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Articolo metodologico

Isolamento magnetico di cellule microgliali da topo neonato per colture cellulari primarie

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DOI:

10.3791/62964

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25 luglio 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1NeuroDiderot, Inserm UMR-1141, Hôpital Robert Debré 48, Université de Paris, 2Department of anesthesia and critical care, APHP-Sorbonne university

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Le colture primarie di microglia sono comunemente utilizzate per valutare nuove molecole anti-infiammatorie. Il presente protocollo descrive un metodo riproducibile e rilevante per isolare magneticamente la microglia dai cuccioli neonati.

Abstract

Le microglia, come macrofagi residenti nel cervello, sono fondamentali per diverse funzioni, tra cui la risposta allo stress ambientale e l'omeostasi cerebrale. La microglia può adottare un ampio spettro di fenotipi di attivazione. Inoltre, le microglia che sostengono il fenotipo pro-infiammatorio sono associate a disturbi sia dello sviluppo neurologico che neurodegenerativi. Gli studi in vitro sono ampiamente utilizzati nella ricerca per valutare potenziali strategie terapeutiche in specifici tipi di cellule. In questo contesto, lo studio dell'attivazione microgliale e della neuroinfiammazione in vitro utilizzando colture microgliali primarie è più rilevante delle linee cellulari microgliali o delle microglia derivate dalle cellule staminali. Tuttavia, l'uso di alcune colture primarie potrebbe soffrire di una mancanza di riproducibilità. Questo protocollo propone un metodo riproducibile e rilevante per isolare magneticamente la microglia dai cuccioli neonati. L'attivazione microgliale utilizzando diversi stimoli dopo 4 ore e 24 ore mediante quantificazione dell'espressione dell'mRNA e un saggio fagocitico Cy3-bead è dimostrato qui. Il lavoro attuale dovrebbe fornire una tecnica facilmente riproducibile per isolare microglia fisiologicamente rilevanti dagli stadi di sviluppo giovanile.

Introduzione

Le microglia sono le cellule simili a macrofagi residenti nel sistema nervoso centrale derivate da precursori eritropoietici del sacco vitellino che migrano verso il neuroepitelio durante lo sviluppo embrionale precoce1. Oltre alle loro funzioni immunitarie, svolgono anche un ruolo significativo durante lo sviluppo neurologico, in particolare per la sinaptogenesi, l'omeostasi neuronale e la mielinizzazione2. In età adulta, le microglia sviluppano lunghi processi cellulari per scansionare continuamente l'ambiente. In caso di rotture dell'omeostasi come lesioni cerebrali o malattie cerebrali, le microglia possono cambiare il loro aspetto morfologico per adottare una forma ameboide, migrare verso l'area lesa, aumentare e rilasciare molti fattori citoprotettivi o citotossici. Le microglia hanno stati di attivazione eterogenei a seconda del loro stadio di sviluppo e del tipo di lesione subita 3,4,5. In questo studio, questi stati di attivazione sono ampiamente classificati in tre diversi fenotipi: pro-infiammatori / fagocitici, antinfiammatori e immuno-regolatori, tenendo presente che in realtà la situazione è probabilmente più complessa6.

Studiare in vivo l'attivazione microgliale e lo screening per le strategie neuroprotettive nelle prime fasi dello sviluppo cerebrale può essere difficile a causa (1) della fragilità degli animali prima dello svezzamento e (2) del basso numero di cellule microgliali. Pertanto gli studi in vitro sulle microglia sono ampiamente utilizzati per tossicità 7,8,9, strategie neuroprotettive5,10,11,12,13,14 e co-colture 15,16,17,18,19,20,21 . Gli studi in vitro possono utilizzare linee cellulari microgliali, microglia derivate da cellule staminali o colture di microglia primarie. Tutti questi approcci hanno vantaggi e svantaggi e la scelta dipende dalla domanda biologica iniziale. I vantaggi dell'utilizzo di colture primarie di microglia sono il background genetico omogeneo, la storia priva di agenti patogeni e il controllo del momento in cui le microglia vengono stimolate dopo la morte dell'animale22.

