Articolo metodologico

Isolamento e coltura di cellule epiteliali gengivali umane primarie utilizzando Y-27632

DOI:

10.3791/62978

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6 novembre 2021

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1Department of Tissue Engineering and Regeneration, School and Hospital of Stomatology, Cheeloo College of Medicine, Shandong University & Shandong Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration & Shandong Engineering Laboratory for Dental Materials and Oral Tissue Regeneration, 2Department of Orthodontics, School and Hospital of Stomatology, Cheeloo College of Medicine, Shandong University & Shandong Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration & Shandong Engineering Laboratory for Dental Materials and Oral Tissue Regeneration, 3Department of Stomatology, Shengli Oilfield Central Hospital, 4Department of Pediatric Surgery, Shengli Oilfield Central Hospital, 5Ningbo Stomatology Hospital of Savaid Stomatology School, Hangzhou Medical College

In questo articolo

Sommario

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Qui presentiamo un metodo modificato per l'isolamento e la coltura di cellule epiteliali gengivali umane aggiungendo l'inibitore della roccia, Y-27632, al metodo tradizionale. Questo metodo è più semplice, richiede meno tempo, migliora le proprietà delle cellule staminali e produce un numero maggiore di cellule epiteliali ad alto potenziale sia per il laboratorio che per le applicazioni cliniche.

Abstract

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Il tessuto gengivale è la prima struttura che protegge i tessuti parodontali e svolge ruoli significativi in molte funzioni orali. L'epitelio gengivale è un'importante struttura del tessuto gengivale, specialmente nella riparazione e rigenerazione del tessuto parodontale. Studiare le funzioni delle cellule epiteliali gengivali ha un valore scientifico cruciale, come la riparazione dei difetti orali e la rilevazione della compatibilità dei biomateriali. Poiché le cellule epiteliali gengivali umane sono cellule cheratinizzate altamente differenziate, la loro durata è breve e sono difficili da passare. Finora, ci sono solo due modi per isolare e colturare cellule epiteliali gengivali, un metodo di espianto diretto e un metodo enzimatico. Tuttavia, il tempo necessario per ottenere cellule epiteliali utilizzando il metodo di espianto diretto è più lungo e il tasso di sopravvivenza cellulare del metodo enzimatico è inferiore. Clinicamente, l'acquisizione del tessuto gengivale è limitata, quindi è necessario un sistema di isolamento e coltura in vitro stabile, efficiente e semplice. Abbiamo migliorato il metodo enzimatico tradizionale aggiungendo Y-27632, un inibitore della chinasi rho-associata (ROCK), che può promuovere selettivamente la crescita delle cellule epiteliali. Il nostro metodo enzimatico modificato semplifica le fasi del metodo enzimatico tradizionale e aumenta l'efficienza della coltura delle cellule epiteliali, che presenta vantaggi significativi rispetto al metodo di espianto diretto e al metodo enzimatico.

Introduzione

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La gengiva umana, la struttura di difesa di prima linea che protegge il tessuto parodontale, non è solo una barriera fisica e chimica1, ma secerne anche diverse classi di mediatori infiammatori che partecipano alle risposte immunitarie e costituiscono una barriera immunitaria2,3. L'epitelio gengivale svolge un ruolo importante nella riparazione e rigenerazione del tessuto parodontale. Pertanto, studiare la difesa e l'immunità dell'epitelio gengivale è di grande importanza per comprendere l'insorgenza, la diagnosi e il trattamento della parodontite. L'isolamento e la coltura di cellule epiteliali gengivali dal tessuto gengivale umano è il primo passo necessario per studiare l'epitelio gengivale. Tale procedura richiede operazioni di base come la produzione di cellule di semi per l'ingegneria tissutale, modelli in vitro di malattie associate parodontali e materiali per la riparazione di difetti parodontali.

