Articolo metodologico

Valutazione del consumo di aminoacidi in cellule ossee in coltura e alberi ossei isolati

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DOI:

10.3791/62995

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13 aprile 2022

 , 
1Department of Internal Medicine, University of Texas Southwestern Medical Center, 2Charles and Jane Pak Center for Mineral Metabolism and Clinical Research, University of Texas Southwestern Medical Center

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo presenta un saggio di assorbimento di aminoacidi radiomarcato, utile per valutare il consumo di aminoacidi sia nelle cellule primarie che nelle ossa isolate.

Abstract

Lo sviluppo osseo e l'omeostasi dipendono dalla differenziazione e dall'attività degli osteoblasti che formano l'osso. La differenziazione degli osteoblasti è caratterizzata sequenzialmente dalla proliferazione seguita dalla sintesi proteica e, infine, dalla secrezione della matrice ossea. La proliferazione e la sintesi proteica richiedono un costante apporto di aminoacidi. Nonostante questo, si sa molto poco sul consumo di aminoacidi negli osteoblasti. Qui descriviamo un protocollo molto sensibile progettato per misurare il consumo di aminoacidi utilizzando aminoacidi radiomarcati. Questo metodo è ottimizzato per quantificare i cambiamenti nell'assorbimento degli aminoacidi associati alla proliferazione o alla differenziazione degli osteoblasti, ai trattamenti farmacologici o dei fattori di crescita o a varie manipolazioni genetiche. È importante sottolineare che questo metodo può essere utilizzato in modo intercambiabile per quantificare il consumo di aminoacidi in linee cellulari in coltura o cellule primarie in vitro o in alberi ossei isolati ex vivo. Infine, il nostro metodo può essere facilmente adattato per misurare il trasporto di uno qualsiasi degli amminoacidi, nonché del glucosio e di altri nutrienti radiomarcati.

Introduzione

Gli amminoacidi sono composti organici che contengono un gruppo funzionale amminico (-NH2) e carbossilico (-COOH) con una catena laterale variabile specifica per ciascun amminoacido. In generale, gli amminoacidi sono ben noti come costituenti di base delle proteine. Più recentemente, sono stati chiariti nuovi usi e funzioni degli amminoacidi. Ad esempio, i singoli amminoacidi possono essere metabolizzati per generare metaboliti intermedi che contribuiscono alla bioenergetica, funzionano come cofattori enzimatici, regolano le specie reattive dell'ossigeno o sono usati per sintetizzare altri amminoacidi 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Molti studi dimostrano che il metabolismo degli aminoacidi è fondamentale per la pluripotenza, la proliferazione e la differenziazione cellulare in vari contesti 3,6,11,12,13,14,15,16,17.

Gli osteoblasti sono cellule secretorie che producono e secernono la matrice ossea extracellulare ricca di collagene di tipo 1. Per sostenere alti tassi di sintesi proteica durante la formazione ossea, gli osteoblasti richiedono un apporto costante di aminoacidi. Per soddisfare questa domanda, gli osteoblasti devono acquisire attivamente aminoacidi. Coerentemente con questo, studi recenti rivelano l'importanza dell'assorbimento e del metabolismo degli aminoacidi nell'attività degli osteoblasti e nella formazione ossea 15,16,17,18,19,20.

Gli osteoblasti acquisiscono aminoacidi cellulari da tre fonti principali: ambiente extracellulare, degradazione intracellulare delle proteine e biosintesi de novo degli aminoacidi. Questo protocollo si concentrerà sulla valutazione dell'assorbimento di aminoacidi dall'ambiente extracellulare. I metodi più comuni per misurare l'assorbimento di aminoacidi si basano su amminoacidi radiomarcati (ad esempio, 3H o 14C) o marcati con isotopi pesanti (ad esempio, 13C). I saggi di isotopomeri pesanti possono analizzare l'assorbimento degli amminoacidi e il metabolismo in modo più approfondito e sicuro, ma richiedono più tempo e richiedono più giorni per essere completati poiché ci vuole un giorno per preparare e derivatizzare i campioni e più giorni per analizzare sullo spettrometro di massa a seconda del numero di campioni21,22. In confronto, i saggi di assorbimento degli aminoacidi radiomarcati non sono informativi sul metabolismo a valle, ma sono economici e relativamente veloci, potendo essere completati entro 2-3 ore dall'inizio dell'esperimento23,24. Qui, descriviamo un protocollo di base facilmente modificabile progettato per valutare l'assorbimento di aminoacidi radiomarcati in cellule primarie in coltura o linee cellulari in vitro o singoli alberi ossei ex vivo. L'applicazione di questi due protocolli può essere estesa ad altri aminoacidi radiomarcati e ad altri tipi cellulari e tessuti associati all'osso.

