Questo articolo descrive in dettaglio un protocollo per la rapida identificazione degli indel indotti da CRISPR / Cas9 e la selezione delle linee mutanti nella zanzara Aedes aegypti utilizzando l'analisi del fuso ad alta risoluzione.
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Articolo metodologico
Rilevamento Indel a seguito della mutagenesi CRISPR/Cas9 mediante analisi della fusione ad alta risoluzione nell'aegittito di Mosquito Aedes
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'editing genetico delle zanzare è diventato di routine in diversi laboratori con la creazione di sistemi come le nucleasi effettori simili a stimolatori di trascrizione (TALEN), le nucleasi a dita di zinco (ZFN) e le endonucleasi di homing (HE). Più recentemente, la tecnologia CRISPR (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) aggregolate regolarmente intervallate ha offerto un'alternativa più semplice ed economica per l'ingegneria del genoma di precisione. Seguendo l'azione della nucleasi, i percorsi di riparazione del DNA risolveranno le estremità del DNA rotte, spesso introducendo indel. Queste mutazioni fuori dal quadro vengono quindi utilizzate per comprendere la funzione genica negli organismi bersaglio. Uno svantaggio, tuttavia, è che gli individui mutanti non portano marcatori dominanti, rendendo difficile l'identificazione e il tracciamento degli alleli mutanti, specialmente alle scale necessarie per molti esperimenti.
L'analisi della fusione ad alta risoluzione (HRMA) è un metodo semplice per identificare le variazioni nelle sequenze di acidi nucleici e utilizza le curve di fusione pcr per rilevare tali variazioni. Questo metodo di analisi post-PCR utilizza coloranti fluorescenti a doppio filamento che legano il DNA con strumentazione che ha capacità di acquisizione dei dati di controllo della rampa di temperatura ed è facilmente scalabile a formati di piastre a 96 pozzetti. Qui è descritto un semplice flusso di lavoro che utilizza HRMA per il rilevamento rapido di indel indotti da CRISPR / Cas9 e la creazione di linee mutanti nella zanzara Ae. aegypti. Criticamente, tutti i passaggi possono essere eseguiti con una piccola quantità di tessuto delle gambe e non richiedono il sacrificio dell'organismo, consentendo l'esecuzione di incroci genetici o saggi di fenotipizzazione dopo la genotipizzazione.
Introduzione
Come vettori di agenti patogeni come i virus dengue1, Zika2 e chikungunya3, nonché i parassiti malarici4, le zanzare rappresentano una significativa minaccia per la salute pubblica umana. Per tutte queste malattie, c'è un focus sostanziale dell'intervento di trasmissione sul controllo dei vettori di zanzare. Lo studio dei geni importanti, ad esempio, per il permissivismo nei confronti degli agenti patogeni, la forma fisica delle zanzare, la sopravvivenza, la riproduzione e la resistenza agli insetticidi è fondamentale per lo sviluppo di nuove strategie di controllo delle za....
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Protocollo
1. Scansione per polimorfismi a singolo nucleotide (SNP), progettazione di primer HRMA e convalida del primer
- Identificazione SNP nelle zanzare selvatiche delle colonie di laboratorio
- Selezionare l'esone bersaglio per interrompere la corretta traduzione polipeptidica.
NOTA: il bersaglio deve essere vicino al codone iniziale o tra i residui chiave necessari per la funzione proteica. Più corto è l'esone (ad esempio, ≤200 basi), più difficile è il target e l'analisi. Evita di modificare vicino ai confini di un esone, poiché ciò costringe uno dei primer HRMA ad attraversare un introne o a trovarsi in un introne. Ciò è indesiderabile perché i tassi SNP ....
- Selezionare l'esone bersaglio per interrompere la corretta traduzione polipeptidica.
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Risultati
Le zanzare contenenti mutazioni nei geni AaeZIP11 (presunto trasportatore di ferro21) e myo-fem (un gene della miosina polarizzato femminile correlato ai muscoli di volo13) sono state ottenute utilizzando la tecnologia CRISPR/Cas9, genotipizzate utilizzando HRMA e verificate in sequenza (Figura 5). La Figura 5A e la Figura 5C mostrano l'intensità di fluorescenza norma.......
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Discussione
L'analisi del fuso ad alta risoluzione offre una soluzione semplice e veloce per l'identificazione di indels generati dalla tecnologia CRISPR/Cas9 nella zanzara vettore Ae. aegypti. Fornisce flessibilità, consentendo la genotipizzazione delle zanzare mutate per una vasta gamma di geni dal muscolo di volo al metabolismo del ferro e altro ancora13,14. L'HRMA può essere eseguito in poche ore dalla raccolta dei campioni alle analisi finali. È necessario ulte.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Ringraziamenti
Tutte le figure sono state create con Biorender.com sotto licenza alla Texas A & M University. Questo lavoro è stato supportato da fondi del National Institute of Allergy and Infectious Disease (AI137112 e AI115138 a Z.N.A.), Texas A & M AgriLife Research nell'ambito del programma Insect Vectored Disease Grant e USDA National Institute of Food and Agriculture, progetto Hatch 1018401.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione di etanolo | al 70% in acqua | ||
| Piastre PCR a 96 pozzetti e PCR in tempo reale | VWR | 82006-636 | Per ottenere DNA genomico (dalla zampa della zanzara) |
| piastre a 96 pozzetti | Stampato in casa, per la registrazione del genotipo | ||
| Bio Rad CFX96 | Macchina Bio Rad | PCR con capacità | |
| di gradiente e HRMASerbatoi di reagenti biotecnologici diversificati VWR | 490006-896 | ||
| Kit di pulizia rapida PCR Exo-CIP | New England Biolabs | E1050S | |
| Piastra di Petri in vetro | VWR | 89001-246 | 150 mm x 20 mm |
| Piastre PCR a parete sottile a 96 pozzetti a guscio rigido | Bio-rad | HSP9665 | multicanale HRMA |
| (P10) | Integra Biosciences | 4721 | |
| Pipettatore multicanale (P300) | Integra Biosciences | 4723 | |
| Nunc Nastro sigillante in poliolefina acrilato, Thermo Scientific | VWR | 37000-548 | Da utilizzare con il 96 pozzetti Piastre PCR per l'ottenimento di DNA genomico |
| Nastro sigillante ottico | Bio-rad | 2239444 Da utilizzare con le piastre PCR a 96 pozzetti per HRMA | |
| Phire Kit PCR diretto per tessuti animali (senza strumenti di campionamento) | Thermo Fisher | F140WH | Per ottenere DNA genomico ed eseguire PCR |
| Divisori per fiale di plastica | Genesee | 59-128W | |
| Software per l'analisi della fusione di precisione | Bio Rad | 1845025 | Utilizzato per la genotipizzazione dei campioni di DNA delle zanzare e l'analisi delle proprietà di denaturazione termica del DNA a doppio filamento (vedere il passaggio 3.3 del protocollo) |
| Software | DNAstar Lasergene | Per l'allineamento di sequenze multiple | |
| Pipettatore monocanale | Pinzette Gilson | ||
| Dumont #5 11 cm | WPI | 14098 | |
| Tappi in schiuma bianca | VWR | 60882-189 | |
| Fiale di Drosophila larghe, polistirene | Genesee | 32-117 | |
| Vassoio per fiale di mosche larghe, blu | Genesee | 59-164B |
Riferimenti
- WHO. Dengue Guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control. WHO. , Report No. 978 160(2009).
- WHO. Zika epidemiology update. WHO. , 1-13 (2019).
- WHO. Guideli....
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Ristampe e permessi
