Articolo metodologico

Un metodo di estrazione non degradativo per la caratterizzazione della struttura molecolare delle particelle di glicogeno batterico

DOI:

10.3791/63016

⸱

18 febbraio 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bioinformatics, School of Medical Informatics and Engineering, Xuzhou Medical University, 2Jiangsu Key Laboratory of New Drug Research and Clinical Pharmacy, School of Pharmacy, Xuzhou Medical University, 3Department of Pharmaceutical Analysis, School of Pharmacy, Xuzhou Medical University, 4Department of Biological Sciences, School of Life Sciences, Xuzhou Medical University, 5School of Chemistry and Molecular Biosciences, The University of Queensland, 6Centre for Nutrition and Food Sciences, Queensland Alliance for Agriculture and Food Innovation, The University of Queensland, 7Joint International Research Laboratory of Agriculture and Agri-Product Safety, College of Agriculture, Yangzhou University, 8State Key Laboratory of Quality Research in Chinese Medicines, Macau University of Science and Technology

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La struttura del glicogeno batterico è fortemente influenzata dai metodi di estrazione che possono provocare la degradazione molecolare e/o il campionamento distorto. È essenziale sviluppare metodi per ridurre al minimo questi problemi. Qui, sono stati confrontati quattro metodi di estrazione utilizzando la distribuzione delle dimensioni e la distribuzione della lunghezza della catena come criteri chiave per ridurre al minimo gli artefatti di estrazione.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Attualmente, esiste una varietà di metodi di estrazione del glicogeno, che danneggiano la struttura spaziale del glicogeno o estraggono solo parzialmente il glicogeno, portando alla caratterizzazione distorta della struttura molecolare fine del glicogeno. Per comprendere i cambiamenti dinamici delle strutture del glicogeno e le funzioni versatili delle particelle di glicogeno nei batteri, è essenziale isolare il glicogeno con una degradazione minima. In questo studio, viene dimostrato un metodo di isolamento del glicogeno delicato utilizzando la precipitazione in acqua fredda (CW) tramite ultracentrifugazione a gradiente di densità dello zucchero (SDGU-CW). Per il confronto sono stati eseguiti anche il metodo tradizionale dell'acido tricloroacetico (TCA) e il metodo dell'idrossido di potassio (KOH). Un ceppo di laboratorio comunemente usato, Escherichia coli BL21 (DE3), è stato utilizzato come organismo modello in questo studio a scopo dimostrativo. Dopo aver estratto le particelle di glicogeno con metodi diversi, le loro strutture sono state analizzate e confrontate attraverso la cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) per la distribuzione granulometrica e l'elettroforesi capillare assistita da fluorofori (FACE) per le distribuzioni lineari della lunghezza della catena. L'analisi ha confermato che il glicogeno estratto tramite SDGU-CW ha una degradazione minima.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il glicogeno è un polisaccaride altamente ramificato costituito da residui glucosilici e anche da una piccola ma significativa quantità di proteine, in cui tutti i residui glucosilici sono legati tra loro tramite legami α-1,4-glicosidici in catene lineari e legami α-1,6-glicosidici nei punti di ramificazione1. La struttura delle particelle di glicogeno è generalmente divisa in tre gerarchie: 1) oligomeri a catena corta, 2) particelle di β sferiche (~20 nm di diametro) e 3) grandi particelle di α a forma di rosetta aggregate insieme da particelle β, il cui diametro varia all'incirca fino a 300 nm. Recen....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Coltura e raccolta dei batteri

  1. Rianimare E. coli BL21(DE3) dal glicerolo batterico (-80 °C) inoculando una piastra sterile di agar LB (10 g/L di triptone, 5 g/L di estratto di lievito, 10 g/L di NaCl e 15 g/L di agar). Mettere la piastra in un'incubatrice standard e coltivare per una notte a 37 °C.
  2. Prelevare una singola colonia e inocularela in un terreno liquido sterile LB da 10 ml (10 g/L di triptone, 5 g/L di estratto di lievito e 10 g/L di NaCl). Mescolare bene tramite vortice e coltura per una notte a 37 °C con agitazione a 220 giri/min.
    NOTA: Se non diversamente spec....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Distribuzione dimensionale delle particelle di glicogeno
Una serie di studi ha dimostrato che le particelle di glicogeno α nel fegato diabetico sono fragili e facilmente rompibili nel disgregatore del legame idrogeno DMSO 11,12,13,14. Il presente studio ha testato come le dimensioni delle particelle e la stabilità strutturale sono cambiate per il glicogeno batterico estratto.......

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il glicogeno è un'importante riserva di energia che è stata identificata in molti batteri16. Per sezionare le funzioni fisiologiche delle particelle di glicogeno, è essenziale avere una migliore comprensione della struttura fine delle molecole di glicogeno. Finora, è stata sviluppata una varietà di metodi per estrarre il glicogeno dalla coltura batterica. Tuttavia, sono state osservate diverse distribuzioni dimensionali delle particelle di glicogeno da diversi met.......

