Un metodo di estrazione non degradativo per la caratterizzazione della struttura molecolare delle particelle di glicogeno batterico

Summary

La struttura del glicogeno batterico è fortemente influenzata dai metodi di estrazione che possono provocare la degradazione molecolare e/o il campionamento distorto. È essenziale sviluppare metodi per ridurre al minimo questi problemi. Qui, sono stati confrontati quattro metodi di estrazione utilizzando la distribuzione delle dimensioni e la distribuzione della lunghezza della catena come criteri chiave per ridurre al minimo gli artefatti di estrazione.

Abstract

Attualmente, esiste una varietà di metodi di estrazione del glicogeno, che danneggiano la struttura spaziale del glicogeno o estraggono solo parzialmente il glicogeno, portando alla caratterizzazione distorta della struttura molecolare fine del glicogeno. Per comprendere i cambiamenti dinamici delle strutture del glicogeno e le funzioni versatili delle particelle di glicogeno nei batteri, è essenziale isolare il glicogeno con una degradazione minima. In questo studio, viene dimostrato un metodo di isolamento del glicogeno delicato utilizzando la precipitazione in acqua fredda (CW) tramite ultracentrifugazione a gradiente di densità dello zucchero (SDGU-CW). Per il confronto sono stati eseguiti anche il metodo tradizionale dell'acido tricloroacetico (TCA) e il metodo dell'idrossido di potassio (KOH). Un ceppo di laboratorio comunemente usato, Escherichia coli BL21 (DE3), è stato utilizzato come organismo modello in questo studio a scopo dimostrativo. Dopo aver estratto le particelle di glicogeno con metodi diversi, le loro strutture sono state analizzate e confrontate attraverso la cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) per la distribuzione granulometrica e l'elettroforesi capillare assistita da fluorofori (FACE) per le distribuzioni lineari della lunghezza della catena. L'analisi ha confermato che il glicogeno estratto tramite SDGU-CW ha una degradazione minima.

Introduction

Il glicogeno è un polisaccaride altamente ramificato costituito da residui glucosilici e anche da una piccola ma significativa quantità di proteine, in cui tutti i residui glucosilici sono legati tra loro tramite legami α-1,4-glicosidici in catene lineari e legami α-1,6-glicosidici nei punti di ramificazione¹. La struttura delle particelle di glicogeno è generalmente divisa in tre gerarchie: 1) oligomeri a catena corta, 2) particelle di β sferiche (~20 nm di diametro) e 3) grandi particelle di α a forma di rosetta aggregate insieme da particelle β, il cui diametro varia all'incirca fino a 300 nm. Recentemente, è stato scoperto che le particelle di glicogeno α hanno due stati strutturali negli eucarioti, cioè uno stato fragile e uno stato stabile. Qui, fragilità significa la dissociazione di particelle di α più grandi in particelle di β più piccole in presenza di un agente caotropico come il DMSO². Ulteriori analisi hanno scoperto che le particelle di glicogeno α nel fegato diabetico sono costantemente fragili³ e le particelle fragili α si degradano molto più velocemente delle particelle di α stabili⁴. Pertanto, la fragilità strutturale del glicogeno può esacerbare le condizioni iperglicemiche nel diabete ^2,4, il che rende la fragile α-particella un potenziale biomarcatore patologico del diabete a livello molecolare. Tuttavia, l'esistenza di particelle di glicogeno α nei procarioti è riportata solo sporadicamente⁵ e non vi è alcuna segnalazione dei due diversi stati strutturali del glicogeno α particelle nei batteri.

Per comprendere le funzioni fisiologiche delle particelle di glicogeno batterico, è essenziale determinare la struttura fine delle molecole di glicogeno, che richiede l'isolamento del glicogeno con la massima resa e la minima degradazione¹. Finora, sono state sviluppate varie tecniche per l'estrazione del glicogeno, tra cui, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, l'estrazione con acqua calda, l'estrazione con acido tricloroacetico (TCA) e l'estrazione alcalina calda (idrossido di potassio, KOH)⁶. Inoltre, un altro metodo comunemente usato per l'isolamento del glicogeno eucariotico, il metodo dell'ultracentrifugazione a gradiente di densità di zucchero (SDGU), è stato riportato anche per l'isolamento del glicogeno batterico in Selenomonas ruminantium e Fibrobacter succinogenes ^7,8. Sebbene i pro e i contro di questi metodi siano stati ampiamente discussi negli studi eucariotici ^9,10, raramente ci sono studi comparativi delle strutture fini del glicogeno isolate tramite diversi metodi di estrazione nei batteri dal punto di vista delle strutture delle particelle di glicogeno.

