Articolo metodologico

Determinazione delle concentrazioni di proteine totali e proteine bioattive nel colostro bovino

DOI:

10.3791/63001

⸱

10 dicembre 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biology and Genetics, Çanakkale Onsekiz Mart University, 2Uluova Dairy Farm, 3Department of Nutrition, University of Nevada, Reno, 4Department of Food Science and Technology, University of Nebraska, Lincoln, 5Evolve BioSystems Inc.

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il colostro bovino è sia una fonte primaria di nutrienti che un supporto immunologico per il vitello appena nato. La comprensione del livello di proteine terapeutiche (lattoferrina e IgG) è importante per il dosaggio e la standardizzazione del colostro bovino per il consumo umano.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il colostro è un fluido biologico complesso prodotto dai mammiferi subito dopo il parto. Soddisfa tutte le esigenze nutrizionali dei neonati come buona fonte di macro e micronutrienti, peptidi bioattivi e fattori di crescita. Il colostro bovino è anche una potenziale fonte di nutrimento e bioattivo grazie al suo ricco contenuto proteico che include immunoglobuline G (IgG) e lattoferrina. Tuttavia, il livello di lattoferrina e IgG nel colostro bovino cambia notevolmente durante il periodo di lattazione. Pertanto, il monitoraggio della concentrazione di IgG e lattoferrina per l'uso del colostro bovino come fonte proteica è una questione importante da studiare. I metodi in questo articolo descrivono come determinare il contenuto proteico, nonché le concentrazioni specifiche di lattoferrina e IgG. Questi metodi includono le seguenti fasi: Isolamento delle proteine del colostro bovino, Determinazione della concentrazione proteica tramite il saggio dell'acido bicinconnico (BCA), Visualizzazione delle proteine tramite SDS-PAGE, Determinazione della lattoferrina e della concentrazione di IgG utilizzando un test ELISA.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il colostro è la secrezione iniziale della ghiandola mammaria prodotta dai mammiferi poco dopo il parto. Il colostro è ricco di macro e micronutrienti, peptidi antimicrobici e fattori di crescita 1,2,3,4. La composizione varia gradualmente nel tempo durante il passaggio al latte maturo 5,6,7, ma in modo più significativo entro 24 ore dal parto8. La composizione del colostro è influenzata anche da fattori materni, tra cui età, parità, razza, salute e stato nutrizionale, nonché da fattori estrinseci, tra cui stagione, parto prematuro, lattazione prematura, fattori di manipolazione colostrale (raggruppamento del colostro e temperatura di conservazione) e induzione del parto 9,10,11. Rispetto al latte maturo, il colostro contiene meno lattosio e più grassi, proteine, peptidi, azoto non proteico, ceneri, ormoni, fattori di crescita, citochine, nucleotidi, vitamine e minerali12. Il colostro bovino contiene un'ampia gamma di proteine, tra cui immunoglobuline, lattoferrina, α-lattoalbumina (α-LA), β-lattoglobulina (β-Lg), lattoperossidasi e diversi fattori di crescita13. La concentrazione proteica totale del colostro bovino varia tra 11,26 mg/mL e 169,55 mg/mL14. Il contenuto proteico comprende siero di latte e caseina ad una concentrazione media di 124,00 mg/mL e 26,00 mg/mL, rispettivamente15. La porzione di siero di latte contiene tre tipi principali di immunoglobuline (Igs) come IgG (85%-90%), IgM (7%) e IgA (5%)16. Le principali Ig nel colostro bovino sono le IgG, che forniscono l'immunità passiva e modulano il sistema immunitario adattativo e innato nel vitello17. La concentrazione iniziale di Ig del colostro bovino da prima mungitura può variare da 20 a 200 mg/mL e diminuire a circa 0,4-1,0 mg/mL18. La concentrazione media di IgG è di circa 60 mg/mL e diminuisce costantemente fino a livelli inferiori a 1 mg/mL durante la transizione al latte maturo19.