Le cellule epiteliali gengivali primarie sono caratterizzate da un basso tasso di divisione in vitro4, i ricercatori hanno cercato un metodo di isolamento e coltivazione ottimale per decenni. Ad oggi, due diverse tecniche, un metodo di espianto diretto e un metodo enzimatico, sono comunemente utilizzate nei laboratori per ottenere cellule epiteliali gengivali primarie in vitro4,5. Il metodo di espianto diretto presenta vantaggi come la necessità di una minore quantità di campioni di tessuto e una semplice procedura di isolamento, ma presenta gli svantaggi di un tempo di coltura più lungo e della suscettibilità alla contaminazione5. Sebbene il metodo enzimatico ridavi il tempo di coltura richiesto, l'efficienza è relativamente bassa e varia a seconda degli enzimi e del mezzo utilizzato. Kedjarune et al.6 hanno dimostrato che il metodo di espianto diretto, che richiede più tempo prima della sottocoltura (2 settimane), sembra avere più successo per la coltivazione di cellule epiteliali gengivali rispetto al metodo enzimatico. Tuttavia, confrontando questi due metodi, Klingbeil et al.7 hanno scoperto che il metodo enzimatico aveva i migliori risultati per le colture primarie di cellule epiteliali orali ed era possibile ottenere la resa cellulare ottimale nel più breve periodo di tempo (11,9 giorni contro 14,2 giorni).

Pertanto, era importante sviluppare un metodo più conveniente ed efficace per l'isolamento e la coltura delle cellule epiteliali orali4. Abbiamo precedentemente riportato che l'aggiunta di Y-27632, un inibitore della proteina chinasi rho-associata (ROCK), semplifica la procedura di isolamento delle cellule epidermiche primarie umane e dei cheratinociti dai tessuti cutanei adulti8,9,10. Abbiamo sviluppato G-medium, un nuovo mezzo di inoculazione condizionato che separa spontaneamente le cellule epidermiche da quelle dermiche e supporta la crescita e la resa delle cellule epidermiche primarie8,9,10. Nel presente studio, abbiamo sviluppato una nuova tecnica di isolamento e coltura senza siero per le cellule epiteliali gengivali combinando G-medium con Y-27632. In sostanza, il nostro metodo si basa su una semplificazione del tradizionale metodo enzimatico in due fasi, quindi abbiamo confrontato il nostro nuovo metodo con il metodo dell'espianto diretto. Questo metodo enzimatico modificato riduce significativamente il tempo necessario per separare le cellule epiteliali gengivali dal tessuto gengivale e aumenta l'efficienza della coltura delle cellule epiteliali gengivali.

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Protocollo

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I tessuti umani utilizzati in questo protocollo sono tessuti gengivali adulti freschi scartati dalle estrazioni dei denti colpiti nel Dipartimento di Chirurgia Maxillo-Facciale secondo le linee guida del Comitato Etico della Ricerca Umana dell'Istituzione (Protocollo n. GR201711, Data: 27-02-2017).

1. Preparativi

  1. Raccogliere tessuti gengivali adulti freschi in provette da 15 mL contenenti 10 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) integrata con penicillina/streptomicina (P/S) al 3% e mantenere i tessuti a 4 °C.
    NOTA: Trattare i tessuti come descritto di seguito entro 24 ore dall'escissione.

2. Preparare i reagenti e il terreno di coltura

  1. Preparare la soluzione di lavaggio: 3% P/S. Mescolare 50 mL di PBS con 1,5 mL di penicillina (100 U/mL) e 1,5 mL di streptomicina (100 mg/L).
  2. Preparare 500 mL di terreno contenente fattore di crescita (chiamato G-medium): DMEM / F12 (3: 1) mezzo contenente 1% P / S, 2% supplemento B27, 20 ng / mL di fattore di crescita epidermico (EGF), 40 ng / mL di fattore di crescita dei fibroblasti 2 (FGF2) e 40 μg / mL di fungizone.
  3. Preparare soluzioni di digestione enzimatica per il nuovo metodo: Sciogliere 125 mg di polvere di dispasi e 125 mg di collagenasi di tipo I in polvere in 50 ml di DMEM.
    NOTA: Filtrare tutte le soluzioni enzimatiche attraverso un filtro da 0,22 μm e conservare a 4 °C.
  4. Preparare 500 ml del mezzo per neutralizzare la digestione enzimatica: 10% di siero bovino fetale (FBS) e 1% P/S nel mezzo DMEM.

