Valutazione del consumo di aminoacidi in cellule ossee in coltura e alberi ossei isolati

Gli amminoacidi sono composti organici che contengono un gruppo funzionale amminico (-NH₂) e carbossilico (-COOH) con una catena laterale variabile specifica per ciascun amminoacido. In generale, gli amminoacidi sono ben noti come costituenti di base delle proteine. Più recentemente, sono stati chiariti nuovi usi e funzioni degli amminoacidi. Ad esempio, i singoli amminoacidi possono essere metabolizzati per generare metaboliti intermedi che contribuiscono alla bioenergetica, funzionano come cofattori enzimatici, regolano le specie reattive dell'ossigeno o sono usati per sintetizzare altri amminoacidi 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Molti studi dimostrano che il metabolismo degli aminoacidi è fondamentale per la pluripotenza, la proliferazione e la differenziazione cellulare in vari contesti 3,6,11,12,13,14,15,16,17.

Gli osteoblasti sono cellule secretorie che producono e secernono la matrice ossea extracellulare ricca di collagene di tipo 1. Per sostenere alti tassi di sintesi proteica durante la formazione ossea, gli osteoblasti richiedono un apporto costante di aminoacidi. Per soddisfare questa domanda, gli osteoblasti devono acquisire attivamente aminoacidi. Coerentemente con questo, studi recenti rivelano l'importanza dell'assorbimento e del metabolismo degli aminoacidi nell'attività degli osteoblasti e nella formazione ossea 15,16,17,18,19,20.

Gli osteoblasti acquisiscono aminoacidi cellulari da tre fonti principali: ambiente extracellulare, degradazione intracellulare delle proteine e biosintesi de novo degli aminoacidi. Questo protocollo si concentrerà sulla valutazione dell'assorbimento di aminoacidi dall'ambiente extracellulare. I metodi più comuni per misurare l'assorbimento di aminoacidi si basano su amminoacidi radiomarcati (ad esempio, ³H o ¹⁴C) o marcati con isotopi pesanti (ad esempio, ¹³C). I saggi di isotopomeri pesanti possono analizzare l'assorbimento degli amminoacidi e il metabolismo in modo più approfondito e sicuro, ma richiedono più tempo e richiedono più giorni per essere completati poiché ci vuole un giorno per preparare e derivatizzare i campioni e più giorni per analizzare sullo spettrometro di massa a seconda del numero di campioni^21,22. In confronto, i saggi di assorbimento degli aminoacidi radiomarcati non sono informativi sul metabolismo a valle, ma sono economici e relativamente veloci, potendo essere completati entro 2-3 ore dall'inizio dell'esperimento^23,24. Qui, descriviamo un protocollo di base facilmente modificabile progettato per valutare l'assorbimento di aminoacidi radiomarcati in cellule primarie in coltura o linee cellulari in vitro o singoli alberi ossei ex vivo. L'applicazione di questi due protocolli può essere estesa ad altri aminoacidi radiomarcati e ad altri tipi cellulari e tessuti associati all'osso.

Tutte le procedure sui topi descritte nel presente documento sono state approvate dai comitati di studi sugli animali presso l'Università del Texas Southwestern Medical Center di Dallas. Il protocollo sulle radiazioni è stato approvato dal Comitato consultivo per la sicurezza delle radiazioni presso l'Università del Texas Southwestern Medical Center di Dallas.

