La ghiandola salivare della zanzara adulta (SG) è necessaria per la trasmissione di tutti gli agenti patogeni trasmessi dalle zanzare ai loro ospiti umani, inclusi virus e parassiti. Questo video dimostra l'efficiente isolamento degli SG dalle zanzare Anopheles gambiae allo stadio larvale (L4) e la preparazione degli SG L4 per ulteriori analisi.
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Articolo metodologico
Dissezione e immunocolorazione delle ghiandole salivari larvali da zanzare Anopheles gambiae
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le ghiandole salivari delle zanzare (SG) sono un organo gateway necessario per la trasmissione di agenti patogeni trasmessi dagli insetti. Gli agenti che causano malattie, compresi i virus e i parassiti del Plasmodium che causano la malaria, si accumulano nelle cavità secretorie delle cellule SG. Qui, sono pronti per la trasmissione ai loro ospiti vertebrati durante un successivo pasto di sangue. Mentre le ghiandole adulte si formano come un'elaborazione di resti di gemme del dotto SG larvale che persistono oltre l'istolisi SG pupale precoce, l'SG larvale è un bersaglio ideale per interventi che limitano la trasmissione della malattia. Comprendere lo sviluppo del SG larvale può aiutare a sviluppare una migliore comprensione della sua morfologia e degli adattamenti funzionali e aiutare nella valutazione di nuovi interventi che mirano a questo organo. Questo protocollo video dimostra una tecnica efficiente per isolare, fissare e colorare gli SG larvali dalle zanzare Anopheles gambiae. Le ghiandole sezionate dalle larve in una soluzione di etanolo al 25% sono fissate in una miscela di metanolo e acido acetico glaciale, seguita da un lavaggio a freddo con acetone. Dopo alcuni risciacqui in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), gli SG possono essere colorati con una vasta gamma di coloranti marcatori e / o antisieri contro le proteine espresse SG. Questo metodo per l'isolamento SG larvale potrebbe anche essere utilizzato per raccogliere tessuto per l'analisi di ibridazione in situ, altre applicazioni trascrittomiche e studi proteomici.
Introduzione
La malaria è una delle principali minacce per la salute pubblica che causa quasi 230 milioni di infezioni e circa 409.000 morti nel 20191. La maggior parte dei decessi si trova nell'Africa sub-sahariana e sono causati dal parassita Plasmodium falciparum,il cui insetto vettore è Anopheles gambiae,oggetto di questo video dimostrativo. Sebbene i numeri indichino un calo significativo del tasso di mortalità annuale dall'inizio del secolo (> 300.000 decessi annuali in meno), le promettenti diminuzioni dei tassi di malattia osservate dal 2000 al 2015 si stanno assottigliando, suggerendo la necessità di nuovi approcci per limitare la....
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Protocollo
1. Preparazione di soluzioni e strumenti
- Preparazione della soluzione di dissezione
- Per preparare la soluzione di dissezione, aggiungere 2,5 ml di etanolo al 100% a 7,5 ml di H2O distillato in un tubo di plastica 15. Invertire il tubo 3 volte per mescolare.
NOTA: questa soluzione può essere conservata a temperatura ambiente per diverse settimane.
- Per preparare la soluzione di dissezione, aggiungere 2,5 ml di etanolo al 100% a 7,5 ml di H2O distillato in un tubo di plastica 15. Invertire il tubo 3 volte per mescolare.
- Preparazione di 10 stock salino tamponato con fosfato (PBS)
- Per preparare 10 stock PBS, aggiungere 17,8 g Na2HPO4• 2H2O, 2,4 g KH2PO4, 80 g NaCl e 2 g KCl a 800 ml di acqua deionizzata. Mescol....
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Risultati
Le ghiandole salivari sono relativamente facili da sezionare da tutte le larve dello stadio 4. Le larve maschili e femminili possono essere distinte allo stadio larvale L4 tardivo da una striscia rossa lungo il torace dorsale delle femmine ma non dei maschi (Figura 2). Osserviamo anche che la morfologia antennale è molto più elaborata nel maschio che nelle larve L4 femminili (Figura 2), simile alle differenze osservate in questa struttura nelle zanzare adulte. I.......
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Discussione
Il protocollo qui descritto è stato adattato da un protocollo di dissezione Drosophila SG e da un protocollo di dissezione delle zanzare adulte14,15,16. Tuttavia, la maggior parte dei marcatori non è penetrata nella membrana basale (dati non mostrati) quando si utilizzano i metodi di dissezione per adulti e colorazione SG. Gli adattamenti del protocollo per adulti includevano la dissezione delle ghiandole in una soluzione di EtO.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare il Johns Hopkins Malaria Research Institute per l'accesso e l'allevamento delle larve di An. gambiae.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| KH2PO4Millipore | Sigma | P9791 | |
| Na2HPO4 & toro; 2H2O | Millipore Sigma | 71643 | |
| NaCl | Millipore Sigma | S7653 | |
| Acetone | Millipore Sigma | 179124 | |
| Pennello con setole morbide | Amazon (SN NJDF) Set di pennelli per dettagli | B08LH63D89 | |
| Vetrini coprioggetti (22 x 50 mm) | VWR | 48393-195 | |
| DAPI (DNA) | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| Alcool etilico 200 proof | Millipore Sigma | EX0276 | |
| Gilson Pipetman P200 Pipetta | Gilson | P200 | |
| Acido acetico glaciale | Sigma Aldrich | 695092 | |
| Pinze per gioiellieri, Dumont No. 5 | Millipore Sigma | F6521 | |
| KCl | Millipore Sigma | 58221 | |
| Metanolo | Millipore Sigma | 1414209 | |
| Smalto per unghie | Amazon (Sally Hansen) | B08148YH9M | |
| Nile Red (lipidi) | ThermoFisher Scientific | N1142 | |
| Salviette di carta | ULINE | S-7128 | |
| Petri plate (per fare una piastra di mastice) | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | |
| Pipette Tips | Gilson | Tips E200ST | |
| Pipetta di trasferimento in plastica | Fisher | S304671 | |
| Anticorpi primari (ad es. Crb, Rab11) | Studi sullo sviluppo Banca degli ibridomi (DSHB); Andrew Lab | Mouse anti-Crb (Cq4) o Rabbit anti-Rab11 | |
| Anticorpi secondari con etichette fluorescenti (ad es. Alexa Fluor 488 Goat-anti Rabbit) | ThermoFisher Scientific | A11008 | |
| Resina siliconica e agente indurente per lastra di mastice | Dow Chemicals - Ximeter Silicone | PMX-200 | |
| Vetrini, smerigliati su un'estremità per l'etichettatura | VWR 20 X 50 mm | 48393-195 | |
| agglutinina del germe di grano | ThermoFisher Scientific | W834 |
Riferimenti
- World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization. , Available from: https://apps.who.int/iris/handle/10665/337660 (2020).
- Feachem, R. G. A., et al. Malaria eradication within a generation: ambitious, achievable, and necessary. Lancet. 394 (10203), 1056-1112 (2019).
- Adolfi, A., et al.
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Ristampe e permessi