3. Metodo di espianto diretto

  1. Pretrattamento del tessuto gengivale
    1. Lavare il tessuto gengivale con 5 ml di etanolo al 75% per 30 s. Quindi, risciacquare due volte con 5 ml della soluzione di lavaggio (passaggio 2.1) per 5 minuti.
      NOTA: Eseguire tutti i lavaggi in piatti di coltura cellulare con un diametro di 50 mm.
  2. Coltura cellulare epiteliale gengivale
    1. Tagliare il tessuto gengivale in 1 mme 3 pezzi e disperderli in un piatto di coltura cellulare da 100 mm. Utilizzare pinza a punta fine e forbici oftalmiche per le operazioni di taglio.
    2. Aggiungere il G-medium (passaggio 2.2) al piatto di coltura. Quindi, incubare il piatto di coltura in un incubatore a CO2 al 5% a 37 °C. Utilizzare un microscopio invertito (40x) per esaminare i tessuti ogni 24 ore.
    3. Rimuovere i pezzi di tessuto gengivale quando le cellule epiteliali si sono propagate a un diametro di 2-5 mm attorno ai pezzi di tessuto. Cambiare il G-medium ogni 2-4 giorni.

4. Il nuovo metodo enzimatico modificato

  1. Pretrattamento del tessuto gengivale
    1. Per questo, seguire gli stessi passaggi descritti per il metodo di espianto diretto, passaggio 3.1.1.
  2. Digestione del tessuto gengivale
    1. Tagliare il tessuto gengivale in piccoli pezzi, di circa <1 mm, con due lame sterilizzate. Ripetere il processo di triturazione con due lame chirurgiche.
    2. Aggiungere 1 mL di soluzione di 2,5 mg/mL dispasi + collagenasi in un tubo di centrifuga da 1,5 mL contenente i pezzi di tessuto gengivale, quindi incubare il tubo per 15-20 minuti in un incubatore a 37 °C.
    3. Quando il tessuto diventa trasparente e flocculante, aggiungere 1 mL della soluzione di neutralizzazione per terminare la digestione. Mescolare accuratamente la soluzione pipettando su e giù 10-15 volte. Passare la soluzione attraverso un filtro a rete da 100 μm.
    4. Centrifuga a 200 x g per 5 min.
    5. Rimuovere il surnatante e risusegnare il pellet cellulare sul fondo in 10 ml di terreno contenente fattore di crescita (fase 2.2). Trasferire la sospensione cellulare in una vasca di coltura cellulare da 100 mm. Aggiungere 10 μM di Y-27632 alla parabola di coltura cellulare.
    6. Colturare le cellule a 37 °C in un incubatore a CO2 al 5%. Sostituire il vecchio G-medium con il G-medium fresco ogni 2 giorni. Osserva le cellule il giorno 1 e il giorno 3.

5. Passaggio cellulare

  1. Togliere il piatto dall'incubatrice, rimuovere il mezzo esaurito e lavare due volte con PBS. Aggiungere 2 ml di tripsina dello 0,05% per ogni piatto da 100 mm.
    NOTA: Agitare il piatto per assicurarsi che ci sia abbastanza contatto tra la soluzione di tripsina e il fondo del piatto.
  2. Lasciare il piatto in un'incubatrice circa 5 minuti a 37 °C per il processo di digestione.
  3. Utilizzare un microscopio (40x) per esaminare le cellule e assicurarsi che la maggior parte delle cellule si siano separate dal fondo del piatto.
  4. Aggiungere 2 mL della soluzione di neutralizzazione per fermare la digestione e trasferire le cellule in un tubo da 15 ml. Pipetta su e giù 10-15 volte. Centrifugare le celle a 200 x g per 5 min.
  5. Rimuovere lentamente il surnatante. Risuspentare le cellule con 10 ml di G-medium e contare il numero di cellule.
  6. Aggiungere circa 1 x 106 celle in 10 mL di G-medium e 10 μM Y-27632 a ciascun piatto da 100 mm.
  7. Rinnovare il G-medium e l'Y-27632 ogni 2 giorni. Visualizza le celle il giorno 1 e il giorno 5.

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Risultati

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La Figura 1 mostra un diagramma schematico del metodo di espianto diretto e del metodo enzimatico modificato. Il metodo di espianto diretto non ha bisogno di alcun enzima digestivo durante l'intero processo. Al contrario, il metodo enzimatico tradizionale di solito ha bisogno di due serie di enzimi digestivi, dispasi e collagenasi, per separare il foglio epiteliale dallo strato di fibroblasti sottostante, e quindi tripsina per rilasciare le cellule epiteliali in sospensione. Il nostro nuovo ...

