella 2 mostrano che la macrodissezione ha modificato il COO o lo stato di DHITsig richiede il 60% (3/5) dei campioni esaminati.

La macrodissezione del campione A non ha avuto alcun effetto sulla chiamata COO, ma ha cambiato la chiamata DHITsig da NEG a UNCLASS, e questo cambiamento è stato osservato indipendentemente dall'input di RNA del campione macrodissecato e con punteggi di probabilità simili (0,224, 0,254). Al contrario, la macrodissezione del campione C non ha avuto alcun effetto sulla chiamata DHITsig, ma ha cambiato la chiamata COO da GCB a UNC. Ancora una volta, questo cambiamento è stato osservato indipendentemente dall'input di RNA del campione macrosezionato. Tuttavia, a 0,117, la probabilità di chiamata COO era più vicina alla soglia di chiamata di 0,1 per il campione macrodissecato con ingresso di RNA ridotto. Analogamente al campione A, la macrodissezione del campione E non ha avuto alcun effetto sulla chiamata coO, ma ha modificato la chiamata DHITsig. Tuttavia, per il campione E la chiamata è cambiata da UNCLASS a NEG e lo ha fatto indipendentemente dall'input di RNA del campione macrodissecato con chiamate di probabilità ragionevolmente simili (0,849, 0,833). In particolare, questo cambiamento di chiamata a DHITsig NEG ha senso biologico dato che il campione E è stato trovato in ABC-DLBCL e le traslocazioni a doppio colpo che coinvolgono BCL2 sono state segnalate per essere osservate esclusivamente in GCB-DLBCL19.

Figura 1: Generazione di sezioni di tessuto montate su vetrini utilizzando un microtomo. (A) Blocco di tessuto FFPE tenuto in posizione dal mandrino microtome e tagliato per produrre un nastro di sezioni di tessuto FFPE sequenziali. (B) Utilizzando bastoncini di legno pre-imbevuti, il nastro viene raccolto dal microtomo e trasferito a un bagno d'acqua calda. (C) Il calore dell'acqua aiuta a stirare le pieghe nel nastro di tessuto. (D) Le singole sezioni di tessuto FFPE vengono rimosse dal nastro di tessuto posizionando una pinza chiusa alla giunzione di due sezioni e aprendo delicatamente la pinza, che rompe le sezioni l'una dall'altra. (E) Le sezioni vengono raccolte dall'acqua immergendo un vetrino ad angolo e spostando delicatamente il lato verso la sezione di tessuto fino a quando il bordo della sezione tocca il vetrino. (F) Una volta che la diapositiva e la sezione si toccano, rimuovere lentamente la diapositiva dall'acqua, lasciando che la sezione del tessuto cada a filo contro la diapositiva. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Patologia e revisione istologica di una sezione colorata di ematossilina ed eosina (H & E). (A, B) La sezione di tessuto H & E è sottoposta a revisione microscopica da parte di un patologo certificato. (C,D) Una volta che il patologo ha visto l'intero tessuto e ha scoperto che non è al 100% tessuto tumorale, il patologo utilizzerà un marcatore per circondare l'area tumorale del tessuto. (E,F) Tenendo il marcato H & E contro il blocco di tessuto FFPE originale mostra che non tutto il tessuto è materiale tumorale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Campioni di tessuto. Questa immagine mostra le sezioni di tessuto FFPE patologicamente riviste e marcate con tumore (riga 1), le sezioni di tessuto FFPE montate su vetrino non elaborate (riga 2), le sezioni di tessuto FFPE deparaffinate montate su vetrino (riga 3), le sezioni di tessuto FFPE deparaffinato montate su vetrino con segni patologici tracciati sul retro del vetrino (riga 4), le sezioni di tessuto FFPE deparaffinato e macrodissezionate montate su vetrino (riga 5) per i 5 campioni (A-E) utilizzati per dimostrare questo protocollo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Deparaffinizzazione e macro-dissezione delle sezioni di tessuto FFPE: (A) In una cappa aspirante, i tessuti FFPE montati in una griglia scorrevole vengono lavati in due lavaggi d-limonene e un lavaggio a etanolo. (B,C) Dopo il lavaggio, tutta la paraffina è stata rimossa e solo il tessuto rimane sul vetrino, che ora è bianco e altamente visibile rispetto alla sua controparte prelavata. (D) La sezione di tessuto deparaffinato montata su vetrino viene posizionata a faccia in giù sul retro del suo corrispondente marcato H & E. (E) I segni dell'area tumorale sull'H & E vengono quindi tracciati sul retro del vetrino deparaffinato utilizzando un marcatore permanente con pennino fine o ultrafine (F) La sezione di tessuto deparaffinato marcata montata su vetrino viene quindi immersa in un lavaggio al glicerolo per smorzare la sezione di tessuto per la raccolta. Il vetrino viene rimosso lentamente dal glicerolo e il retro del vetrino viene pulito con un fazzoletto per rimuovere il glicerolo in eccesso prima di posare il tessuto del vetrino a faccia in su sul banco. (G) Usando il lato piatto di una lama di rasoio pulita, il tessuto viene macrodissezionato e il tessuto indesiderato al di fuori dei segni del patologo viene scartato prima di raccogliere il tessuto di interesse, che si raccoglie lungo il bordo della lama. (H) Un bastone di legno viene utilizzato per rimuovere il tessuto raccolto dal bordo della lama. (I) Il tessuto viene quindi trasferito in un tampone di digestione tissutale preriempito con microtubi pre-etichettati ed è pronto per l'estrazione di acidi nucleici. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Dati di revisione della patologia. La tabella mostra (a) la percentuale di tumore vitale nell'intera sezione tissutale per area, (b) la percentuale di tumore vitale nell'area cerchiata/marcata dal patologo durante la revisione per cellularità, (c) la cellularità tumorale complessiva stimata dell'intero tessuto (a x b), (d) l'aumento stimato della cellularità tumorale raggiunto con la macrodissezione, e e f) il numero di sezioni di tessuto FFPE non macchiate da 5 μm estratte e le concentrazioni di RNA risultanti per campioni abbinati non macrodissezionati e macrodissezionati. % Altro si riferisce a tutti gli altri tessuti presenti in un dato campione che non è tessuto tumorale e può includere tessuto connettivo, fibroblasti stromali, vasi sanguigni e altri elementi stromali intrinseci. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Risultati del test di espressione genica digitale DLBCL90. Cinque campioni (A-E) non sono stati macrosezionati o macrodissezionati prima che venissero eseguite estrazioni di acidi nucleici. L'RNA risultante è stato eseguito sul test DLBCL90, per il quale il volume massimo di ingresso dell'RNA è di 5 μL. Campioni non macrosezionati sono stati eseguiti utilizzando 5 μL di RNA di riserva. Ogni campione macrosezionato è stato eseguito due volte utilizzando (a) 5 μL di RNA di riserva a meno che non fossero possibili aliquote di 60 ng/μL e (b) 5 μL di RNA di riserva diluito per corrispondere alle concentrazioni/input delle loro controparti non macrodissezionate. Il suffisso _M indica che il campione è stato macrosezionato. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.