Questo protocollo dimostra come utilizzare l'ospite della pianta per rilevare le proteine salivari delle cicaline e le proteine virali vegetali rilasciate dai vettori delle cicaline.
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Articolo metodologico
Rilevamento del virus e delle proteine salivari di un vettore cicalina nell'ospite della pianta
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli insetti vettori trasmettono orizzontalmente molti virus vegetali di importanza agricola. Più della metà dei virus vegetali sono trasmessi da insetti emitteri che hanno apparato boccale penetrante-succhiatore. Durante la trasmissione virale, la saliva dell'insetto collega il virus-vettore-ospite perché i virus vettori della saliva e le proteine degli insetti innescano o sopprimono la risposta immunitaria delle piante dagli insetti agli ospiti delle piante. L'identificazione e l'analisi funzionale delle proteine salivari stanno diventando una nuova area di interesse nel campo di ricerca delle interazioni arbovirus-ospite. Questo protocollo fornisce un sistema per rilevare le proteine nella saliva delle cicaline utilizzando l'ospite della pianta. Il vettore cicalina Nephotettix cincticeps infettato dal virus nano del riso (RDV) serve come esempio. La vitellogenina e la principale proteina del capside esterno P8 di RDV veicolata dalla saliva di N. cincticeps possono essere rilevate simultaneamente nella pianta di riso di cui si nutre N. cincticeps. Questo metodo è applicabile per testare le proteine salivari che vengono trattenute transitoriamente nell'ospite della pianta dopo l'alimentazione degli insetti. Si ritiene che questo sistema di rilevamento andrà a beneficio dello studio delle interazioni emittero-virus-pianta o emittero-pianta.
Introduzione
La modalità di trasmissione vettore-ospite degli arbovirus, un problema fondamentale, è alla frontiera della scienza biologica. Molti virus vegetali di importanza agricola sono trasmessi orizzontalmente da insetti vettori1. Più della metà dei virus vegetali sono veicolati da insetti emitteri, tra cui afidi, mosche bianche, cicaline, cicaline e tripidi. Questi insetti hanno caratteristiche distinte che consentono loro di trasmettere in modo efficiente i virus delle piante1. Possiedono apparato boccale penetrante-succhiante e si nutrono della linfa di floema e xilema e secernono la loro saliva 1,2,3,4. Con lo sviluppo e il miglioramento delle tecniche, l'identificazione e l'analisi funzionale delle componenti salivari stanno diventando un nuovo obiettivo di ricerca intensiva. Le proteine salivari conosciute nella saliva includono numerosi enzimi, come la pectinesterasi, la cellulasi, la perossidasi, la fosfatasi alcalina, la polifenolo ossidasi e la sucrasi, tra gli altri 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Le proteine della saliva includono anche elicitori che innescano la risposta di difesa dell'ospite, alterando così le prestazioni degli insetti, ed effettori che sopprimono la difesa dell'ospite, che migliora la forma fisica degli insetti e componenti che inducono risposte patologiche dell'ospite14,15,16,17. Pertanto, le proteine della saliva sono materiali vitali per la comunicazione tra insetti e ospiti. Durante la trasmissione dei virus, la saliva secreta dalle ghiandole salivari degli insetti viruliferi penetranti contiene anche proteine virali. I componenti virali utilizzano il flusso di saliva per rilasciarli dall'insetto all'ospite della pianta. Pertanto, la saliva dell'insetto collega l'interazione tritrofica virus-vettore-ospite. Studiare la funzione biologica delle proteine della saliva secrete dagli insetti viruliferi aiuta a comprendere la relazione virus-vettore-ospite.