In questo studio, questo problema è stato affrontato utilizzando Escherichia coli BL21(DE3) come organismo modello. Sono stati confrontati un totale di quattro metodi di estrazione del glicogeno, vale a dire l'estrazione con acqua calda precipitata con TCA (TCA-HW), l'estrazione con acqua fredda precipitata con TCA (TCA-CW), l'estrazione con soluzione calda KOH al 30% (KOH-HW) e l'estrazione con acqua fredda mediante ultracentrifugazione a gradiente di densità di saccarosio (SDGU-CW). La distribuzione granulometrica del glicogeno è stata quindi misurata tramite cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC), mentre la distribuzione della lunghezza della catena è stata rilevata tramite elettroforesi dei carboidrati assistita da fluorofori (FACE), entrambe utilizzate per valutare la qualità dei metodi di estrazione. Inoltre, la stabilità e la fragilità delle particelle di glicogeno batterico α sono state confrontate tra i vari metodi di estrazione, confrontando la distribuzione granulometrica delle particelle prima e dopo il trattamento con l'agente caotropico comunemente usato, il dimetilsolfossido (DMSO). Di seguito sono presentate le procedure dettagliate per l'estrazione del glicogeno e la caratterizzazione strutturale. In sintesi, il metodo SDGU-CW ha il miglior effetto complessivo in termini di integrità strutturale del glicogeno ed è, pertanto, raccomandato per l'estrazione del glicogeno batterico in futuri studi pertinenti.

Protocol

1. Coltura e raccolta dei batteri

1. Rianimare E. coli BL21(DE3) dal glicerolo batterico (-80 °C) inoculando una piastra sterile di agar LB (10 g/L di triptone, 5 g/L di estratto di lievito, 10 g/L di NaCl e 15 g/L di agar). Mettere la piastra in un'incubatrice standard e coltivare per una notte a 37 °C.
2. Prelevare una singola colonia e inocularela in un terreno liquido sterile LB da 10 ml (10 g/L di triptone, 5 g/L di estratto di lievito e 10 g/L di NaCl). Mescolare bene tramite vortice e coltura per una notte a 37 °C con agitazione a 220 giri/min.
   NOTA: Se non diversamente specificato, tutte le condizioni di coltura del liquido erano di 37 °C con una velocità di agitazione di 220 giri/min.
3. Trasferire 1 mL della coltura notturna di E. coli in 100 mL di terreno liquido sterile LB e coltura per 5 ore. Trasferire 50 mL in 1 L di 1x M9 minimo di terreno (3 g/L KH₂PO₄, 0,5 g/L NaCl, 6,78 g/L Na₂HPO₄ e 1 g/L NH₄Cl) contenente lo 0,8% di D-(+)-glucosio. Mescolare bene e fermentare per 20 ore.
   NOTA: 1x M9 minimo e il glucosio sono stati sterilizzati separatamente e poi mescolati durante il raffreddamento a temperatura ambiente in modo asettico.
4. Dopo la coltura per 20 ore, centrifugare la soluzione batterica a 6.000 x g per 15 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante. Conservare il pellet della cella a -80 °C per una notte e poi liofilizzare il pellet.
5. Sigillare e conservare la polvere batterica liofilizzata in frigorifero (-20 °C) per un uso successivo.