Nel corso degli anni, sono stati sviluppati diversi metodi (citometria a flusso, scuotimento o marcatura magnetica) per la coltura di microglia primaria da roditori, sia neonati che adulti 23,24,25,26,27,28,29. Nel presente lavoro, l'isolamento della microglia da cuccioli di topo neonato viene eseguito utilizzando la tecnologia di selezione cellulare attivata magneticamente precedentemente descritta utilizzando CD11b 25,27,29 anti-topo rivestito di microsfere. CD11b è un recettore dell'integrina espresso sulla superficie delle cellule mieloidi, compresa la microglia. Quando non c'è sfida infiammatoria all'interno del cervello, quasi tutte le cellule CD11b + sono microglia30. Rispetto ad altri metodi precedentemente pubblicati 23,24,25,26,27,28,29, il presente protocollo bilancia le analisi immediate di attivazione microgliale ex vivo e la comune coltura microgliale primaria in vitro. Pertanto, le microglia sono (1) isolate al giorno postnatale (P) 8 senza rimozione della mielina, (2) coltivate senza siero e (3) esposte a siRNA, miRNA, composti farmacologici e / o stimoli infiammatori solo 48 ore dopo l'isolamento cerebrale. Ciascuno di questi tre aspetti rende l'attuale protocollo rilevante e rapido. Innanzitutto, l'utilizzo della microglia pediatrica consente di ottenere cellule vitali dinamiche e reattive in coltura senza richiedere un ulteriore step demielinico che potrebbe potenzialmente modificare la reattività microgliale in vitro. Il presente protocollo mira ad avvicinarsi il più possibile all'ambiente fisiologico della microglia. In effetti, le microglia non incontrano mai il siero e questo protocollo non richiede nemmeno l'uso del siero. Inoltre, esporre le microglia già 48 ore dopo la coltura impedisce loro di perdere le loro facoltà fisiologiche.

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Protocollo

Il protocollo è stato approvato e tutti gli animali sono stati gestiti secondo le linee guida istituzionali dell'Institut National de la Santé et de la Recherche Scientifique (Inserm, Francia). Viene presentato l'isolamento magnetico della microglia dal cervello di 24 cuccioli di topo OF1 (sia maschi che femmine) a P8, suddivisi in piastre a 6 pozzetti, 12 pozzetti o 96 pozzetti. Il lavoro sperimentale è stato eseguito sotto un cappuccio per mantenere condizioni sterili.

1. Preparazione di soluzioni sterili per isolamento e coltura cellulare

  1. Preparare 50 mL di 1x soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) senza Ca 2+ e Mg2+ (HBSS-/-) dalla soluzione 10x disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali).
  2. Preparare la miscela di dissociazione secondo la composizione fornita nella Tabella 1 utilizzando un kit di dissociazione tissutale disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali).
  3. Preparare 200 mL di 1x HBSS con Ca 2+ e Mg2+ (HBSS+/+) dalla soluzione 10x disponibile in commercio.
  4. Preparare 200 ml di 1x PBS + 0,5% BSA (indicato come buffer di selezione cellulare).
  5. Preparare le microsfere CD11b secondo la Tabella 2.
  6. Preparare 500 ml di terreno di coltura privo di siero macrofagico (SFM) + 1% di penicillina-streptomicina (P/S). Fabbricare aliquote di tubi da 50 ml e conservarli a 4 °C. Questo è indicato come il mezzo della microglia più avanti nel testo.
    NOTA: Tutte le soluzioni di isolamento devono essere preparate al momento in condizioni sterili il giorno della sperimentazione e conservate su ghiaccio. Il terreno di coltura cellulare della microglia può essere preparato, aliquotato in provette da 50 ml e mantenuto a 4 °C per un uso futuro. La filtrazione non è necessaria.

2. Dissezione cerebrale

  1. Decapitare la testa del cucciolo usando grandi forbici senza previa anestesia generale.
  2. Tagliare la pelle dal collo al naso seguendo la sutura sagittale (15-20 mm) con piccole forbici (Figura 1A-C).
  3. Inserire una piccola punta di forbice all'interno del Forame magno parallelo al cranio. Tagliare da ciascun lato con cura agli occhi (Figura 1D,E).
  4. Tagliare tra gli occhi con piccole forbici per staccare il cranio e il cervello dalla testa (Figura 1F).
  5. Con due pinze, afferrare il cranio vicino ai bulbi olfattivi e strappare il cranio con cura, facendo attenzione a non danneggiare il cervello sottostante (Figura 1G-I).
  6. Rimuovere il cervelletto e il bulbo olfattivo con una lametta e tagliare il cervello in due pezzi (Figura 1J).
  7. Posizionare i pezzi di cervello in una capsula di Petri contenente 30-40 ml di HBSS-/- (Figura 1K).

3. Dissociazione cerebrale e isolamento microgliale magnetico

NOTA: Tutte le manipolazioni e le risospensioni cellulari devono essere eseguite con una pipetta da 1.000 μL con grande cautela. L'applicazione di un'elevata azione meccanica può attivare o uccidere le cellule della microglia.