Un'altra importante proteina bioattiva nel colostro è la lattoferrina, una glicoproteina legante il ferro con una concentrazione di 1,5-5 mg/mL. Le proprietà della lattoferrina includono il miglioramento dell'assorbimento del ferro e il possesso di attività antimicrobica20,21, legante il lipopolisaccaride, immunomodulazione e stimolante la crescita delle cellule epiteliali intestinali e dei fibroblasti22. Il colostro bovino contiene anche α-lattoalbumina e β-lattoglobulina. Queste proteine sono fonti di aminoacidi essenziali e hanno anche attività battericida 23,24,25. Le concentrazioni medie di α-LA e β-Lg nel colostro sono in media rispettivamente di 2,77 mg/mL2 e 11,5 mg/mL26. Successivamente, queste concentrazioni diminuiscono a 1-1,5 mg/mL27 e a 4,8 mg/mL26 nel latte maturo. Il colostro contiene anche una quantità significativa di lattoperossidasi (media 22,8 μg/mL) e lisozima (media 0,40 μg/mL)26. La lattoperossidasi è una glicoproteina che possiede attività antimicrobica contro i batteri Gram-positivi e negativi28 producendo specie reattive dell'ossigeno. Il lisozima funziona come agente antimicrobico scindendo il componente peptidoglicano delle pareti cellulari batteriche, portando così alla morte cellulare 29,30.

Grazie alle loro proprietà, le IgG e la lattoferrina vengono trasformate in diversi prodotti alimentari per fortificare le formule per lattanti, gli integratori alimentari, i preparati ad alto contenuto proteico per convalescenti e sportivi, nonché in farmacologia e cosmetologia 31,32,33. Il colostro bovino rappresenta un'importante fonte di IgG e lattoferrina. Tuttavia, la composizione di queste proteine bioattive nel colostro bovino cambia notevolmente durante il periodo di lattazione. Pertanto, è fondamentale monitorare i cambiamenti nella concentrazione di queste proteine bioattive nei campioni di colostro utilizzati per la ricerca e la lavorazione degli alimenti. Questo studio ha lo scopo di descrivere i metodi per monitorare la concentrazione e la composizione della proteina totale, della lattoferrina e delle IgG nel colostro bovino durante i 6 giorni successivi al parto.

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Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I campioni di colostro sono stati raccolti per 6 giorni dopo il parto a mezzogiorno nel periodo luglio-agosto, da 28 vacche da latte Holstein della Uluova Milk Trading Company di Çanakkale, in Turchia, e surgelati. I campioni raccolti lo stesso giorno sono stati raggruppati in base al giorno di ciascun campione e analizzati per le loro concentrazioni totali di proteine, lattoferrina e IgG. Tutti i campioni sono stati analizzati in duplicato.

1. Preparazione del campione

  1. Miscelare 200 μL di colostro bovino con 400 μL di dH2O per ottenere un campione diluito per l'analisi. Diluire tutti i campioni di conseguenza.
  2. Centrifugare campioni diluiti e non diluiti a 4 °C, 1000 x g per 30 min.
  3. Separare la fase centrale in un nuovo tubo etichettato in modo appropriato. Ripetere il passaggio 1.2. per ottenere una fase intermedia chiara. Conservare l'intera fase intermedia e i campioni diluiti a -20 °C, se non utilizzati immediatamente.
  4. Utilizzare la fase intermedia ottenuta da campioni diluiti per i saggi BCA, SDS-PAGE e lattoferrina. Raccogliere la fase intermedia da campioni non diluiti per il dosaggio delle IgG.
  5. Preparare le diluizioni del campione per ogni campione per assicurarsi che le letture rientrino nell'intervallo della curva standard. Diluire ciascuna fase intermedia ottenuta dai campioni diluiti a 1:300 per il test BCA e 1:30.000 per il test della lattoferrina e diluire ciascuna fase intermedia ottenuta da campioni non diluiti a 1:400.000 per il test IgG.
    NOTA: I fattori di diluizione sono determinati in base al valore di assorbanza e alla curva standard.

