Articolo metodologico

Rilevamento Indel a seguito della mutagenesi CRISPR/Cas9 mediante analisi della fusione ad alta risoluzione nell'aegittito di Mosquito Aedes

DOI:

10.3791/63008

⸱

10 settembre 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology and Agrilife Research, Texas A&M University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo articolo descrive in dettaglio un protocollo per la rapida identificazione degli indel indotti da CRISPR / Cas9 e la selezione delle linee mutanti nella zanzara Aedes aegypti utilizzando l'analisi del fuso ad alta risoluzione.

Abstract

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L'editing genetico delle zanzare è diventato di routine in diversi laboratori con la creazione di sistemi come le nucleasi effettori simili a stimolatori di trascrizione (TALEN), le nucleasi a dita di zinco (ZFN) e le endonucleasi di homing (HE). Più recentemente, la tecnologia CRISPR (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) aggregolate regolarmente intervallate ha offerto un'alternativa più semplice ed economica per l'ingegneria del genoma di precisione. Seguendo l'azione della nucleasi, i percorsi di riparazione del DNA risolveranno le estremità del DNA rotte, spesso introducendo indel. Queste mutazioni fuori dal quadro vengono quindi utilizzate per comprendere la funzione genica negli organismi bersaglio. Uno svantaggio, tuttavia, è che gli individui mutanti non portano marcatori dominanti, rendendo difficile l'identificazione e il tracciamento degli alleli mutanti, specialmente alle scale necessarie per molti esperimenti.

L'analisi della fusione ad alta risoluzione (HRMA) è un metodo semplice per identificare le variazioni nelle sequenze di acidi nucleici e utilizza le curve di fusione pcr per rilevare tali variazioni. Questo metodo di analisi post-PCR utilizza coloranti fluorescenti a doppio filamento che legano il DNA con strumentazione che ha capacità di acquisizione dei dati di controllo della rampa di temperatura ed è facilmente scalabile a formati di piastre a 96 pozzetti. Qui è descritto un semplice flusso di lavoro che utilizza HRMA per il rilevamento rapido di indel indotti da CRISPR / Cas9 e la creazione di linee mutanti nella zanzara Ae. aegypti. Criticamente, tutti i passaggi possono essere eseguiti con una piccola quantità di tessuto delle gambe e non richiedono il sacrificio dell'organismo, consentendo l'esecuzione di incroci genetici o saggi di fenotipizzazione dopo la genotipizzazione.

Introduzione

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Come vettori di agenti patogeni come i virus dengue1, Zika2 e chikungunya3, nonché i parassiti malarici4, le zanzare rappresentano una significativa minaccia per la salute pubblica umana. Per tutte queste malattie, c'è un focus sostanziale dell'intervento di trasmissione sul controllo dei vettori di zanzare. Lo studio dei geni importanti, ad esempio, per il permissivismo nei confronti degli agenti patogeni, la forma fisica delle zanzare, la sopravvivenza, la riproduzione e la resistenza agli insetticidi è fondamentale per lo sviluppo di nuove strategie di controllo delle zanzare. Per tali scopi, l'editing del genoma nelle zanzare sta diventando una pratica comune, specialmente con lo sviluppo di tecnologie come HEs, ZFN, TALEN e, più recentemente, CRISPR con Cas9. La creazione di ceppi geneticamente modificati comporta tipicamente il backcrossing di individui portatori delle mutazioni desiderate per alcune generazioni per ridurre al minimo gli effetti off-target e founder (collo di bottiglia), seguiti dall'incrocio di individui eterozigoti per generare linee omozigoti o trans-eterozigoti. In assenza di un marcatore dominante, la genotipizzazione molecolare è necessaria in questo processo perché, in molti casi, non è possibile rilevare tratti fenotipici chiari per i mutanti eterozigoti.

Sebbene il sequenziamento sia il gold standard per la caratterizzazione genotipica, l'esecuzione di questo su centinaia, o forse migliaia di individui, pone costi significativi, manodopera e tempo necessari per ottenere risultati, il che è particolarmente critico per gli organismi con una vita breve come le zanzare. Le alternative comunemente utilizzate sono surveyor nuclease assay5 (SNA), T7E1 assay6 e analisi della fusione ad alta risoluzione (HRMA, recensito in7). Sia SNA che T7E1 utilizzano endonucleasi che scindere solo basi non corrispondenti. Quando una regione mutata del genoma mutante eterozigote viene amplificata, i frammenti di DNA di alleli mutanti e wild-type vengono ricotti per produrre DNA a doppio filamento (dsDNA) non corrispondente. SNA rileva la presenza di disallineamenti attraverso la digestione con un'endonucleasi specifica per la mancata corrispondenza e una semplice elettroforesi su gel di agarosio. In alternativa, HRMA utilizza le proprietà termodinamiche del dsDNA rilevate dai coloranti fluorescenti leganti il dsDNA, con la temperatura di dissociazione del colorante che varia in base alla presenza e al tipo di mutazione. HRMA è stato utilizzato per il rilevamento di polimorfismi a singolo nucleotide (SNP)8, genotipizzazione mutante di pesci zebra9, applicazioni microbiologiche10 e ricerca genetica vegetale11, tra gli altri.