  1. Trasferire 12 pezzi di cervello (~ 1,2 g) per tubo di dissociazione contenente miscela di dissociazione secondo la Tabella 1. Per 24 cuccioli, erano necessari quattro tubi C (Figura 2A-B).
  2. Posizionare i tubi C sul dissociatore (con la modalità di riscaldamento). Avviare il programma NTDK ottimizzato nell'apparecchiatura secondo le istruzioni del produttore (Figura 2D).
  3. Centrifugare a 300 x g per 20 s (a 4 °C) per raccogliere tutte le cellule. Completare la dissociazione meccanica mediante pipettaggio tre volte su e giù con una pipetta da 1.000 μL (Figura 2E).
  4. Trasferire le cellule in quattro provette da 15 ml + filtri. Risciacquare i filtri con 10 ml di HBSS+/+ (Figura 2F).
  5. Centrifugare a 300 x g per 10 minuti (a 4 °C) e rimuovere il surnatante. Risospendere con cautela il pellet con 10 ml di HBSS+/+ (Figura 2G).
  6. Centrifugare a 300 x g per 10 minuti (a 4 °C) e rimuovere il surnatante. Risospendere accuratamente il pellet con 6 ml di tampone di selezione (fase 1.4) (Figura 2H).
  7. Centrifugare a 300 x g per 10 minuti (a 4 °C) e rimuovere il surnatante. Aggiungere 200 μL di soluzione di microsfere CD11b (fase 1.5) per provetta e risospendere con cautela (Figura 2I).
  8. Incubare le provette per 15-20 minuti a 4 °C. Risospendere accuratamente il pellet con 6 ml di tampone di selezione (Figura 2I-J).
  9. Centrifugare a 300 x g per 10 minuti (a 4 °C) e rimuovere il surnatante. Risospendere con cautela il pellet con 8 ml di tampone di selezione (Figura 2K).
  10. Seguire il programma POSSEL sul separatore (vedi Tabella dei materiali) per preparare otto colonne. Trasferire le celle 1 mL per 1 mL sulla colonna. Attendere che tutte le celle passino prima di aggiungere un altro mL. Eluire le cellule CD11b+ su piastra di eluizione sterile con 1 mL di tampone di selezione (Figura 2L).
  11. Pool di cellule CD11b+ in una nuova provetta da 50 mL (Figura 2M).
  12. Centrifugare a 300 x g per 10 minuti (a 4 °C) e rimuovere il surnatante. Risospendere con cautela il pellet con 10 ml di terreno microglia freddo (fase 1.6) (Figura 2N).
  13. Contare le cellule CD11b+. A P8, si dovrebbe ottenere ~ 650.000 cellule per cervello.
    NOTA: Nel presente protocollo, le celle sono state contate utilizzando un contatore automatico delle celle (vedi Tabella dei materiali).
  14. Risospendere le cellule nel mezzo della microglia fredda ad una concentrazione finale di 650.000-700.000 cellule/ml e dispensare in piastre di coltura cellulare.
    NOTA: Le piastre a 6 pozzetti sono per Western Blot (2 mL per pozzetto); le piastre a 12 pozzetti sono per l'analisi RT-qPCR (1 mL per pozzetto) e le piastre a 96 pozzetti sono per il saggio fagocitario (250 μL per pozzetto); Tutti e tre sono stati utilizzati per questo lavoro. Tuttavia, in questo manoscritto, i risultati dell'analisi Western Blot non sono mostrati, ma è possibile eseguire con questo protocollo.
  15. Posizionare le piastre a 37 °C con il 5% di CO2 durante la notte. Cambiare accuratamente il mezzo con una pipetta da 1.000 μL con mezzo microglia preriscaldato.
  16. Posizionare le piastre a 37 °C con il 5% di CO2 durante la notte prima della stimolazione.
    NOTA: L'isolamento della microglia da più di 36 cuccioli e dopo P9 non è raccomandato. Ciò aumenterà il rischio di contaminazione e accumulo di detriti cellulari per attivare la microglia.