2. Determinare la concentrazione proteica utilizzando il kit per il dosaggio delle proteine BCA

  1. Preparazione di standard e reagenti
    1. Utilizzare i reagenti forniti nel kit disponibile in commercio (vedere la Tabella dei materiali) da utilizzare per il saggio: reagente BCA A, contenente carbonato di sodio, bicarbonato di sodio, acido bicinconnico e tartrato di sodio in idrossido di sodio 0,1 M. Il reagente BCA B contiene il 4% di solfato rameico. Albumina (BSA) standard, contiene albumina sierica bovina a 2,0 mg/mL in soluzione fisiologica allo 0,9% e azoturo di sodio allo 0,05%.
    2. Equilibrare tutti i campioni e gli standard proteici a temperatura ambiente (RT).
    3. Preparare volumi sufficienti di reagente di lavoro (WR) miscelando il rapporto 50:1 del reagente A:B. Sono necessari 200 μl di WR per ogni campione e standard.
    4. Preparare gli standard di albumina diluita (BSA) secondo il seguente schema di diluizione (Tabella 1), che presenta un intervallo di lavoro compreso tra 20 e 2.000 μg/mL di concentrazione finale di BSA. Utilizzare dH2O come diluente.

Tabella 1: Schema di diluizione degli standard BSA.

FialaVolume di diluente (μL)Volume e fonte di BSA (μL)Concentrazione finale BSA (μg/mL)
Un0300 μl di brodo2000
B125375 μL di brodo1500
C325325 μL di brodo1000
D175175 di flaconcino B diluito750
E325325 di flaconcino di diluizione C500
F325325 di flaconcino di diluizione E250
G325325 di flaconcino di diluizione F125
H400100 di flaconcino di diluizione G25
Io40000 = Vuoto
  1. Procedura di dosaggio del BCA
    1. Trasferire 25 μl di ogni standard o campione BCA in una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 200 μl di WR a ciascun pozzetto contenente standard o campione. Mescolare accuratamente la piastra su uno shaker per 30 s.
    2. Coprire la piastra con un sigillante per piastre e incubare a 37 °C per 30 minuti. Dopo l'incubazione, lasciare che le reazioni si equilibrino in RT per circa 10 minuti. Leggere ogni piastra a 562 nm utilizzando un lettore di micropiastre con il relativo software associato.
  2. Generazione della curva standard e determinazione dei risultati
    1. Registrare i valori di assorbanza per gli standard e i campioni. Si prega di consultare la Tabella 1 per la serie di diluizione. Sottrarre i valori di assorbanza del bianco standard da ciascun valore di assorbanza degli standard e del campione. Fare la media delle letture duplicate per ogni standard e campione per stimare la concentrazione proteica totale.
    2. Costruisci una curva standard tracciando l'assorbanza media corretta per ogni standard sull'asse x e la concentrazione sull'asse y. Disegna una curva lineare con il software appropriato in grado di eseguire l'adattamento della curva a quattro parametri.
    3. Utilizzare la curva standard per determinare la concentrazione di ciascun campione interpolando la sua risposta alla concentrazione. Moltiplicare per il fattore di diluizione (passaggio 1.5) per ottenere la concentrazione effettiva del campione.