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Siamo molto grati al professor Robert G. Gilbert dell'Università del Queensland e dell'Università di Yangzhou che ha fornito intuizioni e competenze che hanno notevolmente aiutato il completamento di questo studio. Riconosciamo il sostegno finanziario della National Natural Science Foundation of China (n. 31900022, n. 32171281), della Natural Science Foundation della provincia di Jiangsu (n. BK20180997), Giovane Scienza e Tecnologia Innovazione Team di Xuzhou Medical University (No. TD202001) e Jiangsu Qinglan Project (2020).

....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Equipment
Agilent 1260 infinity SEC systemAgilent1260 infinity IIDistribuzione granulometrica
Colonna analiticaPSS10-1000-Centrifuge
Eppendorf5420-Membrana
filtranteCambioKm-0220-
Sistema di elettroforesi capillare assistita da fluorescenzaBeckman Coulter-Distribuzionedella lunghezza della catena
LiofilizzatoreXinzhiSCIENTZ-10NLiofilizzazione di batteri e glicogeno
Congelatore ThermoFisherForma 900Conservazione dei campioni
Colonna di protezionePSSSUPPERMA-Incubator
Thermo FisherPR505750R-CN-
Centrifuga a bassa velocità e grande capacitàHexiHR/T20MMCentrifugazione del campione
Multiskan FC Lettore di micropiastreThermo Fisher
1410101-Optima XPN UltracentrifugaBeckmanXPN-100/90/80glicogeno
XinbaoSHZ-82-PA-800
Plus SystemBeckman CoulterA66528-Misuratore
pHMettler ToledoFE28 -TRIS-Rivelatore
dell'indice di rifrazioneWyattOptilab T-rEX-Frigorifero
HaierBCD-406WDPD-Thermomixer
Shanghai JingxinJXH-100Incubazione del campione
Microscopio elettronico a trasmissioneHitachi CorporationH-7000Morfologia delle particelle di glicogeno
Provetta per ultracentrifugaBeckman355651-Frantoio
cellulare ad ultrasuoniNingbo XinzhiScientz-IID  Disgregatore di batteri
Bagno d'acqua oscillante ad ultrasuoniJietuoJT-1027HTD-Miscelatore
vorticeTiangenOSE-VX-01-Sistema
idricoMerck MilliporeH2O-MM-UV-TAcqua deionizzata
Materiale
8-Aminopirene-1,3,6-Acido trisolfonico Sale trisodicoSigma-Aldrich196504-57-1-Etanolo
assolutoGuoyao
10009228-Agar polvereSolarbioA1890-Alfa-amilasi
MegazimaE-BLAAM-40ML-Amiloglucosidasi
MegazimaE-AMGDF-40ML-cOmplete
MiniRoche4693159001-D
- (+)KitSigma-AldrichG8270-1kg-D-Glucosio
(formato GOPOD)MegazymeK-GLUCQuantificazione del glicogeno
DimetilsolfossidoVicmedVic147Agente caotropico
E. coli BL21(DE3)TiangenCB105-02-Acido
etilendiammina tetra-aceticoVicmedVic1488-
Acido acetico glacialeGuoyao
10000218-GliceroloGuoyao10010618Stoccaggio
batterico Acido cloridricoGuoyao10011008-Idrossimetilamminometano
Sigma-AldrichV900483-500g-Isoamilasi
MegaZyme9067-73-6Glicogeno deramo
Cloruro di litioSigma-Aldrich62476-100G-M9
, Sali minimi, 5&volte;Sigma-AldrichM6030-1kgColtura batterica
Idrossido di potassioGuoyao
10017008-Pullulan standardPSS-
Acetato di sodio triidratoGuoyao10018718-Sodio
azideSigma-Aldrich26628-22-8-Cloruro
sodioGuoyao10019318batterico coltura
Cianoboroidruro di sodioHuaweiruikehws001297-Difosfato
di sodioSigma-Aldrich71515-250g-Fluoruro
di sodioMacklinS817988-250g-Idrossido
sodioGuoyao10019762-Nitrato
di sodioGuoyao
10019928-Pirofosfato di sodioSigma-AldrichV900195-500g-Saccarosio
Guoyao10021463-Acido
tricloroaceticoGuoyao40091961-Triptone
OxoidLP0042Coltura batterica
Estratto di lievitoOxoidLP0021Coltura batterica
Per oscillatore di di a per il dosaggio del glucosio di di

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, L., et al. Molecular structure of glycogen in Escherichia coli. Biomacromolecules. 20 (7), 2821-2829 (2019).
  2. Deng, B., et al. Molecular structure of glycogen in diabetic liver. Glycoconjugate Journal. 32 (3-4), 113-118 (2015).
  3. Hu, Z., ....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Estrazione del glicogenoprecipitazione in acqua freddagradiente di densit di zuccheroultracentrifugazioneEscherichia colicromatografia a esclusione dimensionaleelettroforesi capillareisolamento di particelle di glicogeno
Video in arrivo

Articoli correlati