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Discussione

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Il tessuto gengivale è una struttura chiave che mantiene l'integrità parodontale e la salute. Le cellule epiteliali gengivali hanno ruoli significativi nella riparazione e rigenerazione del tessuto parodontale e possono essere utilizzate nella ricerca scientifica e nelle applicazioni cliniche e campi correlati, tra cui biologia orale, farmacologia, tossicologia e carenze della mucosa orale18. Pertanto, è necessario sviluppare un metodo stabile ed efficiente per raccogliere le cellule epiteliali or...

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Dichiarazioni

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Tutti gli autori dichiarano nessun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato dal Key Program della Shandong Province Natural Science Foundation (ZR2019ZD36) e dal Key Research and Development Program of Shandong Province (2019GSF108107) a X.W.; il programma chiave di ricerca e sviluppo della provincia di Shandong (2018GSF118240) a J.G.; Progetto di sviluppo medico e sanitario scientifico e tecnologico della provincia di Shandong (2018WS163) a Z.X. e il progetto di sviluppo medico e sanitario scientifico e tecnologico della provincia di Shandong (2019WS045) a J.S.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
NomiAbbreviazioni & Contatori
di cellule automatizzati CountessShanghai Ruiyu Bio-science& La tecnologia Co.Ltd.BBA0218ACConta cellulare automatico
Incubatore a CO2Thermo Scientific51026333Per incubazione cellulare
Centrifuga Sorvall ST 16RThermo Scientific75004380Centrifuga cellulare
Piatto per coltura cellulareEppendorf30702115Per colture cellulari
Tubo da centrifuga da 50 mlKIRGEN171003Per centrifugazione cellulare
Provette per microcentrifuga da 1,5 mlKIRGEN190691JPer la digestione cellulare
Filtro cellulareCorning incorporato431792Filtrazione cellulare
Soluzione tamponata con fosfatoSolarbio Life ScienceP1020-500Soluzione di lavaggio
DMEMThermo ScientificC11995500Componente del mezzo di neutralizzazione
Definito K-SFMLife Tecnologie10785-012Terreno di coltura di cellule epiteliali gengivali
Penicillina StreptomicinaThermo Scientific15140-122Antibiotici
Fetale Siero bovinoIndustrie biologiche04-001-1AC5Componente del mezzo di neutralizzazione
0,05% TripsinaLife Technologies25300-062Per la dissociazione degli HGGEPC
Mezzo di diluizioneLife Technologies50-9701Per la matrice di rivestimento
DispaseGibco17105-041Per l'isolamento degli HGGEPC
Collagenasi di tipo ILife Technologies17100-017Per l'isolamento degli HGGEPC
Miscela di nutrienti F12, HamsLife Technologies31765035Componente dell'integratore G-medium
B27Life Technologies17504044Fattore di crescita nel G-medium
FGF-2 MilliporeMerck Biosciences341595Fattore di crescita nel G-medium
Y-27632Funzionamento del geneIAD1011Inibitore ROCK
FungizoneGibco15290026Preparazione per G-medium
EGF Proteina umana ricombinanteGibcoPHG0311Fattore di crescita nel G-medium
Cell Counting Kit-8Dojindo Molecular TechnologiesCK04Per il saggio di proliferazione cellulare
Coniglio anti-umano CK18Abcamab82254Per la colorazione in immunofluorescenza per controllare il marcatore di differenziazione degli HGGEPC
Coniglio Anti-Citocheratina Umana10Abcamab76318Per la colorazione in immunofluorescenza per controllare il marcatore di differenziazione degli HGGEPC
Mouse anti-umano VimentinaCell Signaling Technology3390Per la colorazione in immunofluorescenza dei fibroblasti gengivali
Coniglio Anti-Human pan-ckBD550951Per la colorazione in immunofluorescenza per controllare il marcatore di differenziazione degli HGGEPC
coniglio anti-Ki67Abcam15580Per la colorazione in immunofluorescenza per controllare il marcatore di differenziazione degli HGGEPC
coniglio anti-p63Biolegend 619002Per la colorazione in immunofluorescenza per controllare il marcatore di differenziazione degli HGGEPC
coniglio anti-p75NGFRAbcamab52987Per la colorazione in immunofluorescenza per controllare il marcatore di differenziazione degli HGGEPC

Riferimenti

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