3. Visualizzazione delle proteine mediante saggio SDS-PAGE

  1. Preparazione del campione e delle soluzioni
    1. Preparare le soluzioni stock
      1. Preparare una soluzione di SDS al 10% (p/v), Tris-HCl 1,5 M pH 8,3, Tris-HCl 0,5 M pH 6,8, soluzione di persolfato di ammonio (APS) al 10% (p/v) (preparare fresco).
      2. (w/v) SDS: Pesare 1 g di SDS e aggiungere 10 mL di dH2O.
      3. M Tris-HCl pH 8,8: Pesare 18,15 g di Tris e sciogliere con ~60 mL di dH2O. Regolare a pH 8,8 con HCl. Aggiungere dH2O per portare il volume a 100 mL.
      4. M Tris-HCl pH 6,8: Pesare 6,00 g di Tris e sciogliere con ~60 mL di dH2O. Regolare a pH 6,8 con HCl. Aggiungere dH2O per portare il volume a 100 mL.
      5. APS: Pesare 15 mg di APS e aggiungere 150 μL di dH2O.
        ATTENZIONE: L'acrilammide e la SDS sono tossiche e dannose. Indossare guanti protettivi e lavorare sotto il cappuccio.
    2. Preparare il tampone del campione aggiungendo 50 μl di β-mercaptoetanolo a 950 μl di tampone del campione 2x SDS-PAGE.
      ATTENZIONE: β-mercaptoetanolo è tossico se inalato. Indossare guanti protettivi e lavorare sotto il cappuccio.
    3. Preparare il tampone di corsa mescolando 100 mL di 10x Tris-glycine SDS Running Buffer con 900 mL di dH2O.
    4. Preparare la soluzione colorante (45% dH2O, 45% metanolo, 10% acido acetico glaciale, 2 g di Coomassie Brilliant Blue R).
    5. Preparare la soluzione decolorante (50% dH2O, 40% metanolo, 10% acido acetico glaciale).
  2. Preparazione del gel
    1. Preparare l'attrezzatura dell'unità di elettroforesi, compresa la cassetta del gel, gli alimentatori, gli elettrodi e i cavi per il test. Pulire le lastre di vetro con etanolo e assemblare il panino. Assicurarsi che i bordi inferiori delle lastre di vetro e dei distanziatori siano ben allineati.
    2. Preparare la miscela di gel separatore contenente 3,5 mL di dH2O, 2,4 mL di acrilammide/metilene bis acrilammide, 2 mL di 1,5M Tris-HCl, 100 μL di SDS al 10% (p/v), 80 μL di APS al 10%, 8 μL di N,N,N',N'-Tetrametil etilendiammina (TEMED).
      ATTENZIONE: TEMED è tossico e/o irritante. Indossare guanti protettivi e lavorare sotto il cappuccio.
    3. Versare la miscela di gel separatore nelle piastre di gel a un livello di circa 1-1,5 cm sotto la parte superiore della piastra più corta.
    4. Stratificare la parte superiore del gel separatore con isopropanolo per rimuovere le bolle nella parte superiore del gel ed evitare che il gel polimerizzato si secchi.
    5. Versare l'isopropanolo sopra il gel separatore dopo che il gel separatore si è polimerizzato per almeno 15 minuti.
    6. Preparare la miscela di gel da impilare contenente 1,92 mL di dH2O, 300 μL di acrilammide al 40%, metilene bis acrilammide, 750 μL di Tris-HCl 0,5M, 100 μL di SDS al 10% (p/v), 30 μL di APS al 10% e 3 μL di TEMED.
    7. Versare la soluzione di gel di impilamento sopra il gel di separazione in modo che le piastre di gel siano riempite. Inserire il pettine nella parte superiore dei distanziatori.
    8. Lasciare polimerizzare il gel da impilare a temperatura ambiente per circa 15 minuti.
  3. Esecuzione del gel
    1. Collegare il gel al gruppo elettrodo. Aggiungere 1x Tris-glycine SDS Running Buffer appena preparato in entrambe le camere dell'apparato.
    2. Rimuovere il pettine.
    3. Caricare 5 μL della scala (10-250 kDa) e 8 μL della fase intermedia dei campioni diluiti nei pozzetti del gel. Far scorrere il gel a 80 V fino a quando il colorante non migra nel gel separatore e aumentare a 120 V fino a quando il colorante raggiunge il fondo del gel. Spegnere la potenza applicata dopo che il colorante ha raggiunto il fondo del gel.
  4. Colorazione e decolorazione del gel
    1. Rimuovere il gel dall'apparecchio una volta completata la corsa e rimuovere i distanziatori e le piastre di vetro. Metti il gel in un piccolo vassoio.
    2. Colorare il gel aggiungendo una soluzione colorante (passaggio 3.1.4) per 30 minuti agitando delicatamente a 55 giri/min.
    3. Versare la soluzione colorante dal gel. Sciacquare il gel con una piccola quantità di soluzione decolorante e scartare il colorante.
    4. Aggiungere un volume sufficiente di soluzione decolorante per coprire il gel e stendere agitando delicatamente per ~1 ora fino a quando le bande sono visibili.