1. Assorbimento di aminoacidi nelle cellule (Protocollo I)

1. Piastra 5 x 10⁴ cellule ST2 in ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 12 pozzetti. Cellule di piastra in α-MEM contenenti 10% FBS, 100 U/mL di penicillina e 0,1 μg/mL di streptomicina (Pen/Strep). Piastra extra pozzetti di cellule per quantificare il numero di celle per condizione per le normalizzazioni nel passaggio 1.12. Incubare le cellule in un incubatore di coltura cellulare umidificata a 37 °C con il 5% di CO₂.
2. Coltiva le cellule per 2-3 giorni fino a quando non sono confluenti.
3. Il giorno dell'esperimento, preparare le seguenti soluzioni: 1x soluzione salina tamponata fosfato (PBS), pH 7,4 e tampone Krebs Ringers HEPES (KRH), pH 8,0: (120 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl₂, NaHCO₃, 5 mM HEPES, 1 mM D-glucosio). Preriscaldare a 37 °C.
4. Aspirare il mezzo e lavare le cellule due volte con 1 mL di 1x PBS, pH 7,4.
   NOTA: questo protocollo è appropriato anche per dividere rapidamente le celle non confluenti. In questo caso, è importante normalizzare la radioattività al numero assoluto di cellule o al contenuto di DNA. Inoltre, considerare di aumentare le dimensioni della piastra o del pallone di coltura per aumentare il numero complessivo di cellule e i valori di cpm. Questo è importante per determinare empiricamente su base individuale.
5. Aspirare 1x PBS e lavare le cellule una volta con 1 mL di KRH.
6. Produrre 4 μCi/mL di L-[3,4-3 H]-glutammina diluendo 4 μL di [1 μCi μL-1] L-[3,4-3 H]-glutammina per ¹ mL di KRH.
   NOTA: Prima di utilizzare materiali radioattivi, contattare l'Ufficio per la sicurezza delle radiazioni dell'istituto di origine per ottenere le approvazioni. Tutte le procedure relative alle radiazioni devono essere eseguite dietro lo schermo in plexiglass.
7. Incubare cellule con 0,5 mL di KRH contenenti 4 μCi/mL L-[3,4-3 H]-glutammina terreno di lavoro per 5 min.
8. Raccogliere il mezzo radioattivo e distribuirlo nel contenitore dei rifiuti liquidi. Lavare brevemente le cellule tre volte con KRH ghiacciato per terminare la reazione. Raccogliere e gettare tutti i lavaggi nel contenitore dei rifiuti liquidi radioattivi.
9. Aggiungere 1 mL di SDS all'1% a ciascun pozzetto e triturare 10x per lisare e omogeneizzare le cellule. Trasferire i lisati cellulari in provette da 1,5 ml. Eliminare le piastre di coltura cellulare, le pipette sierologiche e le punte delle pipette nel contenitore dei rifiuti radioattivi solidi.
10. Centrifugare a >10.000 x g per 10 min. Trasferire i surnatanti in flaconcini di scintillazione contenenti 8 mL della soluzione di scintillazione. Mescolare agitando energicamente i flaconcini a scintillazione. Eliminare i tubi e le punte delle pipette nel contenitore dei rifiuti radioattivi solidi.
11. Leggere la radioattività in conteggi al minuto (cpm) utilizzando un contatore di scintillazione. Gettare i flaconcini di scintillazione nel contenitore per rifiuti del flaconcino di scintillazione.
12. Tripsinizzare, risospendere e contare le cellule dalle rimanenti piastre non radioattive di cellule (vedere il punto 1.1) per stimare il numero di cellule nelle colture radioattive lisate. Utilizzando un emocitometro, contare il numero di cellule per pozzo non radioattivo per ogni condizione sperimentale. Normalizzare il cpm dal punto 1.11 al numero stimato di cellule dalle piastre non radioattive.
13. Dopo il completamento dell'esperimento, decontaminare la cappa di coltura cellulare, il banco e tutti gli strumenti con uno spray decontaminante alla radioattività. Infine, eseguire test di pulizia per garantire che l'area di lavoro sia priva di radiazioni.

