Registrazione della pressione intracavernosa in un modello di ratto con lesione del nervo cavernoso

Sommario

Questo protocollo descrive lo sviluppo di un modello stabile di prostatectomia radicale con lesione bilaterale del nervo cavernoso associato a disfunzione erettile e misurazione della pressione intracavernosa.

Abstract

Il modello di ratto con lesione bilaterale del nervo cavernoso (CN) è stato ampiamente utilizzato per simulare la lesione clinica del nervo cavernoso associata alla disfunzione erettile (DE) per valutare l'effetto dei metodi terapeutici clinici. Tuttavia, i metodi di costruzione del modello di lesione CN sono imperfetti e vari nel campo della ricerca in PS. È la lesione da schiacciamento CN il metodo più comunemente usato negli ultimi anni. Questo studio mira a fornire una descrizione dettagliata della procedura di costruzione del modello di ratto con lesione CN bilaterale e della misurazione della registrazione della pressione intracavernosa (ICP), fornendo un modello di ratto con lesione CN affidabile e riproducibile. Questo lavoro ha sviluppato con successo il metodo di lesione CN della lesione da schiacciamento dell'emostatico utilizzando un ago da siringa come supporto duro e un emostatico con un manicotto di gomma. Inoltre, questo metodo conclude che una tensione di 1,0 V, una frequenza di 20 Hz e un'ampiezza dell'impulso di 5 ms sono i parametri di stimolazione ottimizzati per la registrazione ICP in un modello di ratto con lesione bilaterale del CN.

Introduzione

La disfunzione erettile è una delle malattie più comuni negli uomini adulti. Si stima che il numero di pazienti con disfunzione erettile nel mondo raggiungerà i 322 milioni entro il 2025¹. Un'ampia indagine campionaria multicentrica in Cina mostra che la percentuale di DE causata da chirurgia pelvica o trauma è di circa l'8%². Nonostante il continuo miglioramento delle tecniche chirurgiche e degli strumenti chirurgici, l'incidenza della disfunzione erettile è ancora elevata. Si è ritenuto che lo sviluppo e la progressione della disfunzione erettile dopo prostatectomia radicale nerve-sparing (RP) contribuisca alla lesione del nervo cavernoso con conseguente atrofia della muscolatura liscia dei corpi cavernosi, apoptosi delle cellule endoteliali e rimodellamento patologico ^3,4.

Per studiare il meccanismo dell'emodinamica e i cambiamenti istopatologici della lesione del CN associati alla disfunzione erettile, sono stati sviluppati e valutati diversi tipi di modelli animali di lesione del CN, tra cui roditore, cane, gatto e scimmia ^5,6,7. Basandosi sui vantaggi in termini di spesa e riproducibilità, il modello bilaterale di ratto con lesione CN è diventato il modello più comune per la valutazione della disfunzione erettile dopo la chirurgia pelvica radicale⁸. Tuttavia, in numerose pubblicazioni sono state riportate varie forme di lesione nervosa le cui principali differenze sono gli approcci di lesione nervosa (schiacciamento, congelamento, trassezione ed escissione)^9,10,11. Inoltre, la diversità degli approcci alle lesioni nervose potrebbe portare a incoerenze nei parametri di registrazione della pressione intracavernosa (ICP) nel modello di ratto, che determina l'accuratezza e la valutazione di ICP⁸. Tuttavia, non esiste ancora un metodo standardizzato per indurre lesioni nervose e registrare l'ICP del modello.

Pertanto, questo studio mira a costruire un modello bilaterale di ratto con lesione CN più affidabile e riproducibile. Questo metodo fornisce una descrizione dettagliata della procedura di costruzione del modello e della misurazione dell'ICP, che potrebbe essere utile per studiare i meccanismi della disfunzione erettile e sviluppare trattamenti efficaci in futuro.

Protocollo

In questo studio sono stati utilizzati quindici ratti maschi adulti di Sprague-Dawley (3 mesi) di peso compreso tra 300 e 350 g. Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite seguendo le linee guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e con l'approvazione del quinto ospedale affiliato del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università Sun Yat-Sen. Gli animali sono stati alloggiati in una struttura confortevole con temperatura e luce controllate.