Per i virus animali, è stato riferito che la saliva delle zanzare media la trasmissione e la patogenicità del virus del Nilo occidentale (WNV) e del virus Dengue (DENV). La proteina saliva AaSG34 promuove la replicazione e la trasmissione del virus dengue-2, mentre la proteina saliva AaVA-1 promuove la trasmissione dei virus DENV e Zika (ZIKV) attivando l'autofagia18,19. La proteina saliva D7 delle zanzare può inibire l'infezione da DENV in vitro e in vivo attraverso l'interazione diretta con i virioni DENV e la proteina ricombinante dell'involucro DENV20. Nei virus vegetali, il begomovirus tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) induce la proteina salivare Bsp9 della mosca bianca, che sopprime l'immunità mediata da WRKY33 dell'ospite della pianta, per aumentare la preferenza e le prestazioni delle mosche bianche, aumentando infine la trasmissione dei virus21. Poiché gli studi sul ruolo che le proteine salivari degli insetti svolgono negli ospiti delle piante sono rimasti indietro rispetto a quelli degli ospiti animali, è urgentemente necessario un sistema stabile e affidabile per rilevare le proteine salivari negli ospiti delle piante.
Il virus vegetale noto come virus nano del riso (RDV) è trasmesso dalla cicalina Nephotettix cincticeps (Hemiptera: Cicadellidae) con elevata efficienza e in modo persistentemente propagante22,23. RDV è stato segnalato per la prima volta per essere trasmesso da un insetto vettore e causa una grave malattia del riso in Asia24,25. Il virione è icosaedrico e sferico a doppio strato, e lo strato esterno contiene la proteina22 del capside esterno P8. Il periodo di trasmissione circolativa di RDV in N. cincticeps è di 14 giorni 26,27,28,29,30. Quando l'RDV arriva alle ghiandole salivari, i virioni vengono rilasciati nelle cavità immagazzinate nella saliva nelle ghiandole salivari attraverso un meccanismo simile all'esocitosi23. La vitellogenina (Vg) è il precursore della proteina del tuorlo essenziale per lo sviluppo degli ovociti nelle femmine di insetti31,32,33. La maggior parte delle specie di insetti ha almeno un trascritto Vg di 6-7 kb, che codifica per una proteina precursore di circa 220 kDa. I precursori proteici di Vg possono solitamente essere scissi in frammenti grandi (da 140 a 190 kDa) e piccoli (<50 kDa) prima di entrare nell'ovaio18,19. Precedenti analisi proteomiche hanno rivelato la presenza dei peptidi derivati da Vg nella saliva secreta della cicalina Recilia dorsalis, sebbene la loro funzione sia sconosciuta (dati non pubblicati). È stato recentemente riportato che Vg, che è secreto per via orale dalle cavallette, funziona come effettore per danneggiare le difese delle piante34. Non è noto se il Vg di N. cincticeps possa anche essere rilasciato all'ospite della pianta con flusso salivare, e quindi potrebbe svolgere un ruolo nella pianta per interferire con le difese della pianta. Per capire se N. cincticeps sfrutta le proteine salivari, come Vg, per inibire o attivare le difese delle piante, il primo passo è identificare le proteine rilasciate alla pianta durante l'alimentazione. Comprendere il metodo per identificare le proteine salivari presenti nella pianta è potenzialmente essenziale per spiegare la funzione delle proteine della saliva e le interazioni tra Hemiptera e piante.
Nel protocollo qui presentato, N. cincticeps è usato come esempio per fornire un metodo per esaminare la presenza di proteine salivari nell'ospite della pianta introdotte attraverso l'alimentazione degli insetti. Il protocollo descrive principalmente la raccolta e la rilevazione delle proteine salivari ed è utile per ulteriori indagini sulla maggior parte degli emitteri.
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Protocollo
Le cicaline adulte non virulifere sono state propagate nel Vector-borne Virus Research Center della Fujian Agriculture and Forestry University, in Cina.
1. Allevamento di insetti non viruliferi
- Allevare gli adulti su piantine di riso in una gabbia cubica di 40 cm x 35 cm x 20 cm (lunghezza x larghezza x altezza). Tenere un lato della gabbia coperto con una rete a prova di insetti per la ventilazione.
- Tenere le gabbie con cicaline in un'incubatrice che contenga un regolatore di umidità integrato a 26 °C con un'umidità relativa del 60-75% in un fotoperiodo di 16 ore di luce e 8 ore di buio.