2. Estrazione del glicogeno

1. Estrazione con acqua calda precipitata con acido tricloroacetico (TCA-HW)
   1. Pesare con precisione 500 mg di polvere liofilizzata di E. coli BL21 (DE3) e risospenderla in 20 ml di tampone ghiacciato 0,05 M trietanolammina (TEA). Utilizzare un frantoio a ultrasuoni (25% di energia, 4 °C) per disgregare le cellule batteriche per 3 minuti (30 s cicli di lavoro e 2 s intervalli). Assicurarsi che non ci siano pellet evidenti nella soluzione.
      NOTA: La distruzione delle celle è stata effettuata sul ghiaccio. Regolare il pH del tampone TEA a pH 7 mediante l'aggiunta di HCl e conservare a temperatura ambiente.
   2. Trasferire tutto l'omogeneizzato batterico in due provette per ultracentrifuga da 10,4 mL (10 mL/provetta). Riempire le provette con acqua deionizzata fino in cima e centrifugare a 104.000 x g in un'ultracentrifuga a 4 °C per 90 minuti. Scartare il surnatante.
   3. Aggiungere 2 ml di acqua deionizzata per risospendere il pellet in ciascuna provetta. Trasferire la sospensione in una provetta da centrifuga da 50 mL e aggiungere acqua deionizzata fino a un volume finale di 20 mL. Scaldare e far bollire per 5 minuti per denaturare tutte le proteine.
   4. Centrifugare la sospensione per 10 minuti a 18.000 x g e trattenere il surnatante (S1). Trattare il precipitato allo stesso modo del passaggio 2.1.3. Raggruppare il nuovo surnatante (S2) con S1.
   5. Aggiungere il 50% di TCA (0,1 volume) al surnatante (S1+S2) e porre la miscela sul ghiaccio per 10 minuti per far precipitare le macromolecole come DNA, RNA, proteine, ecc. Centrifugare la miscela a 18.000 x g per 10 minuti e mescolare il surnatante con 1,5 volumi in volume di etanolo assoluto.
      NOTA: La concentrazione di TCA è del 50% v/v. Per la conservazione, tenerlo al riparo dalla luce.
   6. Far precipitare il glicogeno con ghiaccio per 20 minuti e centrifugare a 18.000 x g per 10 minuti. Versare il surnatante.
   7. Sciogliere il pellet in 5 mL di ddH₂O, quindi aggiungere 5 mL di etanolo assoluto ghiacciato. Incubare la soluzione per una notte a 4 °C e centrifugare a 18.000 x g per 10 minuti. Scartare il surnatante e conservare il pellet.
   8. Ripetere i passaggi "lavaggio e precipitazione" come al punto 2.1.7 altre due volte.
   9. Infine, sciogliere il glicogeno precipitato in 400 μL di ddH₂O in una provetta da 2 mL, precongelare a -80 °C e liofilizzare per ottenere una polvere di glicogeno secco.
2. Estrazione con acqua fredda precipitata con acido tricloroacetico (TCA-CW)
   NOTA: Il metodo TCA-CW è lo stesso del metodo TCA-HW, ad eccezione del fatto che, dopo aver eliminato il surnatante, trattare il pellet senza bollire (vedere il passaggio 2.1.3) e riproporlo in 20 mL di ddH₂O contenente 1 mg/mL di cocktail di inibitori della proteasi.
   1. Per preparare una soluzione cocktail di inibitori della proteasi da 1 mg/mL, sciogliere 50 mg di cocktail di inibitori della proteasi in 1 mL di acqua deionizzata e diluire in un rapporto di 50:1 (acqua deionizzata: soluzione cocktail di inibitori della proteasi).
3. Estrazione con acqua fredda mediante ultracentrifugazione a gradiente di densità di saccarosio (SDGU-CW)
   1. Sciogliere e omogeneizzare 1 g di polvere di E. coli liofilizzato in 4 mL di tampone di estrazione del glicogeno (GEB) con un cocktail di inibitori della proteasi da 1 mg/mL.