2. Assorbimento di aminoacidi nei tessuti ossei appena isolati (Protocollo II)

1. Preriscaldare KRH a 37 °C.
2. Eutanasia un topo di 3 giorni e rimuovere la pelle sulle braccia. Disarticolare l'omeri dalla spalla usando le forbici e sezionare entrambi gli omeri. Rimuovere tutti i tessuti estemporanei usando un bisturi e una pinza. Rimuovere le epifisi dall'osso.
   NOTA: Oltre agli humerii, questo protocollo può essere adattato a femori, tibie e calvarie neonatali, nonché a umeri, femori e tibie isolati da topi di 2 e 4 mesi (dati non pubblicati).
3. Eliminare il midollo dall'osso e pesare gli alberi ossei per normalizzarli nel passaggio 2.14.
4. Far bollire un omero in 1x PBS a 100 °C per 10 minuti per decellularizzare l'osso. L'osso bollito decellularizzato viene utilizzato come controllo negativo.
   NOTA: Come controllo di qualità, la paraffina incorpora le ossa bollite e non bollite per le macchie istologiche per confermare visivamente che l'ebollizione era efficace nella decellularizzazione dell'osso.
5. Equilibrare entrambi gli omeri in 1 mL di KRH per 30 minuti nell'incubatore per colture cellulari a 37 °C.
6. Preparare una soluzione di lavoro di 4 μCi/mL L-[2,3,4-3 H]-arginina in KRH diluendo 4 μL di 1μCi/μL L-[2,3,4-3 H]- Arginina per 1 mL KRH.
   NOTA: Questo protocollo è appropriato per valutare l'assorbimento di qualsiasi nutriente radiomarcato sia scelto. L-[2,3,4-3 H]-glutammina, L-[¹⁴C_U]-alanina e L-[2,3-3 H]-prolina sono stati testati con risultati simili. I dati di arginina sono mostrati per evidenziare l'utilità di questo protocollo.
   ATTENZIONE: Tutte le procedure che utilizzano radiazioni devono essere eseguite dietro lo schermo in plexiglass utilizzando appositi dispositivi di protezione individuale (DPI).
7. Incubare separatamente sia l'osso di controllo sperimentale che quello bollito in KRH contenente 4 μCi/mL di L-[2,3,4-3 H]-arginina per un massimo di 90 minuti a 37 °C.
   NOTA: È importante determinare empiricamente i tempi di incubazione per diverse condizioni tra cui l'età dei topi, i diversi elementi scheletrici e i tipi di aminoacidi radiomarcati eseguendo un corso temporale. La saturazione si verifica per lo più dopo circa 3-4 ore. L'assorbimento dovrebbe essere valutato in un punto temporale nella rabbia lineare dell'assorbimento.
8. Rimuovere il mezzo radioattivo e gettarlo nel contenitore dei rifiuti radioattivi liquidi. Lavare l'humeri tre volte usando 1 mL ghiacciato di KRH per terminare la reazione. Eliminare tutti i lavaggi nel contenitore dei rifiuti radioattivi liquidi.
9. Trasferire ogni osso in un tubo da 1,5 ml. Aggiungere 500 μL di tampone RIPA [150 mM NaCl; 5 mM EDTA; 50 mM Tris (pH 8,0); 0,5% NP40 (v/v); 0,5% DOX (p/v); 0,1% SDS (p/v)]. Gettare le piastre di coltura, le pipette sierologiche e le punte delle pipette in un contenitore di rifiuti solidi radioattivi.
10. Omogeneizzare gli omeri tagliando 100 volte con le forbici in un tampone RIPA.
11. Sonicare (ampiezza: 35%, impulso 1 s) l'osso omogeneizzato risultante per 10 s.
    NOTA: La sonicazione è anche nota per produrre aerosol. Le fasi di sonicazione possono essere eseguite in un armadio di sicurezza biologica. Per ridurre la formazione di aerosol, è importante non riempire eccessivamente i tubi. La sonicazione di piccoli volumi di campioni può comportare una sonicazione incompleta o la perdita di campioni a causa della formazione di schiuma. In caso di formazione di schiuma, centrifugare il campione per 5 minuti per depositare.
12. Chiarire il lisato mediante centrifugazione per 10 minuti a >10.000 x g a temperatura ambiente. Trasferire 200 μL del surnatante in flaconcini di scintillazione contenenti 8 mL della soluzione di scintillazione. Mescolare agitando energicamente i flaconcini a scintillazione. Gettare tutti i rifiuti radioattivi solidi (ad esempio, tubi usati, punte di pipette, piastre, ecc.) nel contenitore dei rifiuti radioattivi solidi.
13. Leggere la radioattività (cpm) utilizzando il contatore di scintillazione. Gettare i flaconcini a scintillazione usati nel contenitore dei rifiuti radioattivi designato per i flaconcini di scintillazione.
14. Sottrarre il cpm dell'osso bollito (valore basale) dal cpm dell'osso sperimentale. Normalizzare la radioattività con il peso osseo dal punto 2.3.
15. Spruzzare la cappa di coltura cellulare, gli strumenti e il banco con decontaminante radioattivo. Eseguire test di pulizia per verificare che l'area di lavoro sia priva di radiazioni.