4. Concentrazione di lattoferrina utilizzando un ELISA di lattoferrina bovina

  1. Preparazione di standard e reagenti
    1. Per questo test utilizzare il kit ELISA Bovine LF/LTF/Lattoferrina, disponibile in commercio.
    2. Equilibra tutti i campioni e gli standard in base alla RT.
    3. Preparare volumi sufficienti di reagente di rilevazione A e B Soluzione di lavoro responsabili del legame con l'antigene catturato.
    4. Diluire i reagenti di rivelazione A e B in un rapporto di 1:100 utilizzando rispettivamente i diluenti per saggi A e B.
    5. Preparare un tampone di lavaggio 1x funzionante diluendo il concentrato di tampone di lavaggio 30x con dH2O.
    6. Mettere una quantità sufficiente di soluzione di substrato di 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina (TMB) in una microprovetta sterile.
    7. Risospendere una provetta di standard liofilizzato (100 ng/mL) con 0,5 mL di diluente campione e incubare a RT per 10 minuti agitando delicatamente. Girare la fiala per assicurarsi che tutto il sanple liofilizzato sia raccolto sul fondo.
    8. Preparare una serie di diluizioni standard secondo il seguente schema di diluizione (Tabella 2).

Tabella 2: Schema di diluizione degli standard di lattoferrina bovina.

FialaVolume di diluente (μL)Volume e fonte di Lf (μL)Concentrazione finale di Lf (ng/mL)
D10500 μL di brodo100
D2250250 di flaconcino di diluizione D150
D3250250 di flaconcino di diluizione D225
D4250250 di flaconcino di diluizione D312.5
D5250250 di flaconcino di diluizione D46.25
D6250250 di flaconcino di diluizione D53,125
D7250250 di flaconcino di diluizione D61,563
D825000 = Vuoto
  1. Misurazione della concentrazione di lattoferrina bovina
    1. Pipettare 100 μl di ogni standard o campione di lattoferrina nella piastra a 96 pozzetti rivestita. Coprire la piastra con un sigillante per piastre per evitare l'evaporazione. Incubare a 37 °C per 1 ora.
    2. Aspirare il liquido di ogni pozzetto. Aggiungere 100 μl del reagente di rilevazione A soluzione di lavoro a ciascun pozzetto. Coprire con un sigillante per piastre e agitare delicatamente per garantire una miscelazione accurata. Incubare a 37 °C per 1 ora.
    3. Lavare tre volte aggiungendo circa 350 μl di tampone di lavaggio 1x dopo aver aspirato il liquido da ciascun pozzetto. Lasciare riposare ogni lavaggio per 1-2 minuti prima di aspirare completamente. Dopo l'ultimo lavaggio, aspirare per rimuovere eventuali residui di tampone di lavaggio, quindi capovolgere la piastra e picchiettare su una carta assorbente pulita.
    4. Aggiungere 100 μl della soluzione di lavoro del reagente di rivelazione B a ciascun pozzetto. Coprire con un nuovo sigillante per piastre. Incubare a 37 °C per 30 min. Aspirare il liquido da ogni pozzetto e lavarlo cinque volte come descritto al punto 4.2.3. Mettere 90 μl di soluzione di substrato TMB in ciascun pozzetto e coprire con un nuovo sigillante per piastre.
    5. Incubare a 37 °C per 10-20 min al riparo dalla luce. Controllare il colore ottimale monitorando periodicamente. Si noti che il colore blu intenso nel pozzetto include un'alta concentrazione di lattoferrina.
    6. Aggiungere 50 μL di soluzione di arresto a ciascun pozzetto. Il colore cambierà da blu a giallo. Misurare immediatamente l'assorbanza di ciascun pozzetto a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre con il relativo software associato.
      NOTA: Picchiettare delicatamente la piastra per garantire una miscelazione accurata fino a quando il cambiamento di colore non è uniforme.
  2. Generazione della curva standard e determinazione dei risultati
    1. Seguire il passaggio 2.3.1 per la generazione dei dati per stimare la concentrazione di lattoferrina.
    2. Costruire una curva standard tracciando l'assorbanza media corretta per ogni standard come descritto nel passaggio 2.3.2 ma disegnando una curva polinomiale con un software appropriato in grado di eseguire l'adattamento della curva a quattro parametri.
    3. Calcolare il contenuto di lattoferrina di ciascun campione interpolando il valore di assorbimento nell'equazione generata come descritto al punto 2.3.3.

