Imaging dell'adesione molecolare nel laminaggio cellulare mediante analisi dell'impronta di adesione

Scott Minh An; Seong Ho Kim; Vanessa J. White; Adam B. Yasunaga; Kathleen M. McMahon; Yousif Murad; Isaac T. S. Li

doi:10.3791/63013

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Articolo metodologico

Imaging dell'adesione molecolare nel laminaggio cellulare mediante analisi dell'impronta di adesione

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DOI:

10.3791/63013

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27 settembre 2021

Scott Minh An^*¹^,² , Seong Ho Kim^*¹ , Vanessa J. White^*¹^,² , Adam B. Yasunaga^*¹^,² , Kathleen M. McMahon² , Yousif Murad¹^,³ , Isaac T. S. Li¹^,²

¹Department of Chemistry, The University of British Columbia, ²Biochemistry and Molecular Biology, The University of British Columbia, ³Faculty of Medicine, The University of British Columbia

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo presenta le procedure sperimentali per eseguire il test dell'impronta di adesione per visualizzare gli eventi di adesione durante l'adesione a laminazione rapida delle cellule.

Abstract

L'adesione a rotolamento, facilitata da interazioni mediate dalla selectina, è una motilità passiva altamente dinamica nel reclutamento di leucociti nel sito di infiammazione. Questo fenomeno si verifica nelle venule postcapillari, dove il flusso sanguigno spinge i leucociti in un movimento rotolante sulle cellule endoteliali. La laminazione stabile richiede un delicato equilibrio tra la formazione del legame di adesione e la loro dissociazione guidata meccanicamente, consentendo alla cella di rimanere attaccata alla superficie mentre rotola nella direzione del flusso. A differenza di altri processi di adesione che si verificano in ambienti relativamente statici, l'adesione di rotolamento è altamente dinamica poiché le celle di laminazione viaggiano su migliaia di micron a decine di micron al secondo. Di conseguenza, i metodi convenzionali di meccanobiologia come la microscopia della forza di trazione non sono adatti per misurare i singoli eventi di adesione e le forze molecolari associate a causa del breve lasso di tempo e dell'elevata sensibilità richiesta. Qui, descriviamo la nostra ultima implementazione del test dell'impronta di adesione per visualizzare le interazioni P-selectin: PSGL-1 nell'adesione rolling a livello molecolare. Questo metodo utilizza legami irreversibili di tensometro basati sul DNA per produrre una storia permanente di eventi di adesione molecolare sotto forma di tracce di fluorescenza. Queste tracce possono essere fotografate in due modi: (1) cucire insieme migliaia di immagini limitate alla diffrazione per produrre un ampio campo visivo, consentendo l'estrazione dell'impronta di adesione di ogni cellula di rotolamento su migliaia di micron di lunghezza, (2) eseguire DNA-PAINT per ricostruire immagini a super-risoluzione delle tracce di fluorescenza all'interno di un piccolo campo visivo. In questo studio, il test dell'impronta di adesione è stato utilizzato per studiare le cellule HL-60 che rotolano a diverse sollecitazioni di taglio. In tal modo, siamo stati in grado di visualizzare la distribuzione spaziale dell'interazione P-selectina: PSGL-1 e ottenere informazioni sulle loro forze molecolari attraverso l'intensità della fluorescenza. Pertanto, questo metodo fornisce le basi per l'indagine quantitativa delle varie interazioni cellula-superficie coinvolte nell'adesione a rotolamento a livello molecolare.

Introduzione

La cascata di adesione a rotolamento descrive come le cellule circolanti si legano e rotolano lungo la parete dei vasi ^sanguigni1. Il rotolamento passivo è mediato principalmente dalle selectine, una delle principali classi di molecole di adesione cellulare (CAM)¹. Sotto il flusso di taglio del sangue, i leucociti che esprimono il ligando-1 della glicoproteina P-selectina (PSGL-1) formano legami altamente transitori con la P-selectina, che possono essere espressi sulla superficie delle cellule endoteliali infiammate. Questo processo è fondamentale affinché i leucociti migrino verso un sito di ^{infiammazi....}