4. Stimolazioni cellulari

  1. Preparare i reagenti di stimolazione secondo la Tabella 3 utilizzando i reagenti disponibili in commercio (vedere Tabella dei materiali).
  2. Aggiungi il volume appropriato in ogni pozzetto stimolato.
    NOTA: Il volume appropriato dipende dalla concentrazione dello stimolo e dalla dimensione del pozzo.
  3. Posizionare le piastre a 37 °C con il 5% di CO2fino alla fine della stimolazione a 6 ore, 24 ore o 48 ore.
  4. Per l'analisi Western Blot, aspirare il surnatante e aggiungere 50 μL di tampone di lisi proteica (vedere Tabella dei materiali) con una pipetta. Utilizzando le punte, grattare il fondo della piastra per staccare le cellule lisate e trasferirle in tubi da 1,5 ml. Conservare a -80 °C.
    NOTA: Le piastre di coltura possono essere conservate per anni a -80 °C se il surnatante viene aspirato correttamente.
  5. Per l'analisi RT-qPCR 6,31, aspirare il surnatante e conservare le piastre di coltura direttamente a -80 °C fino all'estrazione dell'mRNA (fase 5).
  6. Per il test fagocitico, vedere il punto 6.

5. Estrazione di mRNA e analisi RT-qPCR

  1. Eseguire l'estrazione dell'RNA, RT-PCR e RT-qPCR seguendo il protocollo del produttore (vedere la tabella dei materiali). Fare riferimento alla Tabella 4 per le sequenze di primer 5,6,31.
  2. Eseguire l'analisi RT-qPCR seguendoil rapporto 5 precedentemente pubblicato.

6. Saggio fagocitico

  1. Stimolare le cellule ed eseguire il saggio fagocitario durante le ultime 3 ore della stimolazione. Ad esempio, per la stimolazione di 6 ore, iniziare il test fagocitario dopo 3 ore di stimolazione; e per la stimolazione di 12 ore, iniziare il test fagocitico 9 ore dopo l'inizio della stimolazione.
  2. Calcola il numero di perline necessarie per preparare considerando il rapporto (1 cella: 50 perline). Per un pozzetto della piastra a 96 pozzetti, sono necessarie 8,1 x 106 perline. Preparare la miscela di perline secondo la tabella 5.
    NOTA: Vorticare con cautela il flaconcino di sfere prima di aggiungere alla miscela PBS/FBS.
  3. Incubare per 1 ora a bagnomaria a 37 °C. Vortice ogni 10 min.
  4. Calcolare il volume della soluzione da aggiungere a ciascun pozzetto. Aggiungere la soluzione e incubare per 3 ore.
  5. Risciacquare i pozzetti tre volte con 1x PBS. Leggere l'emissione di fluorescenza a 550 nm (lunghezza d'onda di emissione Cy3).

7. Controllo qualità della purezza

  1. Valutare la purezza dell'isolamento magnetico CD11b mediante citometria a flusso (FACS) (prima e dopo l'ordinamento cellulare), quindi eseguire la RT-qPCR.
    1. Contare le cellule e risospenderle in tampone FACS (PBS + 2 mM di EDTA + 0,5% di albumina sierica bovina) per ottenere una diluizione di 10 x 106 cellule/ml dopo la fase 3.5 e la fase 3.14.
    2. Dopo 15 minuti di blocco Fc convenzionale 32,33, incubare le cellule per 15 minuti con sonda di vitalità (FVS780) e anticorpi coniugati con fluorofori contro il topo CD45, CD11b, CX3CR1, ACSA-2, O4 o i corrispondenti isotipi di controllo32,33 alla concentrazione raccomandata dai produttori (vedere Tabella dei materiali).
    3. Lavare le celle con tampone FACS, fissare e permeabilizzare con un kit di permeabilizzazione disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali).
    4. Eseguire nuovamente il blocco Fc sulle cellule permeabilizzate e quindi incubare con anticorpi coniugati con fluorofori contro NeuN (vedi Tabella dei materiali) o il suo isotipo di controllo per 15 minuti.
    5. Eseguire l'analisi FACS dopo il lavaggio con tampone FACS.
    6. Dopo aver escluso i doppietti e le cellule morte in base ai parametri morfologici e alla colorazione FVS780, rispettivamente, selezionare la strategia di gating per l'espressione superficiale di CX3CR1 (microglia), ACSA-2 (astrociti), O4 (oligodendrociti) e presenza intracellulare di NeuN (neuroni) per l'analisi della percentuale di cellule positive.
  2. Dopo il passaggio 5, estrarre l'mRNA ed eseguire RT-qPCR per quantificare Itgam (CD11b), Cx3cr1, Olig2, Synaptophysin, e Gfap mRNA. Normalizzare Cq usando l'mRNA Rpl13a come reporter ed eseguire un'espressione relativa all'mRNA Itgam .

