Le colture primarie di microglia sono comunemente utilizzate per valutare nuove molecole anti-infiammatorie. Il presente protocollo descrive un metodo riproducibile e rilevante per isolare magneticamente la microglia dai cuccioli neonati.
Articolo metodologico
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Le colture primarie di microglia sono comunemente utilizzate per valutare nuove molecole anti-infiammatorie. Il presente protocollo descrive un metodo riproducibile e rilevante per isolare magneticamente la microglia dai cuccioli neonati.
Le microglia, come macrofagi residenti nel cervello, sono fondamentali per diverse funzioni, tra cui la risposta allo stress ambientale e l'omeostasi cerebrale. La microglia può adottare un ampio spettro di fenotipi di attivazione. Inoltre, le microglia che sostengono il fenotipo pro-infiammatorio sono associate a disturbi sia dello sviluppo neurologico che neurodegenerativi. Gli studi in vitro sono ampiamente utilizzati nella ricerca per valutare potenziali strategie terapeutiche in specifici tipi di cellule. In questo contesto, lo studio dell'attivazione microgliale e della neuroinfiammazione in vitro utilizzando colture microgliali primarie è più rilevante delle linee cellulari microgliali o delle microglia derivate dalle cellule staminali. Tuttavia, l'uso di alcune colture primarie potrebbe soffrire di una mancanza di riproducibilità. Questo protocollo propone un metodo riproducibile e rilevante per isolare magneticamente la microglia dai cuccioli neonati. L'attivazione microgliale utilizzando diversi stimoli dopo 4 ore e 24 ore mediante quantificazione dell'espressione dell'mRNA e un saggio fagocitico Cy3-bead è dimostrato qui. Il lavoro attuale dovrebbe fornire una tecnica facilmente riproducibile per isolare microglia fisiologicamente rilevanti dagli stadi di sviluppo giovanile.
Le microglia sono le cellule simili a macrofagi residenti nel sistema nervoso centrale derivate da precursori eritropoietici del sacco vitellino che migrano verso il neuroepitelio durante lo sviluppo embrionale precoce1. Oltre alle loro funzioni immunitarie, svolgono anche un ruolo significativo durante lo sviluppo neurologico, in particolare per la sinaptogenesi, l'omeostasi neuronale e la mielinizzazione2. In età adulta, le microglia sviluppano lunghi processi cellulari per scansionare continuamente l'ambiente. In caso di rotture dell'omeostasi come lesioni cerebrali o malattie cerebrali, le microglia possono cambiare ....
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Il protocollo è stato approvato e tutti gli animali sono stati gestiti secondo le linee guida istituzionali dell'Institut National de la Santé et de la Recherche Scientifique (Inserm, Francia). Viene presentato l'isolamento magnetico della microglia dal cervello di 24 cuccioli di topo OF1 (sia maschi che femmine) a P8, suddivisi in piastre a 6 pozzetti, 12 pozzetti o 96 pozzetti. Il lavoro sperimentale è stato eseguito sotto un cappuccio per mantenere condizioni sterili.
1. Preparazione di soluzioni sterili per isolamento e coltura cellulare
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La microglia è il macrofago residente nel SNC che viene attivato quando esposto a sfide ambientali (traumi, molecole tossiche, infiammazione)4,5,6,34 (Figura 3A). Gli studi in vitro sulle microglia sono comunemente usati per valutare i meccanismi autonomi delle cellule correlati a tali sfide ambientali e caratterizzare lo stato di attivazione dopo manipola.......
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Il lavoro attuale presenta una coltura primaria di cellule microgliali utilizzando cellule CD11b + ordinate magneticamente. Oltre alla valutazione funzionale microgliale (RT-qPCR e saggi fagocitici), è stata determinata anche la purezza della coltura microgliale.
Le colture cellulari di microglia classiche sono comunemente generate dal cervello neonato del roditore P1 o P2 e dalla co-coltura con astrociti per almeno 10 giorni. Le microglia vengono quindi separate meccanicamente utilizzando uno.......
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Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Le figure sono state create utilizzando BioRender. La ricerca è finanziata da Inserm, Université de Paris, Horizon 2020 (PREMSTEM-874721), Fondation de France, Fondation ARSEP, Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation Grace de Monaco e una sovvenzione aggiuntiva da Investissement d'Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS e Investissement d'Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
| Anti mouse CD11b BV421 | Sony Biotechnology | 1106255 | |
| Anti mouse CD45 BV510 | Sony Biotechnology | 1115690 | |
| Anti mouse CX3CR1 PE Cy7 | Sony Biotechnology | 1345075 | |
| Anti mouse NeuN PE | Milli-Mark | FCMAB317PE | |
| anti topo O4 Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-120-016 | |
| BD Kit di permeabilizzazione Cytofix/Cytoperm | BD Biosciences | 554655 | |
| Albumina sierica bovina | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| Microscopio confocale | Leica TCS SP8 | ||
| D-PBS (10x) | Thermo Scientific | 14200067 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E1644 | |
| Falcon Piastra per colture cellulari a 12 pozzetti, fondo piatto + coperchio | Dutscher | 353043 | |
| Falcon Piastra per colture cellulari a 96 pozzetti, fondo piatto + coperchio | Dutscher | 353072 | |
| Provette Falcon 50 mL | Dutscher 352098 | ||
| Reagente bloccante Fc (Topo CD16/32) | BD Biosciences | 553142 | |
| Microscopio a fluorescenza | Nikon ECLIPSE TE300 | ||
| gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubi) | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14065049 | |
| Soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14185045 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-rad | 1725006CUST | |
| Sintesi Iscript c-DNA | Bio-rad | 1708890 | |
| Perle di lattice, polistirene modificato con ammina, rosso fluorescente | Sigma-Aldrich | L2776-1mL | |
| Lipopolisaccaridi (LPS) da Escherichia coli O55:B5 | Sigma-Aldrich | L2880 | |
| Macrofagi-SFM terreno privo di siero | Thermo Scientific | 12065074 | |
| MACS BSA Soluzione madre | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MACS SmartStrainers (70 &; m), 4 x 25 pz | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
| Mouse IgG1 PE | Millipore | MABC002H | |
| Mouse IgG2a PE Cy7 | Sony Biotechnology | 2601265 | |
| Mouse IL1 beta | Miltenyi Biotec | 130-101-684 | |
| Multi-24 Blocchi di colonne | Miltenyi Biotec | 130-095-691 | |
| MultiMACS Cell24 Separatore | Miltenyi | ||
| - Papaina | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| Nucleocounter NC-200 | Chemometec | ||
| Nucleospin RNA Plus XS | Macherey Nagel | 740990.5 | |
| Nun EZFlip Top Provette da centrifuga coniche | Thermo Scientific | 362694 | |
| OPTILUX Petri piatto - 100 x 20 mm | Dutscher | ||
| Pé nillina-streptomicina (10 000 U/mL) | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Rat IgG2b, k BV421 | BD Biosciences | 562603 | |
| Rat IgG2b, k BV510 | Sony Biotechnology | 2603230 | |
| controllo REA (S) PE vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-104-616 | |
| controllo REA (S) Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-113-445 | |
| Proteina IFN-gamma di topo ricombinante | R& D System | 485-MI | |
| Proteina IL-10 ricombinante | di topo R& D System | 417-ML | |
| Proteina IL-4 ricombinante di topo | R& D System | 404-ML | |
| RIPA Buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| Sonda di vitalità (FVS780) | BD Biosciences | 565388 |
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