- Usa un aspiratore per trasferire delicatamente tutti gli adulti dalla loro gabbia in una nuova gabbia che contiene piantine di riso fresco ogni settimana.
- Lascia che più di 200 adulti si accoppiano e depongano le uova nel riso.
- Conserva le vecchie piantine di riso affinché le ninfe emergano. Solleva queste nuove ninfe non virulifere allo stadio a 2 stelle.
2. Acquisizione del virus e raccolta di insetti viruliferi
- Trasferire con cautela le ninfe non virulifere a 2 pollici in un tubo di coltura di vetro (2,5 cm di diametro per 15 cm di altezza) per 1-2 ore per fame usando l'aspiratore.
- Rilascia le ninfe in una gabbia che contiene una pianta di riso infetta da RDV coltivata in una pentola.
- Permettere alle ninfe di nutrirsi della pianta di riso infetta per 2 giorni.
NOTA: Innaffiare con cura la pianta di riso ed evitare di lavare via le ninfe. Le ninfe a 2 stelle sono lunghe circa 1,6-2 mm.
- Trasferire con cura queste ninfe in una nuova gabbia che contenga piantine di riso fresco privo di virus con un'umidità relativa del 60-75% sotto un fotoperiodo di 16 ore di luce e 8 ore di buio. Consentire alle ninfe di nutrirsi della pianta di riso infetta per 12 giorni per completare il periodo di trasmissione circolativa di RDV.
3. Raccolta di proteine salivari utilizzando una gabbia di alimentazione
- Preparare cinque piccole gabbie di alimentazione simili a tubi (2,5 cm di diametro per 4 cm di altezza) in cui un'estremità è coperta con reti a prova di insetti.
- Confinare 15-20 cicaline in ogni gabbia di alimentazione, quindi coprire l'altra estremità della gabbia con un sottile tappetino di schiuma.
- Fissare una piantina di riso (alta 5-6 cm) tra l'estremità della gabbia e un tappetino di schiuma con dei nastri. Assicurarsi che le cicaline nella gabbia di alimentazione possano nutrirsi delle piantine di riso esposte all'interno della gabbia.
- Immergere le radici della piantina in acqua in modo che la pianta di riso rimanga viva. Lascia che le cicaline si nutrano di loro per 2 giorni.
- Rimuovere le cicaline dalle loro gabbie di alimentazione e raccogliere le piantine di riso su cui si sono nutriti. Tagliare le parti delle piantine al di fuori della gabbia e recuperare le regioni di alimentazione delle piantine.
NOTA: Questo campione può essere conservato a -80 °C per un massimo di 3 mesi, se non viene immediatamente utilizzato per il rilevamento.
4. Preparazione del reagente
- Sciogliere 15,1 g di Tris-base, 94 g di glicina e 5 g di SDS in 1 L di acqua sterile per preparare 5xTris-glicina tampone. Diluire 200 mL di tampone 5xTris-glicina con 800 mL di acqua sterile per preparare 1xTris-glicina tampone (vedere Tabella 1 per la composizione tampone).
- Sciogliere 80 g di NaCl, 30 g di Tris-base e 2 g di KCl in 1 L di acqua sterile per preparare 10xTris-tamponed tamponed tamponed (TBS) tampone. Autoclavare la soluzione a 121 °C per 15 min.
- Sciogliere 8 g di SDS, 4 ml di ß-mercaptoetanolo, 0,02 g di blu di bromofenolo e 40 ml di glicerolo in 40 ml di 0,1 M Tris-HCl (pH 6,8) per preparare 4 tampone per campioni proteici.
- Mescolare 800 mL di tampone Tris-glicina con 200 mL di metanolo per preparare il tampone di trasferimento.
- Aggiungere 100 mL di soluzione 10xTBS e 3 mL di Tween 20 a 900 mL di acqua sterile per preparare il tampone TBS con soluzione Tween 20 (TBST).
