Method Article

Preparazione del campione e quantificazione relativa mediante metilazione riduttiva delle ammine per studi peptidomici

DOI:

10.3791/62971

⸱

November 4th, 2021

 ,  ,  , 
1Department of Biological and Environmental Sciences, Bioscience Institute, Sao Paulo State University (UNESP), 2Biodiversity of Coastal Environments Postgraduate Program, Bioscience Institute, Sao Paulo State University (UNESP)

In This Article

Summary

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Questo articolo descrive un metodo di preparazione del campione basato sull'inattivazione termica per preservare i peptidi endogeni evitando la degradazione post-mortem, seguito dalla quantificazione relativa utilizzando l'etichettatura isotopica più LC-MS.

Abstract

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La peptidomica può essere definita come l'analisi qualitativa e quantitativa dei peptidi in un campione biologico. Le sue principali applicazioni includono l'identificazione dei biomarcatori peptidici della malattia o dello stress ambientale, l'identificazione di neuropeptidi, ormoni e peptidi intracellulari bioattivi, la scoperta di peptidi antimicrobici e nutraceutici da idrolizzati proteici e può essere utilizzato in studi per comprendere i processi proteolitici. Il recente progresso nella preparazione dei campioni, nei metodi di separazione, nelle tecniche di spettrometria di massa e negli strumenti computazionali relativi al sequenziamento delle proteine ha contribuito all'aumento del numero di peptidi identificati e delle peptidome caratterizzate. Gli studi peptidomici analizzano frequentemente i peptidi che sono generati naturalmente nelle cellule. Qui viene descritto un protocollo di preparazione del campione basato sull'inattivazione del calore, che elimina l'attività della proteasi e l'estrazione con condizioni lievi, quindi non vi è scissione dei legami peptidici. Inoltre, viene mostrata anche la quantificazione relativa dei peptidi utilizzando l'etichettatura isotopica stabile mediante metilazione riduttiva delle ammine. Questo metodo di etichettatura presenta alcuni vantaggi in quanto i reagenti sono disponibili in commercio, poco costosi rispetto ad altri, chimicamente stabili e consentono l'analisi di un massimo di cinque campioni in una singola esecuzione LC-MS.

Introduction

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Le scienze "omiche" sono caratterizzate dall'analisi approfondita di un insieme di molecole, come DNA, RNA, proteine, peptidi, metaboliti, ecc. Questi set di dati generati su larga scala (genomica, trascrittomica, proteomica, peptidomica, metabolomica, ecc.) hanno rivoluzionato la biologia e portato a una comprensione avanzata dei processi biologici1. Il termine peptidomico cominciò ad essere introdotto all'inizio del 20 ° secolo e alcuni autori si sono riferiti ad esso come una branca della proteomica2. Tuttavia, la peptidomica ha peculiarità distinte, dove l'interesse principale è quello di indagare il conte....

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Protocol

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La seguente procedura per l'estrazione peptidica e la metilazione riduttiva è stata adattata dalle procedure precedentemente pubblicate24,25,26,27. Questo protocollo ha seguito le linee guida del Consiglio nazionale per il controllo della sperimentazione animale (CONCEA) ed è stato approvato dalla Commissione etica per l'uso animale (CEUA) presso l'Istituto di bioscienze dell'Università statale di San Paolo. I passaggi del protocollo sono illustrati nella Figura 1.

NOTA: Preparare tut....

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Results

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I risultati ottenuti dalle esecuzioni effettuate sullo spettrometro di massa sono memorizzati in file di dati grezzi che possono essere aperti nel software dello spettrometro di massa. Negli spettri MS, è possibile osservare gruppi di picco che rappresentano peptidi marcati secondo lo schema di etichettatura utilizzato, che vanno da 2-5 etichette. Ad esempio, nella Figura 2, coppie di picchi rilevati in un tempo cromatografico sono rappresentate in un esperimento in cui sono state utilizzate.......

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Discussion

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Nella maggior parte degli studi peptidomici, uno dei passaggi critici è, senza dubbio, la preparazione del campione che deve essere eseguita con attenzione per evitare la presenza di frammenti peptidici generati dalle proteasi dopo pochi minuti post-mortem. Gli studi iniziali su estratti cerebrali preparati da campioni non microonde hanno mostrato la presenza di un gran numero di frammenti proteici nei microfiltrati 10-kDa. Sono stati descritti diversi approcci per evitare spettri peptidici dalla degradazione delle prote.......