Questo articolo descrive l'HRMA, un semplice metodo di genotipizzazione molecolare per le zanzare mutanti generato dalla tecnologia CRISPR/Cas9. I vantaggi dell'HRMA rispetto alle tecniche alternative includono 1) flessibilità, in quanto si è dimostrato utile per vari geni, una vasta gamma di dimensioni indel, nonché la distinzione tra diverse dimensioni indel e differenziazione eterozigote, omozigote e trans-eterozigote12,13,14, 2) costo, in quanto si basa su reagenti PCR comunemente usati e 3) risparmio di tempo, in quanto può essere eseguito in poche ore. Inoltre, il protocollo utilizza una piccola parte del corpo (una gamba) come fonte di DNA, consentendo alla zanzara di sopravvivere al processo di genotipizzazione, consentendo la creazione e il mantenimento di linee mutanti.

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Protocollo

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1. Scansione per polimorfismi a singolo nucleotide (SNP), progettazione di primer HRMA e convalida del primer

  1. Identificazione SNP nelle zanzare selvatiche delle colonie di laboratorio
    1. Selezionare l'esone bersaglio per interrompere la corretta traduzione polipeptidica.
      NOTA: il bersaglio deve essere vicino al codone iniziale o tra i residui chiave necessari per la funzione proteica. Più corto è l'esone (ad esempio, ≤200 basi), più difficile è il target e l'analisi. Evita di modificare vicino ai confini di un esone, poiché ciò costringe uno dei primer HRMA ad attraversare un introne o a trovarsi in un introne. Ciò è indesiderabile perché i tassi SNP tendono ad essere molto maggiori in quelle regioni.
    2. Design del primer
      1. Vai al sito web NCBI Blast - Primer Blast15, copia e incolla l'esone scelto nella casella nella parte superiore della pagina | scegliere la dimensione del prodotto PCR (assicurarsi che comprenda la maggior parte dell'esone) | scegli l'organismo.
      2. Fare clic su Parametri avanzati | Optare (per PCR Product Tm) e aggiungere 60 (per una temperatura ottimale di 60 °C) | Ottieni primer. Mantenere gli altri parametri come predefiniti.
    3. Ottenere DNA genomico (gDNA) dalla colonia di laboratorio wild-type. Metti da parte 10 zanzare, anestetizzale con CO2 e mettile in una capsula di Petri sul ghiaccio per tenerle inattive. Impostare 10 provette contenenti 0,5 μL del reagente per il rilascio di DNA dai tessuti e 20 μL di tampone di diluizione, entrambe fornite nel kit di rilascio del DNA suggerito nella Tabella dei materiali.
    4. Rimuovere una gamba da una singola zanzara usando una pinza e posizionarla in un tubo corrispondente di una soluzione diluita del reagente di rilascio del DNA (dal passaggio 1.1.3), immergendo completamente la gamba nella soluzione. Ripeti questo passaggio con le zanzare rimanenti, pulendo la pinza con il 70% di etanolo prima di procedere a quello successivo.
    5. Incubare la soluzione contenente la gamba a temperatura ambiente per 2-5 minuti, quindi a 98 °C per 2 minuti e lasciarla raffreddare durante l'impostazione della reazione PCR.
      NOTA: le piastre contenenti il gDNA rilasciato possono essere conservate a -20 °C e il protocollo può essere messo in pausa a questo punto.
    6. Preparare 10 provette contenenti 10 μL di 2x PCR Master Mix, primer a una concentrazione finale di 0,5 μM e acqua di grado molecolare a un volume finale di 20 μL e trasferire 1 μL del campione diluito a ciascun tubo. Eseguire la PCR seguendo questi parametri ciclici: 98 °C 5 min, 40 cicli di 98 °C per 5 s, 60 °C 30 s, 72 °C 20 s per kb; estensione finale di 72 °C per 1 min.
    7. Purificare i prodotti PCR con un enzima per degradare i primer PCR residui e defosforilare i dNTP in eccesso o qualsiasi kit di pulizia della colonna. Procedere con il sequenziamento dei campioni.
    8. Analizzare ogni elettroferogramma per la presenza di doppi picchi / basi ambigue e regolare manualmente le chiamate di base in ogni sequenza utilizzando il codice di base degenerato appropriato.