5. Western blotting per rilevare la saliva e le proteine virali
- Macinare 0,1 g dei campioni di riso con azoto liquido fino a quando il tessuto diventa polvere. Aggiungere 200 μL di tampone proteico 4x al campione e farlo bollire per 10 minuti. Centrifugare i campioni a 12.000 x g per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Rimuovere il surnatante e inserirlo in un nuovo flaconcino. Caricare 10 μL del campione in un gel SDS-PAGE ed eseguirlo in tampone Tris-glicina a 150 V per 45-60 minuti.
NOTA: Il residuo dopo la centrifugazione può essere eliminato.
- Rimuovere il surnatante e inserirlo in un nuovo flaconcino. Caricare 10 μL del campione in un gel SDS-PAGE ed eseguirlo in tampone Tris-glicina a 150 V per 45-60 minuti.
- Inserire una membrana nitrocellulosa da 0,45 μm e altre forniture sandwich nel tampone di trasferimento per 30 minuti.
NOTA: Questo passaggio può essere eseguito prima che il gel abbia completato la sua esecuzione. - Inserire il gel e trasferirlo per 90-120 minuti a 100 V nel tampone di trasferimento.
- Prendere la membrana e metterla in una soluzione di blocco del latte secco non grasso al 7% in soluzione TBST per 20 minuti. Aggiungere l'anticorpo specifico contro RDV P8 o Vg a una soluzione al 7% di latte in polvere non grasso in TBST. Incubare con l'anticorpo per colorare la membrana per 2 ore o durante la notte.
- Lavare la membrana con soluzione TBST tre volte, con 5 minuti di lavaggio ogni volta.
- Aggiungere le IgG anti-coniglio di capra come anticorpo secondario al 7% di latte secco non grasso con TBST. Incubare con l'anticorpo per 60-90 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare la membrana con la soluzione TBST tre volte per 5 minuti ogni volta.
- Utilizzare il kit ECL Western per il metodo chemiluminescente. Miscelare i reagenti di rilevamento 1 e 2 nel kit con un rapporto di 1:1 in un tubo. Mettere il reagente miscelato sulla membrana e incubare il tampone per 5 minuti.
- Drenare il reagente in eccesso e scattare una foto colorimetrica dell'immagine chemiluminescente. Combinali per vedere la scala con bande proteiche.
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Risultati
La figura 1 illustra tutte le fasi di questo protocollo: allevamento di insetti, acquisizione del virus, raccolta di proteine salivari attraverso l'alimentazione del riso e western blot. I risultati delle macchie occidentali hanno mostrato che bande specifiche e attese di circa 220 kDa sono state osservate nei campioni di riso e ghiandole salivari di insetti sulla membrana incubata con anticorpi contro Vg. Al contrario, nessuna banda è stata osservata nel campione di riso non alimen...
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Discussione
La saliva direttamente secreta dalle ghiandole salivari degli insetti penetranti svolge un ruolo fondamentale perché predigerisce e disintossica i tessuti ospiti e i fattori biologici cross-kingdom dei vettori negli ospiti 1,3,4. I fattori biologici cross-kingdom, inclusi elicitori, effettori e piccolo RNA, sono critici per la comunicazione insetto-ospite14,15,16
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (31772124 e 31972239) e della Fujian Agriculture and Forestry University (Grant KSYLX014).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagenti | |||
| Tris base | Roche | D609K69032 | Per 5&volte; Tampone tris-glicina e 10× Preparazione tampone TBS |
| glicina | Sigma-Aldrich | WXBD0677V | Per 5&volte; Preparazione del tampone tris-glicina |
| SDS | Sigma-Aldrich | SLCB4394 | Per 5&volte; Preparazione del tampone tris-glicina |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | per 10&volte; Preparazione del tampone TBS |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016318 | per 10&volte; Preparazione del tampone TBS |
| ß-mercaptoetanolo | Reagente Xiya | B14492 | Per 4&volte; preparazione del tampone del campione proteico |
| blu di bromofenolo | Sigma-Aldrich | SHBL3668 | Per 4&volte; preparazione del tampone del campione proteico |