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Disclosures

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Non esistono interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgements

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Lo sviluppo e l'uso delle tecniche qui descritte sono stati supportati dalla sovvenzione del Consiglio Nazionale delle Ricerche brasiliano 420811/2018-4 (LMC); Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (www.fapesp.br) sovvenzioni 2019/16023-6 (LMC), 2019/17433-3 (LOF) e 21/01286-1 (MEME). I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione dell'articolo.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Filtri cut-off da 10 kDaMerck MilliporeUFC801024Amicon Ultra-4, membrana PLGC Ultracel-PL, acetone 10 kDa
Sigma-Aldrich179124
acetonitrileSigma-Aldrich1000291000
bicarbonato di ammonioSigma-Aldrich11213
(EASY-Column)EASY-Column(SC200)  10 cm, ID75 & micro; m, 3 µ m, C18-A2
Etile 3-amminobenzoato metanosolfonatoSigma-AldrichE10521MS-222
FluorescaminaSigma-AldrichF9015
Soluzione di formaldeideSigma-Aldrich252549
Formaldeide-13C, d2, soluzioneSigma-Aldrich596388
Formaldeide-d2 soluzioneSigma-Aldrich492620
Acido formicoSigma-Aldrich33015
Cappa aspiranteQuimisQ216
Acido cloridrico - HClSigma-Aldrich258148
LoBind-Provette di ritenzione proteicaEppendorfEP0030108116-100EA
LTQ-Orbitrap VelosThermo Fisher ScientificLTQ Velos
Forno a microondePanasonicNN-ST67HSRU
n Easy-nLC II nanoHPLCThermo Fisher ScientificLC140
PEAKS StudioBioinformatics Solutions Inc.VERSIONE 8.5
Soluzione salina tamponata con fosfatoInvitrogen3002
compresse precolonna (EASY-Column)Thermo Fisher Scientific(SC001)2 cm, ID100 &; m, 5 µ m, C18-A1
Centrifuga refrigerataHermleZ326Kper provette coniche
Centrifuga refrigerataVisionVS15000CFNIIper microprovette
Colonne di pulizia in fase inversa    (Cartuccia Oasis HLB 1 cc)Waters186000383Oasis HLB 1 cc Cartuccia
cianoborodeuteruro di sodio - NaBD3CNSigma-Aldrich190020
Cianoboroidruro di sodio - NaBH3CNSigma-Aldrich156159
Fosfato di sodio bibasicoSigma-AldrichS9763NOTA: 0,2 M PB= 0,1 M tampone fosfato pH 6,8 (26,85 mL di Na2HPO3 1M) più 0,1 M tampone fosfato pH 6,8 (23,15 mL di NaH2PO3 1M) a 250 ml di acqua
Sodio fosfato monobasicoSigma-AldrichS3139
SonicatoreQsonicaQ55-110
Peptide standardProteimax: LTLRTKL
Tampone trietilammonio - TEAB 1 MSigma-AldrichT7408
Acido trifluoroacetico - TFASigma-AldrichT6508
Acqua ultra purificataMilli-QDirect-Q 3UV
Centrifuga sottovuotoGeneVacMiVac Concentratore
BagnomariaCientec266
Xcalibur SoftwareThermoFisher ScientificOPTON-30965
Colonna analitica Sequenza di aminoacidi di DNA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kandpal, R., Saviola, B., Felton, J. The era of 'omics unlimited. Biotechniques. 46 (5), 354-355 (2009).
  2. Farrokhi, N., Whitelegge, J. P., Brusslan, J. A. Plant peptides and peptidomics. Plant Biotechnology Journal. 6 (2), 105-134 (2008).
  3. Schulz-Knappe, P., Schrader, M., Zucht, H. D.

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Peptidomics StudiesReductive MethylationIsotopic LabelingPeptide QuantitationSample PreparationMass SpectrometryPeptide ExtractionHeat InactivationNeuroblastoma CellsPeptide Biomarkers

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