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Protocollo

Tutte le procedure sui topi descritte nel presente documento sono state approvate dai comitati di studi sugli animali presso l'Università del Texas Southwestern Medical Center di Dallas. Il protocollo sulle radiazioni è stato approvato dal Comitato consultivo per la sicurezza delle radiazioni presso l'Università del Texas Southwestern Medical Center di Dallas.

1. Assorbimento di aminoacidi nelle cellule (Protocollo I)

  1. Piastra 5 x 104 cellule ST2 in ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 12 pozzetti. Cellule di piastra in α-MEM contenenti 10% FBS, 100 U/mL di penicillina e 0,1 μg/mL di streptomicina (Pen/Strep). Piastra extra pozzetti di cellule per quantificare il numero di celle per condizione per le normalizzazioni nel passaggio 1.12. Incubare le cellule in un incubatore di coltura cellulare umidificata a 37 °C con il 5% di CO2.
  2. Coltiva le cellule per 2-3 giorni fino a quando non sono confluenti.
  3. Il giorno dell'esperimento, preparare le seguenti soluzioni: 1x soluzione salina tamponata fosfato (PBS), pH 7,4 e tampone Krebs Ringers HEPES (KRH), pH 8,0: (120 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, NaHCO3, 5 mM HEPES, 1 mM D-glucosio). Preriscaldare a 37 °C.
  4. Aspirare il mezzo e lavare le cellule due volte con 1 mL di 1x PBS, pH 7,4.
    NOTA: questo protocollo è appropriato anche per dividere rapidamente le celle non confluenti. In questo caso, è importante normalizzare la radioattività al numero assoluto di cellule o al contenuto di DNA. Inoltre, considerare di aumentare le dimensioni della piastra o del pallone di coltura per aumentare il numero complessivo di cellule e i valori di cpm. Questo è importante per determinare empiricamente su base individuale.
  5. Aspirare 1x PBS e lavare le cellule una volta con 1 mL di KRH.
  6. Produrre 4 μCi/mL di L-[3,4-3 H]-glutammina diluendo 4 μL di [1 μCi μL-1] L-[3,4-3 H]-glutammina per 1 mL di KRH.
    NOTA: Prima di utilizzare materiali radioattivi, contattare l'Ufficio per la sicurezza delle radiazioni dell'istituto di origine per ottenere le approvazioni. Tutte le procedure relative alle radiazioni devono essere eseguite dietro lo schermo in plexiglass.
  7. Incubare cellule con 0,5 mL di KRH contenenti 4 μCi/mL L-[3,4-3 H]-glutammina terreno di lavoro per 5 min.
  8. Raccogliere il mezzo radioattivo e distribuirlo nel contenitore dei rifiuti liquidi. Lavare brevemente le cellule tre volte con KRH ghiacciato per terminare la reazione. Raccogliere e gettare tutti i lavaggi nel contenitore dei rifiuti liquidi radioattivi.
  9. Aggiungere 1 mL di SDS all'1% a ciascun pozzetto e triturare 10x per lisare e omogeneizzare le cellule. Trasferire i lisati cellulari in provette da 1,5 ml. Eliminare le piastre di coltura cellulare, le pipette sierologiche e le punte delle pipette nel contenitore dei rifiuti radioattivi solidi.
  10. Centrifugare a >10.000 x g per 10 min. Trasferire i surnatanti in flaconcini di scintillazione contenenti 8 mL della soluzione di scintillazione. Mescolare agitando energicamente i flaconcini a scintillazione. Eliminare i tubi e le punte delle pipette nel contenitore dei rifiuti radioattivi solidi.
  11. Leggere la radioattività in conteggi al minuto (cpm) utilizzando un contatore di scintillazione. Gettare i flaconcini di scintillazione nel contenitore per rifiuti del flaconcino di scintillazione.
  12. Tripsinizzare, risospendere e contare le cellule dalle rimanenti piastre non radioattive di cellule (vedere il punto 1.1) per stimare il numero di cellule nelle colture radioattive lisate. Utilizzando un emocitometro, contare il numero di cellule per pozzo non radioattivo per ogni condizione sperimentale. Normalizzare il cpm dal punto 1.11 al numero stimato di cellule dalle piastre non radioattive.
  13. Dopo il completamento dell'esperimento, decontaminare la cappa di coltura cellulare, il banco e tutti gli strumenti con uno spray decontaminante alla radioattività. Infine, eseguire test di pulizia per garantire che l'area di lavoro sia priva di radiazioni.