Il trasporto di aminoacidi è regolato da molti trasportatori di aminoacidi legati alla membrana che sono stati classificati in sistemi di trasporto distinti basati su numerose caratteristiche, tra cui la specificità del substrato, la cinetica e la dipendenza da ioni e pH25. Ad esempio, l'assorbimento di glutammina può essere mediato dai sistemi di trasporto Na+-dipendenti A, ASC, γ+L e N o dal sistema Na+-indipendente L. I sistemi Na+-dipendenti si distinguono per la capacità di sostituire Li+ con Na+ (Sistema N) o sensibilità all'analogo amminoacido acido 2-(metilammino)isobutirrico (MeAIB) (Sistema A). Lo scopo di questo esperimento era quello di definire la quantità di consumo di glutammina attribuibile a ciascun sistema di trasporto. L'assorbimento di glutammina L-[3,4-3 H] è stato misurato in cellule ST2 confluenti in KRH normale contenente 120 mM NaCl, KRH libero Na+ contenente 120 mM cloruro di colina, KRH normale contenente 5 mM MeAIB o KRH libero Na+ contenente 120 mM LiCl. La radioattività totale (conteggi al minuto) è stata normalizzata al numero di cellule. La rimozione di Na+ ha portato a una riduzione del 90% dell'assorbimento di glutammina. Ciò ha indicato che il Sistema L rappresenta il 10% dell'assorbimento di glutammina mentre il 90% dell'assorbimento di glutammina è Na+ dipendente nelle cellule ST2 (Figura 2). La presenza di Li+ ha aumentato l'assorbimento di glutammina solo del 2% rispetto alla condizione libera da Na+, mentre 5 mM MEAIB non hanno influenzato l'assorbimento di glutammina. Questi dati indicano che la maggior parte dell'assorbimento di glutammina è mediato dai sistemi ASC e γ + L, mentre il sistema N e il sistema A sono responsabili rispettivamente di circa il 2% e lo 0% dell'assorbimento di glutammina Na+-dipendente.

Abbiamo modificato il protocollo I per caratterizzare l'assorbimento di aminoacidi nei fusti ossei ex vivo. In questo esperimento abbiamo seguito il protocollo II per caratterizzare la cinetica di assorbimento dell'arginina in ossa lunghe isolate da topi di 3 giorni (p3). Per fare questo, abbiamo prima sezionato entrambi gli omeri dai topi p3. Le epifisi sono state rimosse e il midollo è stato filato e ogni omero è stato pesato per la normalizzazione. L'omero controlaterale è stato designato come un controllo negativo ed è stato bollito per uccidere l'attività cellulare. Gli omeri sperimentali e bolliti sono stati quindi incubati con 4μCi/mL L-[2,3,4-3 H]-arginina radiomarcati per un massimo di 2 ore. L'assorbimento di arginina è aumentato in modo lineare nel corso di questo esperimento (Figura 3A). Per confronto, l'omeri bollito non ha mostrato un aumento dinamico dell'assorbimento di arginina in questo esperimento, ma piuttosto aveva una radioattività basale attribuita all'adsorbimento della sonda nella matrice ossea. L'assorbimento normalizzato e corretto di arginina è mostrato nella Figura 3B.

Figura 1: Flusso di lavoro dei saggi di assorbimento degli aminoacidi radiomarcati. Panoramica schematica dei saggi di captazione aminoacidica in vitro (Protocollo I) e in ossa ex vivo (Protocollo II). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Proprietà cinetiche dell'assorbimento di L-[3,4-3 H]-glutammina in ST2 in vitro. (A) Saggi di assorbimento di L-[3,4-3 H]-glutammina eseguiti in presenza (+) o assenza (-) di sodio (Na+), MeAIB o litio (Li+) nelle cellule ST2. (B) Percentuale dei contributi stimati del sistema A, N, L o ASC e γ + L all'assorbimento di glutammina. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Assorbimento ex vivo di L-[2,3,4-3 H]-arginina negli omeri neonatali. (A) Assorbimento di L-[2,3,4-3 H]-arginina eseguito nel corso di un tempo di 2 ore in umeri vivi e bolliti isolati da topi C57BL/6 di 3giorni. (B) Assorbimento normalizzato di L-[2,3,4-3 H]-arginina con umeri bolliti. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Gli autori non hanno rivelazioni.