      NOTA: questo passaggio deve essere eseguito prima dell'allineamento di più sequenze in quanto è comune per il software di chiamata di base selezionare il picco più prominente come chiamata di base "vera", dando la falsa impressione di un'assenza di SNP.
    9. Eseguire un allineamento di sequenze multiple utilizzando il software di allineamento, SeqMan Pro, elencato nella Tabella dei materiali o altri software di allineamento open source, come ClustalW16 o T-Coffee17.
      1. Aprire il software di allineamento | clicca su Aggiungi sequenze | selezionare le sequenze desiderate e cliccare su Aggiungi | una volta scelte tutte le sequenze, clicca su Fine.
      2. Fate clic su Assembla (Assemble) per eseguire l'allineamento. Per aprire l'allineamento, fare clic su Contig 1 e analizzare l'allineamento e identificare gli SNP (Figura 1).
        NOTA: In alternativa ai passaggi 1.1.3-1.1.6, la PCR può essere eseguita da DNA genomico isolato ottenuto da campioni di massa (derivati da >10 individui). Gli ampliconi sequenziati possono essere analizzati direttamente per la presenza di SNP che appaiono come doppi picchi nell'elettroferogramma, anche se gli SNP rari saranno più difficili da rilevare.
    10. Progettare 3-5 RNA a guida singola (sgRNA), evitando regioni contenenti qualsiasi SNP sopra identificato, seguendo il protocollo descritto in18.
  2. Progettazione del primer HRMA
    1. Testare la sequenza esonica per la possibile formazione di strutture secondarie durante la PCR utilizzando mFold19.
      1. Passare al | server Web UNAFold clicca su mFold | nel menu a discesa, fai clic su Applicazioni | Forma pieghevole del DNA.
      2. Immettere il nome della sequenza nella casella e incollare l'esone.
      3. Modificare la temperatura di piegatura a 60 °C; sulle condizioni ioniche, cambiare [Mg++] in 1,5 e su Unità passare a mM; clicca su Fold DNA.
      4. In Output, sotto la Struttura 1, fare clic su pdf per aprire i Grafici a struttura circolare.
    2. Vai a NCBI Blast - Primer Blast15 per la progettazione del primer.
    3. Copiare e incollare la sequenza di esoni selezionata determinata mediante sequenziamento nel passaggio 1.1 (la sequenza che contiene il numero più basso di SNP o nessun SNP) nella casella nella parte superiore della pagina.
    4. Utilizzare il simbolo < > per contrassegnare ed escludere sequenze che contengono SNP, il sito di destinazione e le regioni con possibile formazione di struttura secondaria.
    5. Selezionare la dimensione del prodotto PCR tra 80 e 150 bp e scegliere l'organismo.
      NOTA: è possibile utilizzare correttamente frammenti di dimensioni maggiori (~300 bp). Tuttavia, gli ampliconi più lunghi possono ridurre la sensibilità tra le sequenze che differiscono in una o solo poche coppie di basi.
    6. Fai clic su Ottieni primer. Selezionare 2-3 coppie di primer da testare (idealmente, i siti di primer sono ≥20-50 bp di distanza da qualsiasi sito target CRISPR).
  3. Convalida del primer
    1. Eseguire una PCR sfumata utilizzando il gDNA di un singolo individuo.
      1. Preparare una miscela master e rimuovere un campione per il controllo non modello (NTC) in un tubo separato. Aggiungere il modello al mix master rimanente e aliquota in una piastra a 96 pozzetti.
      2. Seguire i parametri ciclici: 98 °C 30 s, 34 cicli di 98 °C per 10 s, 55–65 °C 30 s, 72 °C 15 s; estensione finale di 72 °C per 10 min.
      3. Generare profili di fusione termica seguendo i parametri: fase di denaturazione 95 °C per 1 min, ricottura 60 °C per 1 min, rilevamento della curva di fusione tra 75 °C e 95 °C con incrementi di 0,2 °C, con un tempo di attesa di 10 s a ciascuna temperatura.
        NOTA: devono essere utilizzate solo temperature di ricottura con un singolo profilo termico di fusione.
  4. Procedere alla generazione delle linee mutanti con iniezioni di embrioni come descritto al punto 12.