| glicerolo | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | Per la preparazione del tampone del campione proteico 4&volte; |
| metanolo | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10014118 | Per la preparazione del tampone di trasferimento |
| Tween 20 | Coolaber SCIENCE& TeCHNoLoGY | CT30111220 | Per la preparazione TBST |
| latte secco scremato | Becton.Dickinso and company | 252038 | Per il blocco della membrana, la diluizione degli anticorpi |
| capra anti-coniglio IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | Riconoscimento del |
| kit ECL Western | ThermoFisher Scientific | 32209 | Substrato chemiluminescente |
| nitrocellulosa membrana | Pall Corporation | 25312915 | Per il trasferimento di proteine |
| Tamponi e soluzioni | |||
| Buffer | Composizione | Comments/Description | |
| 5&volte; Tampone tris-glicina | 15,1 g Tris base 94 g glicina 5 g di SDS in 1 L di acqua | Soluzione stock | |
| 1&volte; Tampone tris-glicina | 200 mL da 5× Tampone tris-glicina 800 mL di acqua | Soluzione di lavoro, per SDS-PAGE | |
| 10&volte; Soluzione salina tamponata Tris (TBS) tampone | 80 g NaCl 30 g Tris base 2 g KCl in 1 L di acqua | madre | |
| TBS con soluzione Tween 20 (TBST) | 100 mL 10× Soluzione TBS 3 mL Tween 20 900 mL di acqua | Soluzione di lavoro | |
| 4& tampone campione proteico | 8 g SDS 4 mL ß-mercaptoetanolo 0,02 g di blu di bromofenolo 40 mL di glicerolo in 40 mL 0,1 M Tris-HCl (pH 6,8) | Per l'estrazione di proteine | |
| Tampone di trasferimento | 800 mL di tampone tris-glicina 200 mL di metanolo | Per trasferimento di proteine | |
| Instruments | |||
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | SHBL3668 | Per la preparazione di tamponi per campioni di proteine |
| 4x Incubatore a temperatura costante | Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd. | PRX-1200B | Per l'allevamento di cicaline |
| Elettroforesi | Tanon Science & Fornitore verificato - Technology Co., Ltd. | Tanon EP300 | Per SDS-PAGE |
| Modulo centrale di trasferimento elettroforetico | BIO-RAD | 1703935 | Per SDS-PAGE |
| glicerolo | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | Per 4x preparazione di tamponi per campioni di proteine |
| glicina Sigma-Aldrich | WXBD0677V | Per 5x preparazione di tamponi tris-glicina | |
| capra anti-coniglio IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | Riconoscimento dello strumento primario e |
| passa-alto per la macinazione dei tessuti | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. | JXFSIPRP-24 | Per la macinazione di tessuti vegetali |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016318 | Per la preparazione di tamponi 10x TBS |
| metanolo | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10014118 | Per la preparazione del tampone di trasferimento |
| Mini canale di trasferimento di calore umido | BIO-RAD | 1703930 | Per SDS-PAGE |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | Per la preparazione del tampone 10x TBS |
| membrana nitrocellulosica | Pall Corporation | 25312915 | Per il trasferimento di proteine |
| latte secco scremato | Becton.Dickinso e società | 252038 | Per il blocco della membrana, la diluizione degli anticorpi |
| Pierce ECL Western kit | ThermoFisher Scientific | 32209 | Substrato chemiluminescente |
| Strumento per il colore delle proteine | GE Sanità bio-scienze AB | Amersham lmager 600 | Per la rilevazione |
| di proteine SDS | Sigma-Aldrich | SLCB4394 | Per 5x preparazione di tampone Tris-glicina |
| Tris base | Roche | D609K69032 | Per 5x tampone Tris-glicina e 10× Preparazione del tampone TBS |
| Tween 20 | Coolaber SCIENCE& TeCHNoLoGY | CT30111220 | Per la preparazione TBST |
| Vasca per elettroforesi a piastra verticale | BIO-RAD | 1658001 | SDS-PAGE |
| Shanghai Jinghong Experimental equipment Co., Ltd. | XMTD-8222 | Per far bollire i campioni proteici | |
| β-mercaptoetanolo | Reagente Xiya | B14492 | Per la preparazione di tamponi per campioni proteici 4x |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