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Risultati

La microglia è il macrofago residente nel SNC che viene attivato quando esposto a sfide ambientali (traumi, molecole tossiche, infiammazione)4,5,6,34 (Figura 3A). Gli studi in vitro sulle microglia sono comunemente usati per valutare i meccanismi autonomi delle cellule correlati a tali sfide ambientali e caratterizzare lo stato di attivazione dopo manipola...

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Discussione

Il lavoro attuale presenta una coltura primaria di cellule microgliali utilizzando cellule CD11b + ordinate magneticamente. Oltre alla valutazione funzionale microgliale (RT-qPCR e saggi fagocitici), è stata determinata anche la purezza della coltura microgliale.

Le colture cellulari di microglia classiche sono comunemente generate dal cervello neonato del roditore P1 o P2 e dalla co-coltura con astrociti per almeno 10 giorni. Le microglia vengono quindi separate meccanicamente utilizzando uno...

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Dichiarazioni

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Le figure sono state create utilizzando BioRender. La ricerca è finanziata da Inserm, Université de Paris, Horizon 2020 (PREMSTEM-874721), Fondation de France, Fondation ARSEP, Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation Grace de Monaco e una sovvenzione aggiuntiva da Investissement d'Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS e Investissement d'Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615Miltenyi Biotec130-116-246
Anti mouse CD11b BV421Sony Biotechnology1106255
Anti mouse CD45 BV510Sony Biotechnology1115690
Anti mouse CX3CR1 PE Cy7Sony Biotechnology1345075
Anti mouse NeuN PEMilli-MarkFCMAB317PE
anti topo O4 Vio Bright B515Miltenyi Biotec130-120-016
BD Kit di permeabilizzazione Cytofix/CytopermBD Biosciences554655
Albumina sierica bovinaMiltenyi Biotec130-091-376
CD11b (Microglia) MicroBeads, h, mMiltenyi Biotec130-093-634
Microscopio confocaleLeica TCS SP8
D-PBS (10x)Thermo Scientific14200067
EDTASigma-AldrichE1644
Falcon Piastra per colture cellulari a 12 pozzetti, fondo piatto + coperchioDutscher353043
Falcon Piastra per colture cellulari a 96 pozzetti, fondo piatto + coperchioDutscher353072
Provette Falcon 50 mLDutscher 352098
Reagente bloccante Fc (Topo CD16/32)BD Biosciences553142
Microscopio a fluorescenzaNikon ECLIPSE TE300
gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubi)Miltenyi Biotec130-096-334
gentleMACS Octo Dissociator with HeatersMiltenyi Biotec130-096-427
Soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10xThermo Scientific14065049
Soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10xThermo Scientific14185045
iQ SYBR  Green SupermixBio-rad1725006CUST
Sintesi Iscript c-DNABio-rad1708890
Perle di lattice, polistirene modificato con ammina, rosso fluorescenteSigma-AldrichL2776-1mL
Lipopolisaccaridi (LPS) da  Escherichia coli O55:B5Sigma-AldrichL2880
Macrofagi-SFM terreno privo di sieroThermo Scientific12065074
MACS BSA Soluzione madreMiltenyi Biotec130-091-376
MACS SmartStrainers (70 &; m), 4 x 25 pzMiltenyi Biotec130-110-916
Mouse IgG1 PEMilliporeMABC002H
Mouse IgG2a PE Cy7Sony Biotechnology2601265
Mouse IL1 betaMiltenyi Biotec130-101-684
Multi-24 Blocchi di colonneMiltenyi Biotec130-095-691
MultiMACS Cell24 SeparatoreMiltenyi
- PapainaMiltenyi Biotec130-092-628
Nucleocounter NC-200Chemometec
Nucleospin RNA Plus XSMacherey Nagel740990.5
Nun EZFlip Top Provette da centrifuga conicheThermo Scientific362694
OPTILUX Petri piatto - 100 x 20 mmDutscher
Pé nillina-streptomicina (10 000 U/mL)Thermo Scientific15140122
Rat IgG2b, k BV421BD Biosciences562603
Rat IgG2b, k BV510Sony Biotechnology2603230
controllo REA (S) PE vio 615Miltenyi Biotec130-104-616
controllo REA (S) Vio Bright B515Miltenyi Biotec130-113-445
Proteina IFN-gamma di topo ricombinanteR& D System485-MI
Proteina IL-10 ricombinantedi topo R& D System417-ML
Proteina IL-4 ricombinante di topoR& D System404-ML
RIPA BufferSigma-AldrichR0278
Sonda di vitalità (FVS780)BD Biosciences565388
Kit di dissociazione del tessuto neurale Biotec 353003

Riferimenti

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