2. Preparazione del DNA genomico dalle zampe di zanzara

  1. Separa le zanzare G1 per sesso nella fase pupale in modo che non si accoppiano prima della genotipizzazione e assicurati che le zanzare di controllo selvatiche abbinate all'età siano disponibili per essere utilizzate per riferimenti e backcross. Il sesso li separa allo stesso modo.
  2. Raccogliere i materiali necessari (Figura 2A) e preparare una piastra PCR a 96 pozzetti con 0,5 μL del reagente di rilascio del DNA e 20 μL di tampone di diluizione (dal kit di rilascio del gDNA) per individuo da genotipizzare (Figura 2B) e lasciarlo sul ghiaccio. Riserva due reazioni per NTC.
  3. Etichettare un vassoio per le fiale di zanzara (fiale di Drosophila ) in modo che ogni pozzetto sulla piastra da 96 corrisponda alla rispettiva fiala di zanzara nel vassoio.
  4. Anestetizzare le zanzare G1 con CO2 e metterle in una capsula di Vetro di Petri per tenerle sedate (Figura 2C,D). Anestetizzare e posizionare 8 zanzare selvatiche in una seconda capsula di Petri.
  5. Pulire un paio di pinzette con etanolo al 70% e rimuovere una delle zampe posteriori della zanzara (Figura 2E, F).
  6. Immergere la gamba nella soluzione di reagente per il rilascio del DNA, posizionare la zanzara nella fiala corrispondente e chiuderla con una spugna (Figura 2G,H).
  7. Pulire nuovamente le pinzette con etanolo al 70% e procedere con la rimozione della gamba dalla zanzara successiva. Ripetere i passaggi 2.5-2.7 fino al completamento della piastra a 96 pozzetti.
    NOTA: È importante pulire le pinzette con etanolo al 70%. Ciò riduce al minimo la contaminazione incrociata del DNA.
  8. Sigillare la piastra con un sigillo ottico a piastra PCR (Figura 2I) e incubare la piastra a 96 pozzetti contenente le gambe a temperatura ambiente (RT) per 2-5 minuti e poi a 98 °C per 2 minuti. Lasciare raffreddare la piastra a RT mentre si prepara la miscela PCR.
    NOTA: l'intero processo richiede in genere 3-4 ore. Se le zanzare devono essere tenute nelle fiale per più tempo della durata prevista (soprattutto ≥1 giorno), posizionare un piccolo pezzo di uvetta (o fonte di zucchero e acqua) con ogni zanzara per garantire la sopravvivenza delle zanzare durante le incubazioni prolungate.

3. HRMA

  1. Eseguire la PCR.
    1. Preparare una miscela master contenente i seguenti componenti per ogni reazione: 10 μL di 2x tampone (dal kit di rilascio gDNA), 0,5 μM di ciascun primer, 1 μL di colorante EvaGreen, 0,4 μL di polimerasi (dal kit di rilascio gDNA) e completare a 19 μL con acqua di grado molecolare.
    2. Utilizzando un pipetto multicanale, trasferire 19 μL della miscela master in ciascun pozzetto. Trasferire 1 μL della soluzione di rilascio di DNA contenente DNA di zanzara preparata nella sezione 2 alla piastra (Figura 3A). Sigillare la piastra con una guarnizione ottica della piastra PCR.
    3. Eseguire la PCR seguendo i parametri ciclici: 98 °C per 5 min, 39 cicli di 98 °C per 10 s, la temperatura di ricottura scelta (72 °C) per 30 s; estensione finale 72 °C per 2 min.
  2. Generare profili di fusione termica seguendo i parametri: fase di denaturazione 95 °C per 1 min, ricottura 60 °C per 1 min, rilevamento della curva di fusione tra 75 °C e 95 °C con incrementi di 0,2 °C, con un tempo di attesa di 10 s a ciascuna temperatura. Vedere il materiale supplementare e la figura supplementare S1-S5 per una descrizione dettagliata della configurazione del software per l'esecuzione di HRMA utilizzando il sistema in tempo reale CFX96.
  3. Esaminare i profili di fusione (Figura 3B). Assegnare il controllo wild-type al cluster di riferimento.
    NOTA: il software (vedere la Tabella dei materiali) normalizza automaticamente i dati e designa cluster con colori per diverse curve di fusione.
  4. Contrassegnare i diversi cluster con i colori corrispondenti sul modello a 96 pozzetti (Figura 3C).
  5. Selezionare gli individui con curve di interesse, rimuoverli dai tubi e retromarciarli (Figura 3D). Nutrire con il sangue le femmine accoppiate e raccogliere le uova G2 .