2. Assorbimento di aminoacidi nei tessuti ossei appena isolati (Protocollo II)

  1. Preriscaldare KRH a 37 °C.
  2. Eutanasia un topo di 3 giorni e rimuovere la pelle sulle braccia. Disarticolare l'omeri dalla spalla usando le forbici e sezionare entrambi gli omeri. Rimuovere tutti i tessuti estemporanei usando un bisturi e una pinza. Rimuovere le epifisi dall'osso.
    NOTA: Oltre agli humerii, questo protocollo può essere adattato a femori, tibie e calvarie neonatali, nonché a umeri, femori e tibie isolati da topi di 2 e 4 mesi (dati non pubblicati).
  3. Eliminare il midollo dall'osso e pesare gli alberi ossei per normalizzarli nel passaggio 2.14.
  4. Far bollire un omero in 1x PBS a 100 °C per 10 minuti per decellularizzare l'osso. L'osso bollito decellularizzato viene utilizzato come controllo negativo.
    NOTA: Come controllo di qualità, la paraffina incorpora le ossa bollite e non bollite per le macchie istologiche per confermare visivamente che l'ebollizione era efficace nella decellularizzazione dell'osso.
  5. Equilibrare entrambi gli omeri in 1 mL di KRH per 30 minuti nell'incubatore per colture cellulari a 37 °C.
  6. Preparare una soluzione di lavoro di 4 μCi/mL L-[2,3,4-3 H]-arginina in KRH diluendo 4 μL di 1μCi/μL L-[2,3,4-3 H]- Arginina per 1 mL KRH.
    NOTA: Questo protocollo è appropriato per valutare l'assorbimento di qualsiasi nutriente radiomarcato sia scelto. L-[2,3,4-3 H]-glutammina, L-[14CU]-alanina e L-[2,3-3 H]-prolina sono stati testati con risultati simili. I dati di arginina sono mostrati per evidenziare l'utilità di questo protocollo.
    ATTENZIONE: Tutte le procedure che utilizzano radiazioni devono essere eseguite dietro lo schermo in plexiglass utilizzando appositi dispositivi di protezione individuale (DPI).
  7. Incubare separatamente sia l'osso di controllo sperimentale che quello bollito in KRH contenente 4 μCi/mL di L-[2,3,4-3 H]-arginina per un massimo di 90 minuti a 37 °C.
    NOTA: È importante determinare empiricamente i tempi di incubazione per diverse condizioni tra cui l'età dei topi, i diversi elementi scheletrici e i tipi di aminoacidi radiomarcati eseguendo un corso temporale. La saturazione si verifica per lo più dopo circa 3-4 ore. L'assorbimento dovrebbe essere valutato in un punto temporale nella rabbia lineare dell'assorbimento.
  8. Rimuovere il mezzo radioattivo e gettarlo nel contenitore dei rifiuti radioattivi liquidi. Lavare l'humeri tre volte usando 1 mL ghiacciato di KRH per terminare la reazione. Eliminare tutti i lavaggi nel contenitore dei rifiuti radioattivi liquidi.
  9. Trasferire ogni osso in un tubo da 1,5 ml. Aggiungere 500 μL di tampone RIPA [150 mM NaCl; 5 mM EDTA; 50 mM Tris (pH 8,0); 0,5% NP40 (v/v); 0,5% DOX (p/v); 0,1% SDS (p/v)]. Gettare le piastre di coltura, le pipette sierologiche e le punte delle pipette in un contenitore di rifiuti solidi radioattivi.
  10. Omogeneizzare gli omeri tagliando 100 volte con le forbici in un tampone RIPA.
  11. Sonicare (ampiezza: 35%, impulso 1 s) l'osso omogeneizzato risultante per 10 s.
    NOTA: La sonicazione è anche nota per produrre aerosol. Le fasi di sonicazione possono essere eseguite in un armadio di sicurezza biologica. Per ridurre la formazione di aerosol, è importante non riempire eccessivamente i tubi. La sonicazione di piccoli volumi di campioni può comportare una sonicazione incompleta o la perdita di campioni a causa della formazione di schiuma. In caso di formazione di schiuma, centrifugare il campione per 5 minuti per depositare.
  12. Chiarire il lisato mediante centrifugazione per 10 minuti a >10.000 x g a temperatura ambiente. Trasferire 200 μL del surnatante in flaconcini di scintillazione contenenti 8 mL della soluzione di scintillazione. Mescolare agitando energicamente i flaconcini a scintillazione. Gettare tutti i rifiuti radioattivi solidi (ad esempio, tubi usati, punte di pipette, piastre, ecc.) nel contenitore dei rifiuti radioattivi solidi.
  13. Leggere la radioattività (cpm) utilizzando il contatore di scintillazione. Gettare i flaconcini a scintillazione usati nel contenitore dei rifiuti radioattivi designato per i flaconcini di scintillazione.
  14. Sottrarre il cpm dell'osso bollito (valore basale) dal cpm dell'osso sperimentale. Normalizzare la radioattività con il peso osseo dal punto 2.3.
  15. Spruzzare la cappa di coltura cellulare, gli strumenti e il banco con decontaminante radioattivo. Eseguire test di pulizia per verificare che l'area di lavoro sia priva di radiazioni.

