Qui, descriviamo l'uso del metodo di imaging a singola molecola, DNA Curtains, per studiare il meccanismo biofisico dell'assemblaggio dei condensati EWS-FLI1 sul DNA.
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Articolo metodologico
Imaging a singola molecola dell'assemblaggio di condensati EWS-FLI1 sul DNA
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
I geni di fusione risultanti dalla traslocazione cromosomica sono stati trovati in molti tumori solidi o leucemia. EWS-FLI1, che appartiene alla famiglia FUS/EWS/TAF15 (FET) di oncoproteine di fusione, è uno dei geni di fusione più frequentemente coinvolti nel sarcoma di Ewing. Queste proteine di fusione della famiglia FET ospitano tipicamente un dominio a bassa complessità (LCD) di proteina FET al loro N-terminale e un dominio di legame al DNA (DBD) al loro C-terminale. È stato confermato che EWS-FLI1 forma condensati biomolecolari nei suoi loci di legame bersaglio a causa delle interazioni LCD-LCD e LCD-DBD, e questi condensati possono reclutare RNA polimerasi II per migliorare la trascrizione genica. Tuttavia, il modo in cui questi condensati vengono assemblati nei loro siti di legame rimane poco chiaro. Recentemente, un metodo biofisico a singola molecola - DNA Curtains - è stato applicato per visualizzare questi processi di assemblaggio dei condensati EWS-FLI1. Qui, il protocollo sperimentale dettagliato e gli approcci di analisi dei dati sono discussi per l'applicazione di DNA Curtains nello studio dei condensati biomolecolari che si assemblano sul DNA bersaglio.
Introduzione
La regolazione trascrizionale è un passo cruciale per una precisa espressione genica nelle cellule viventi. Molti fattori, come la modificazione cromosomica, i fattori di trascrizione (TF) e gli RNA non codificanti, partecipano a questo complicato processo 1,2,3. Tra questi fattori, i TF contribuiscono alla specificità della regolazione trascrizionale riconoscendo e legandosi a specifiche sequenze di DNA note come promotori o enhancer e successivamente reclutando altre proteine funzionali per attivare o reprimere la trascrizione 4,5,6,7.
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Protocollo
1. Preparazione del master mix lipidico a doppio strato
- Risciacquare i flaconcini di vetro con acqua bidistillata (ddH2O) e etanolo al 99% e asciugarli in un forno di essiccazione a 60 °C.
- Preparare la miscela lipidica principale sciogliendo 1 g di 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), 100 mg di lipidi polietilenglicolati (PEGilati) (18:1 di 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi (polietilenglicole)-2000] (sale di ammonio) (PEG2000 DOPE) e 25 mg di lipidi biotinilati (18:1 di 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-(cap biotinil) (sale di sodio) (Biotinyl Cap DOPE)) in 10 ml di cloroformio.
- Prepara....
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Risultati
Lo schema delle tende DNA è mostrato nella Figura 1A, nella Figura 1B e nella Figura 1D. La sequenza bersaglio clonata contenente 25 ripetizioni ininterrotte di GGAA si trova nel promotore NORB1 nel sarcoma di Ewing. Questa sequenza target è cruciale per il reclutamento di EWS-FLI128. Le molecole di EWS-FLI1 sono state visualizzate rilevando i segnali EWS-FLI1 marcati con mCherry ottenuti con un lase.......
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Discussione
Poiché gli approcci a singola molecola sono estremamente sensibili al contenuto del sistema di reazione, è necessario investire uno sforzo supplementare per garantire una buona qualità di tutti i materiali e le soluzioni durante gli esperimenti di DNA Curtains, in particolare i lipidi preparati nelle sezioni 1 e 2 e i tamponi utilizzati nella sezione 5. I reagenti di purezza superiore devono essere utilizzati per preparare i tamponi e i tamponi devono essere preparati di recente per il saggio a singola molecola.
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da NSFC Grants No. 31670762 (Z.Q.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| laser a stato solido pompato a diodo da 488 nm | OBIS488LS | ||
| coerente laser a stato solido pompato a diodo da 561 nm | OBIS561LS | ||
| coerente Agar | Rhawn | R003215-50g | |
| DOPE biotinilato | Avanti | 870273P | |
| Albumina sierica bovina | Sigma | A7030 | |
| Cloroformio | Amresco | 1595C027 | |
| Rivestimento Electra 92 | Allresist GmbH | AR-PC 5090.02 | Il rivestimento protettivo conduttivo |
| Desossiribonucleasi I bovino | Sigma | D5139-2MG | |
| DOPC | Avanti | 850375P | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| Vetrino coprioggetti | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939-1EA | |
| KCl | Sigma | 60130 | |
| Lambda DNA | NEB | N3013S | |
| Estratti di imballaggio | Lambda Epicentre | MP5120 | |
| MgCl2 | Sigma | M2670 | |
| NaCl | Sigma | s3014 | |
| Nanoport | Idex | N-333-01 | |
| NheI-HF | NEB | R3131S | |
| Nikon Microscopio invertito | Nikon | Eclipse Ti | |
| NZCYM Brodo | Sigma | N3643-250G | |
| PEG-2000 DOPE | Avanti | 880130P-1G | |
| PEG-8000 | Amresco | 25322-68-3 | |
| PMMA 200K, LATTATO DI ETILE 4% | Allresist GmbH | AR-P 649.04 | |
| PMMA 950K, ANISOLO 2% | Allresist GmbH | AR-P 672.02 | |
| Prime 95B Telecamera CMOS scientifica | FOTOMETRICA | Prime95B | |
| proteinasi K | NEB | P8107S | |
| Vetrino in vetro di silice | G.Finkenbeiner | ||
| Valvola di iniezione a sei vie | Idex | MXP9900-000 | |
| Streptavidina | Thermo | S888 | Diluito con ddH2O |
| Pompa siringa | Harvard Apparatus | Pump11 Elite | |
| T4 DNA Ligasi | NEB | M0202S | |
| Tris base | Sigma | T6066 | |
| XhoI | NEB | R0146V | |
| YOYO-1 Ioduro (491/509) | Invitrogen | Y3601 | Diluito con DMSO |
Riferimenti
- Cramer, P. Organization and regulation of gene transcription. Nature. 573 (7772), 45-54 (2019).
- Zhang, Y., Reinberg, D. Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histon....
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Ristampe e permessi