5. Determinazione della concentrazione di IgG di campioni mediante ELISA di IgG bovine

  1. Preparazione di standard e reagenti
    1. Utilizzare gli elementi richiesti tra quelli forniti nel kit ELISA IgG bovino.
    2. Equilibra tutti i campioni e gli standard in base alla RT.
    3. Preparare volumi sufficienti di soluzione di lavoro di coniugato enzima-anticorpo diluendo 10 μl di concentrato di perossidasi di rafano (HRP)-avidina (100x) con 990 μl di diluente coniugato enzima-anticorpo.
    4. Preparare volumi sufficienti di 1x tampone di lavaggio diluendo 20x concentrato di tampone di lavaggio con dH2O.
    5. Preparare volumi sufficienti della soluzione diluente 1x diluendo il concentrato diluente 20x con dH2O.
    6. Aggiungere 1,0 mL di dH2O al calibratore di IgG bovine e mescolare delicatamente fino a quando non si sarà sciolto. La concentrazione finale del calibratore è di 123.000 ng/mL.
    7. Preparare una serie di diluizioni standard secondo lo schema di diluizione descritto nella tabella 3.

Tabella 3: Schema di diluizione degli standard di IgG bovini.

FialaVolume di diluente (μL)Volume e fonte di IgG (μL)Concentrazione finale di IgG (ng/mL)
D1900100 μL di brodo12300
D2900100 di flaconcino di diluizione D11230
D3178122 di flaconcino di diluizione D2500
D415050 di flaconcino di diluizione D3250
D5150150 di flaconcino di diluizione D4125
D6100100 di flaconcino di diluizione D562.5
D7100100 di flaconcino di diluizione D631.25
D8100100 di flaconcino di diluizione D715,625
D9100100 di flaconcino di diluizione D87,813
D1010000 = Vuoto
  1. Procedura di test ELISA delle IgG bovine
    1. Pipettare 100 μl di ogni standard o campione di IgG nella piastra a 96 pozzetti rivestita. Coprire la piastra con un sigillante per piastre e incubare a RT per 30 minuti. Aspirare il liquido da ogni pozzetto.
    2. Lavare quattro volte riempiendo i pozzetti con 1x tampone di lavaggio e aspirare. Dopo l'ultimo lavaggio, aspirare per rimuovere eventuali residui di tampone di lavaggio, quindi capovolgere la piastra e picchiettare contro la carta assorbente pulita. Aggiungere 100 μl di coniugato enzima-anticorpo opportunamente diluito a ciascun pozzetto. Coprire con un sigillante per piastre e agitare delicatamente per garantire una miscelazione accurata.
    3. Incubare a RT per 10 min. Lavare e rimuovere il tampone di lavaggio residuo dai pozzetti come descritto al punto 5.2.2. Aggiungere 100 μl di substrato TMB a ciascun pozzetto; Coprire con un nuovo sigillante per piastre.
    4. Incubare a RT per esattamente 10 minuti lontano dalla luce. Arrestare la reazione aggiungendo 100 μL di soluzione di arresto a ciascun pozzetto. Leggere ogni piastra a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre con il relativo software associato.
  2. Generazione della curva standard e determinazione dei risultati
    1. Seguire il passaggio 2.3.1 per l'edizione dei dati per stimare la concentrazione di IgG.
    2. Costruisci una curva standard tracciando la concentrazione sull'asse x e l'assorbanza media corretta per ogni standard sull'asse y. Disegna una curva polinomiale con un software appropriato in grado di eseguire l'adattamento della curva a quattro parametri.
    3. Calcolare il contenuto di IgG di ciascun campione interpolando il valore di assorbimento sull'equazione generata come descritto al punto 2.3.3.