      NOTA: GEB è costituito da 50 mM di Tris, 150 mM di NaCl, 2 mM di EDTA, 50 mM di NaF e 5 mM di pirofosfato di sodio. Il GEB deve essere regolato a pH 8 con HCl.
   2. Utilizzare un frantoio a ultrasuoni per celle (25% di energia, 4 °C) per disgregare le cellule batteriche per 3 minuti (8 s cicli di lavoro e 9 s intervalli). Assicurarsi che l'intero processo venga eseguito sul ghiaccio. Dopo la sonificazione, trasferire l'omogeneizzato batterico in una provetta da centrifuga, riempirla con GEB fino a un volume finale di 10 mL e agitare la provetta per mescolare.
      NOTA: Non omogeneizzare per troppo tempo poiché il calore generato potrebbe degradare il glicogeno.
   3. Centrifugare a 6.000 x g per 10 min a 4 °C. Trasferire il surnatante in una provetta per ultracentrifuga da 10,4 mL, riempire la provetta fino in cima con GEB e centrifugare a 360.000 x g per 2 ore a 4 °C.
      NOTA: Assicurarsi che il tubo sia pieno e che non esistano bolle d'aria.
   4. Scartare il surnatante dopo la centrifugazione e risospendere il precipitato con 2 mL di acqua deionizzata.
   5. In una nuova provetta per ultracentrifuga, sovrapporre lentamente 4 mL di soluzione di saccarosio al 75% con 4 mL di soluzione di saccarosio al 37,5%. Quindi, sovrapporre la sospensione ottenuta al punto 2.3.4 sopra la soluzione di saccarosio e rabboccare con acqua deionizzata (vedi Figura 1).
      NOTA: La concentrazione di saccarosio è del 75% [v/v] e del 37,5% [v/v]. Prestare attenzione quando si crea il gradiente di densità del saccarosio e assicurarsi che ci sia una stratificazione osservabile tra le due soluzioni di saccarosio. Inoltre, assicurarsi che non vi siano bolle d'aria nella provetta dell'ultracentrifuga.
   6. Centrifugare a 360.000 x g per 2,5 ore a 4 °C ed eliminare il surnatante. Sciogliere il pellet in 200 μL di acqua deionizzata. Aggiungere 800 μl di etanolo assoluto per la precipitazione del glicogeno.
   7. Precipitare il glicogeno a -20 °C durante la notte. Centrifugare a 4.000 x g per 10 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
   8. Sciogliere il pellet risultante in 400 μL di ddH₂O in una provetta da 2 mL, precongelare a -80 °C e liofilizzare per ottenere una polvere di glicogeno secca. Conservare la polvere di glicogeno secco a 4 °C per l'analisi strutturale.
      NOTA: La procedura dettagliata è illustrata nella Figura 1.
4. Estrazione calda con soluzione di idrossido di potassio al 30% (KOH-HW)
   1. Far bollire la polvere di E. coli liofilizzata (50 mg) in 1 mL di KOH al 30% [p/v] per 1 ora.
   2. Aggiungere etanolo al 67% [v/v] contenente 15 mM di LiCl per precipitazioni a -20 °C per almeno 1 ora. Centrifugare i campioni a 16.000 x g a 4 °C per 20 minuti.
      NOTA: L'etanolo al 67% [v/v] con 15 mM di LiCl contiene 0,6358 g di LiCl, 67 mL di etanolo assoluto e 33 mL di acqua deionizzata.
   3. Risciogliere i pellet in 1 mL di ddH₂O e riscaldare per 10 min a 95 °C con agitazione intermittente.
   4. Ripetere la fase di precipitazione dell'etanolo altre tre volte come descritto al punto 2.4.2. Risciogliere il pellet finale in 400 μL di ddH₂O in una provetta da 2 mL, precongelare a -80 °C e liofilizzare per ottenere una polvere di glicogeno secca.