4. Verifica della sequenza mediante sequenziamento Sanger

  1. Purificare il prodotto PCR dai pozzetti con zanzare selezionate (dalla piastra preparata nella sezione 3.1), utilizzando un enzima per degradare i primer PCR residui e defosforilare i dNTP in eccesso. In alternativa, utilizzare qualsiasi kit di pulizia delle colonne e procedere con il sequenziamento dei campioni.
    NOTA: il sequenziamento diretto può essere più impegnativo quando la dimensione del prodotto PCR è piccola (≤200 bp). In questi casi, progettare primer per amplificare frammenti più grandi che comprendono il sito bersaglio (≥250 bp) e amplificare mediante PCR utilizzando il DNA nella piastra a 96 pozzetti (fase 2.2).
  2. Analizzare e identificare gli indel utilizzando il software del visualizzatore di tracce (Figura 4). In alternativa, il software Poly Peak Parser20 può aiutare a rilevare la mutazione in individui eterozigoti.
    1. Visitare il sito Web Poly Peak Parser, selezionare la sequenza dagli individui mutanti nel menu Sfoglia e copiare e incollare la sequenza di riferimento sulla casella.
      NOTA: l'allineamento tra l'allele alternativo e il riferimento verrà visualizzato automaticamente sul lato destro dello schermo.

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Risultati

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Le zanzare contenenti mutazioni nei geni AaeZIP11 (presunto trasportatore di ferro21) e myo-fem (un gene della miosina polarizzato femminile correlato ai muscoli di volo13) sono state ottenute utilizzando la tecnologia CRISPR/Cas9, genotipizzate utilizzando HRMA e verificate in sequenza (Figura 5). La Figura 5A e la Figura 5C mostrano l'intensità di fluorescenza norma...

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Discussione

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L'analisi del fuso ad alta risoluzione offre una soluzione semplice e veloce per l'identificazione di indels generati dalla tecnologia CRISPR/Cas9 nella zanzara vettore Ae. aegypti. Fornisce flessibilità, consentendo la genotipizzazione delle zanzare mutate per una vasta gamma di geni dal muscolo di volo al metabolismo del ferro e altro ancora13,14. L'HRMA può essere eseguito in poche ore dalla raccolta dei campioni alle analisi finali. È necessario ulte...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

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Tutte le figure sono state create con Biorender.com sotto licenza alla Texas A & M University. Questo lavoro è stato supportato da fondi del National Institute of Allergy and Infectious Disease (AI137112 e AI115138 a Z.N.A.), Texas A & M AgriLife Research nell'ambito del programma Insect Vectored Disease Grant e USDA National Institute of Food and Agriculture, progetto Hatch 1018401.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Soluzione di etanoloal 70% in acqua
Piastre PCR a 96 pozzetti e PCR in tempo realeVWR82006-636Per ottenere DNA genomico (dalla zampa della zanzara)
piastre a 96 pozzettiStampato in casa, per la registrazione del genotipo
Bio Rad CFX96Macchina Bio RadPCR con capacità
di gradiente e HRMASerbatoi di reagenti biotecnologici diversificati VWR490006-896
Kit di pulizia rapida PCR Exo-CIPNew England BiolabsE1050S
Piastra di Petri in vetroVWR89001-246150 mm x 20 mm
Piastre PCR a parete sottile a 96 pozzetti a guscio rigidoBio-radHSP9665multicanale HRMA
(P10)Integra Biosciences4721
Pipettatore multicanale (P300)Integra Biosciences4723
Nunc Nastro sigillante in poliolefina acrilato, Thermo ScientificVWR37000-548Da utilizzare con il 96 pozzetti  Piastre PCR per l'ottenimento di DNA genomico
Nastro sigillante otticoBio-rad2239444 Da utilizzare con le piastre PCR a 96 pozzetti per HRMA
Phire Kit PCR diretto per tessuti animali (senza strumenti di campionamento)Thermo FisherF140WHPer ottenere DNA genomico ed eseguire PCR
Divisori per fiale di plasticaGenesee59-128W
Software per l'analisi della fusione di precisioneBio Rad1845025Utilizzato per la genotipizzazione dei campioni di DNA delle zanzare e l'analisi delle proprietà di denaturazione termica del DNA a doppio filamento (vedere il passaggio 3.3 del protocollo)
SoftwareDNAstar LasergenePer l'allineamento di sequenze multiple
Pipettatore monocanalePinzette Gilson
Dumont #5 11 cmWPI14098
Tappi in schiuma biancaVWR60882-189
Fiale di Drosophila larghe, polistireneGenesee32-117
Vassoio per fiale di mosche larghe, bluGenesee59-164B
Modelli di per pipettatore SeqMan Pro

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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