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Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Seguendo il protocollo, i campioni di colostro bovino sono stati analizzati per determinare la concentrazione di proteine, lattoferrina e IgG. I risultati delle analisi delle proteine, della lattoferrina e delle IgG del colostro bovino sono mostrati nella Tabella 4.

Tabella 4: Concentrazione di proteine, lattoferrina e IgG del colostro bovino.

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio fornisce informazioni su notevoli cambiamenti nelle concentrazioni di proteine, lattoferrina e IgG nel colostro durante la transizione al latte maturo. Il rilevamento dei cambiamenti nella concentrazione di lattoferrina e IgG è stato effettuato mediante ELISA a sandwich e la concentrazione totale di proteine è stata analizzata mediante il test BCA. I risultati indicano che il colostro precoce ha la più alta concentrazione di proteine, lattoferrina e IgG, che successivamente...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio è supportato da Uluova Süt Ticaret A.Ş (Uluova Milk Trading Co.). RMD e BMH sono dipendenti di Evolve BioSystems, un'azienda focalizzata sul ripristino del microbioma infantile.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Tampone di corsa 10X (Tris-Glicina-SDS)ClearBandTGS10Analisi SDS-Page
2-mercaptoetanologibco31350-010Analisi SDS-Page
Acido acetico GLACIALIsolab901,013,2500SDS-Page
Analisi IgG bovino Kit ELISAAviva SystemsOKIA00005Determinazione della concentrazione di IgG
LF bovino / Kit ELISA LTF / LattoferrinaLSBio Lifespan BiosciencesLS-F4884Determinazione della concentrazione di lattoferrina
Coomassie Brillant Blue R 250amresco0472-25GAnalisi SDS-Page
Acido cloridrico Fuming 37%Isolab932,103,2501Analisi SDS-Page
IsopropanoloIsolab961,023,2500Analisi SDS-Page
Campione Laemmli Tampone (2X)ClearBandLSB-2xAnalisi SDS-Page
MetanoloIsolab947,046,2500Analisi SDS-Page
PagePageRuler Plus Prestained Protein Ladder Da 10 a 250Thermo Scientific26619Analisi SDS-Page
Pierce Kit per il dosaggio delle proteine BCAThermo Scientific23225Determinazione della concentrazione proteica
Dodecil solfato di sodio (SDS)BioShopSDS001.500Analisi SDS-Page
SureCast Soluzione di acrilammide 40% (p/v)InvitrogenHC2040Analisi SDS-Page
SureCast Persolfato di ammonio (APS)Thermo Scientific17874Analisi SDS-Page
SureCast Tetrametiletilendiammina (TEMED)InvitrogenHC2006Analisi SDS-Page
Lettore di piastre TECAN Infinite M200Tecan30035094Misurazione dell'assorbanza
Tris baseBioShopTRS001.1Analisi SDS-Page

Riferimenti

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