3. Determinazione della struttura del glicogeno

1. Microscopia elettronica a trasmissione (TEM)
   1. Risospendere la polvere di glicogeno in soluzione salina tamponata con Tris da 50 mM (pH 7) con una concentrazione finale di 1 mg/mL.
   2. Effettuare una diluizione di 10 volte della sospensione e applicare la sospensione diluita sulla griglia di rame a scarica incandescente da 400 mesh.
   3. Dopo 2 minuti, estrarre il campione in eccesso dalla griglia utilizzando una carta da filtro e colorare la griglia con 2-3 gocce di acetato di uranile all'1%.
   4. Utilizzare un microscopio elettronico a trasmissione operante a 75 kV per esaminare i preparati.
2. Cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC)
   1. Preparazione della fase mobile: preparare soluzioni di azoturo di sodio allo 0,02% (p/p) e nitrato di sodio 50 mM in acqua deionizzata e filtrare attraverso una membrana filtrante da 0,45 μm. Utilizzare il bagno d'acqua oscillante ad ultrasuoni per sonicare la soluzione per più di 15 minuti per rimuovere le bolle d'aria.
   2. Preparazione del campione: Utilizzare la fase mobile per sciogliere la polvere di glicogeno in modo che la concentrazione finale sia di 1 mg/mL. Incubare la soluzione a 80 °C per una notte in un termomiscelatore. Centrifugare il campione disciolto a 6.000 x g per 10 minuti a temperatura ambiente e trasferire il surnatante in una fiala SEC standard.
   3. Preparazione di campioni di glicogeno trattati con DMSO
      1. Sciogliere 1 mg di polvere di glicogeno in 300 μL di DMSO e incubarlo a 80 °C per una notte in un termomiscelatore. Aggiungere 4 volte il volume di etanolo per precipitare il glicogeno e centrifugare la soluzione a 6.000 x g.
      2. Lavare due volte il pellet con etanolo, sciogliere il pellet in ddH₂O e liofilizzare.
      3. Analizzare la polvere di glicogeno liofilizzata tramite SEC preparando i campioni come descritto sopra.
   4. Utilizzare il sistema SEC con pre-colonne e colonne 1000 e 10000 per l'analisi della distribuzione granulometrica del glicogeno. Mantenere le colonne a 80 °C e la portata a 0,3 mL/min.
3. Elettroforesi dei carboidrati assistita da fluorofori (FACE)
   1. Deramificazione del glicogeno
      NOTA: Quando si utilizza FACE per rilevare la distribuzione della lunghezza della catena (CLD), tutti i campioni da testare devono essere sottoposti al pretrattamento di deramificazione.
      1. Aggiungere 0,5 mg di polvere di glicogeno, 90 μL di acqua calda (90 °C), 1,5 μL di soluzione di NaN₃ , 3,5 μL di isoamilasi (200 U/mL) e 8 μL di tampone acido acetico-acetato di sodio (pH 3,5) in una provetta.
         NOTA: L'isoamilasi viene aggiunta per tagliare in modo specifico la catena ramificata del campione da testare. L'isoamilasi è un enzima deramificante che può distruggere specificamente il legame α-(1-6) senza distruggere il legame α-(1-4), quindi può scindere in modo specifico la catena laterale del glicogeno senza distruggere la struttura della catena principale.
      2. Incubare la miscela a 37 °C per 3 ore in un termomiscelatore. Dopo aver reso il pH neutro con 8 μl di soluzione di NaOH 0,1 M, incubare la miscela a 80 °C per 1 ora in un termomiscelatore.
      3. Aggiungere 4 volte il volume di etanolo assoluto alla miscela per precipitare il glicogeno. Quindi, centrifugare a 6.000 x g per 10 minuti a temperatura ambiente. Lavare due volte il pellet con etanolo, sciogliere il pellet in ddH₂O e liofilizzare.
   2. Preparazione della soluzione fluorescente
      1. Centrifugare il flacone di reagente APTS (sale trisodico dell'acido 8-amminopirene-1,3,6-trisolfonico) (ogni flacone contiene 5 mg di APTS) a 4.000 x g per 2 minuti. Aggiungere 50 μl di soluzione di acido acetico al 15% per sciogliere la polvere, mescolare bene e centrifugare a 4.000 x g per 2 minuti a temperatura ambiente per ottenere una soluzione di acido acetico APTS 0,2 M.
         NOTA: Conservare la soluzione APTS in frigorifero a -20°C.It deve essere utilizzata completamente entro due settimane dall'apertura. In caso contrario, verrà disattivato. L'APTS è un colorante caricato negativamente comunemente usato che si lega all'estremità riducente della catena del glicogeno. Poiché le catene con diversi gradi di polimerizzazione (DP) trasportano tutte una sola carica negativa, FACE può separarle in base ai loro diversi rapporti massa-carica. In questo modo, i segnali di diversi valori DP vengono rilevati dal rivelatore a fluorescenza.
   3. Trasferire il glicogeno deramificato in una provetta e aggiungere 1,5 μL di soluzione APTS e 1,5 μL di soluzione di cianoboroidruro di sodio. Incubare a 60 °C per 1,5 h al buio. Aggiungere 80 μL di acqua deionizzata, centrifugare a 4.000 x g per 10 minuti a temperatura ambiente e conservare il surnatante.
   4. Introdurre il campione nel sistema di elettroforesi capillare iniettando per 3 s a 0,5 psi (3,4 kPa sopra la pressione atmosferica).
      NOTA: I glucani lineari marcati in fluorescenza sono stati separati mediante una tensione applicata di 30 kV e una corrente approssimativa di 14 mA a 25 °C. Le aree di picco hanno fornito quantità relative di glucani con masse diverse (il grado di polimerizzazione (DP) dei glucani nei picchi adiacenti differiva di 1 DP). La temperatura del campione è stata mantenuta a 18 °C.

Results

Distribuzione dimensionale delle particelle di glicogeno
Una serie di studi ha dimostrato che le particelle di glicogeno α nel fegato diabetico sono fragili e facilmente rompibili nel disgregatore del legame idrogeno DMSO 11,12,13,14. Il presente studio ha testato come le dimensioni delle particelle e la stabilità strutturale sono cambiate per il glicogeno batterico estratto...