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Risultati

Il trasporto di aminoacidi è regolato da molti trasportatori di aminoacidi legati alla membrana che sono stati classificati in sistemi di trasporto distinti basati su numerose caratteristiche, tra cui la specificità del substrato, la cinetica e la dipendenza da ioni e pH25. Ad esempio, l'assorbimento di glutammina può essere mediato dai sistemi di trasporto Na+-dipendenti A, ASC, γ+L e N o dal sistema Na+-indipendente L. I sistemi Na+-dipendenti si distinguono per la capacità...

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Discussione

Il protocollo qui descritto fornisce un approccio rapido e sensibile per valutare l'assorbimento di aminoacidi in risposta a varie permutazioni sperimentali sia in vitro che ex vivo. Rispetto ai kit disponibili in commercio (ad esempio, Glutamine and Glutamate Determination Kit), questo metodo è molto più sensibile, più veloce e meno laborioso16,17,25. Nel nostro protocollo, valutiamo l'assorbimento nel buffer ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno rivelazioni.

Ringraziamenti

Il laboratorio Karner è supportato dalle sovvenzioni R01 del National Institute of Health (AR076325 e AR071967) a C.M.K.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,25% tripsinaGibco25200
Piastra a 12 pozzettiCorning3513
Siringa da 1 mL309628di precisione BD
30G Agodi precisione BD305106
Arginina Monocloridrato L-[2,3,4-3H]-, 1mCiPerkinElmerNET1123001MC
Contatore a scintillazione Beckman LS6500
Cloruro di calcioSigmaC1016
Cloruro di colinaSigmaC7077
Soluzione D-(+)-glucosioSigmaG8769
StrumentoPinze, forbici, scapel
DPBSGibco14190
Acido etilendiamminotetraaceticoSigmaE9884
HEPES(1M)Gibco15630
L-[3,4-3H(N)]-GlutamminaPerkinElmerNET551250UC
Fiale di scintilazione liquidaSigmaZ190535
Soluzione di cloruro di litio, 8MSigmaL7026
Cloruro di magnesioSigmaM8266
MEM&alfa;Gibco12561
Provetta per microcentrifuga, 15mLBiotix89511-256
NP-40Sigma492016
Cloruro di potassioSigmaP3911
Bicarbonato di sodioSigmaS6014
Cloruro di sodioSigmaS9888
Desossicolato di sodioSigmaD6750
Sodio dodecil solfatoSigma436143
SonicatorSonic& MaterialiVCX130
Tris BaseSigma648311
Ultima Gold (Soluzione di scintillazione)PerkinElmerAcido 6013329
&alfa;-(Metilammino)isobutirricoSigmaM2383
di dissezione

Riferimenti

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