Discussion

Il glicogeno è un'importante riserva di energia che è stata identificata in molti batteri¹⁶. Per sezionare le funzioni fisiologiche delle particelle di glicogeno, è essenziale avere una migliore comprensione della struttura fine delle molecole di glicogeno. Finora, è stata sviluppata una varietà di metodi per estrarre il glicogeno dalla coltura batterica. Tuttavia, sono state osservate diverse distribuzioni dimensionali delle particelle di glicogeno da diversi met...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Agilent 1260 infinity SEC system	Agilent	1260 infinity II	Distribuzione granulometrica
Colonna analitica	PSS	10-1000-Centrifuge
	Eppendorf	5420-Membrana
filtrante	Cambio	Km-0220	-
Sistema di elettroforesi capillare assistita da fluorescenza	Beckman Coulter-Distribuzione		della lunghezza della catena
Liofilizzatore	Xinzhi	SCIENTZ-10N	Liofilizzazione di batteri e glicogeno
Congelatore Thermo	Fisher	Forma 900	Conservazione dei campioni
Colonna di protezione	PSS	SUPPERMA-Incubator
	Thermo Fisher	PR505750R-CN	-
Centrifuga a bassa velocità e grande capacità	Hexi	HR/T20MM	Centrifugazione del campione
Multiskan FC Lettore di micropiastre	Thermo Fisher
1410101-Optima XPN Ultracentrifuga	Beckman	XPN-100/90/80	glicogeno
Xinbao	SHZ-82-PA-800
Plus System	Beckman Coulter	A66528-Misuratore
pH	Mettler Toledo	FE28 -TRIS-Rivelatore
dell'indice di rifrazione	Wyatt	Optilab T-rEX-Frigorifero
	Haier	BCD-406WDPD-Thermomixer
	Shanghai Jingxin	JXH-100	Incubazione del campione
Microscopio elettronico a trasmissione	Hitachi Corporation	H-7000	Morfologia delle particelle di glicogeno
Provetta per ultracentrifuga	Beckman		355651-Frantoio
cellulare ad ultrasuoni	Ningbo Xinzhi	Scientz-IID	Disgregatore di batteri
Bagno d'acqua oscillante ad ultrasuoni	Jietuo	JT-1027HTD-Miscelatore
vortice	Tiangen	OSE-VX-01-Sistema
idrico	Merck Millipore	H2O-MM-UV-T	Acqua deionizzata
Materiale
8-Aminopirene-1,3,6-Acido trisolfonico Sale trisodico	Sigma-Aldrich	196504-57-1-Etanolo
assoluto	Guoyao
10009228-Agar polvere	Solarbio	A1890-Alfa-amilasi
	Megazima	E-BLAAM-40ML-Amiloglucosidasi
	Megazima	E-AMGDF-40ML-cOmplete
Mini	Roche	4693159001-D
- (+)Kit	Sigma-Aldrich	G8270-1kg-D-Glucosio
(formato GOPOD)	Megazyme	K-GLUC	Quantificazione del glicogeno
Dimetilsolfossido	Vicmed	Vic147	Agente caotropico
E. coli BL21(DE3)	Tiangen	CB105-02-Acido
etilendiammina tetra-acetico	Vicmed	Vic1488	-
Acido acetico glaciale	Guoyao
10000218-Glicerolo	Guoyao	10010618	Stoccaggio
batterico Acido cloridrico	Guoyao	10011008-Idrossimetilamminometano
	Sigma-Aldrich	V900483-500g-Isoamilasi
	MegaZyme	9067-73-6	Glicogeno deramo
Cloruro di litio	Sigma-Aldrich	62476-100G-M9
, Sali minimi, 5&volte;	Sigma-Aldrich	M6030-1kg	Coltura batterica
Idrossido di potassio	Guoyao
10017008-Pullulan standard	PSS	-
Acetato di sodio triidrato	Guoyao	10018718-Sodio
azide	Sigma-Aldrich	26628-22-8-Cloruro
sodio	Guoyao	10019318	batterico coltura
Cianoboroidruro di sodio	Huaweiruike	hws001297-Difosfato
di sodio	Sigma-Aldrich	71515-250g-Fluoruro
di sodio	Macklin	S817988-250g-Idrossido
sodio	Guoyao	10019762-Nitrato
di sodio	Guoyao
10019928-Pirofosfato di sodio	Sigma-Aldrich	V900195-500g-Saccarosio
	Guoyao		10021463-Acido
tricloroacetico	Guoyao		40091961-Triptone
	Oxoid	LP0042	Coltura batterica
Estratto di lievito	Oxoid	LP0021	Coltura batterica