1. Preparazione per i materiali per le procedure chirurgiche

1. Preparare i seguenti strumenti: bisturi, forbici per tessuti, forbici per fili, pinze per piegare, pinze per tessuti, pinze per microchirurgia, pinze emostatiche per zanzare Hartman, fogli chirurgici sterili, un porta microaghi, divaricatori addominali per ratti e sistema di acquisizione ed elaborazione del segnale biologico (vedi Tabella dei materiali).
   1. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici prima dell'operazione. Utilizzare salviette imbevute di alcol (etanolo al 70%) per pulire l'area chirurgica.
      NOTA: Gli strumenti chirurgici devono essere sterilizzati mediante immersione in alcol durante la notte.
2. Preparare il sistema di registrazione della pressione
   1. Collegare una siringa da 10 ml contenente soluzione fisiologica di eparina e un ago ipodermico da 25 G a un rubinetto a 3 vie con un tubo (lunghezza 20 cm). Sciacquare la provetta sterilizzata con soluzione fisiologica sterile di eparina (200 U/mL).
      NOTA: Riempire il tubo con soluzione fisiologica di eparina evita l'introduzione di bolle d'aria nel sistema.
3. Sollevare l'ago da 25 G di 20 cm (solo la lunghezza del tubo) sopra il pad operatorio dell'animale. Quindi esaminare l'accuratezza della misurazione del sistema di registrazione della pressione mediante lavaggio o picchiettamento.

2. Preparazione dell'animale

1. Anestetizzare i ratti mediante iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodio (60 mg/kg) (vedere la Tabella dei Materiali).
   NOTA: Per confermare una profondità sufficiente dell'anestesia, è stata eseguita una valutazione del ritmo respiratorio spontaneo e dei riflessi di un ratto pizzicando la zampa posteriore.
2. Applicare un unguento sugli occhi bilaterali per evitare la secchezza corneale.
3. Dopo aver confermato una corretta anestesia, radere la metà inferiore dell'addome, del collo e del perineo utilizzando un rasoio elettrico. Posizionare il ratto in posizione supina su un termoforo (37 °C). Indossare guanti medici per mantenere condizioni sterili durante le procedure chirurgiche.

3. Procedura di isolamento e lesione del CN

1. Usa un bisturi per praticare un'incisione di 4 cm attraverso la pelle nella parte inferiore dell'addome della linea mediana. Per esporre completamente la vescica e la prostata, utilizzare forbici per tessuti e pinze per tessuti per praticare un'incisione di lunghezza adeguata attraverso la fascia sottocutanea, il tessuto muscolare e il peritoneo.
2. Utilizzare un divaricatore addominale per ratti per ingrandire la mappa del campo operativo. Utilizzare tamponi di cotone assorbente per separare la prostata dai tessuti adiacenti, come i legamenti.
   NOTA: Il ganglio pelvico maggiore (MPG) e la CN possono essere trovati in una delle due aree dorsolaterali della prostata.
3. Utilizzare micro forbici angolate per incidere la fascia sovrastante CN 1-6 mm distalmente all'MPG. Quindi far scorrere una sutura 9-0 sotto il CN con l'uso di pinze per microchirurgia.
4. Posizionare un ago per siringa (25 G) sotto il CN, 5 mm distalmente all'MPG. Quindi mettere l'emostatico alla luce della struttura a sandwich "punta dell'emostato-siringa-ago-nervo-punta dell'emostato" (Figura 1 e Figura 2).
   NOTA: L'ago della siringa deve essere rettificato in piano.
5. Applicare l'emostatico con chiusura completa della punta a 5 mm distale dal ganglio per 1 minuto, quindi estrarre l'emostatico e l'ago della siringa (Figura 2).
6. Sollevare leggermente il nervo tramite una sutura 9-0 e posizionare i ganci dell'elettrodo bipolare (vedi Tabella dei materiali) attorno al CN 2-4 mm distale all'MPG (Figura 3).
   NOTA: Due coppie di MPG e CN sono state azionate allo stesso modo.

4. Cateterismo dei corpi cavernosi e stimolazione del CN per la misurazione dell'ICP

1. Sciacquare la provetta con soluzione fisiologica sterile di eparina (200 U/mL) prima di introdurla nei corpi cavernosi.
2. Tenere l'ago da 25 G e mantenere la direzione dell'inserto parallela all'andamento dei corpi cavernosi (Figura 3).
   NOTA: La tunica albuginea deve essere allungata per facilitare l'inserimento.
3. Spingere l'ago da 25 G di 6 mm nei corpi cavernosi (Figura 3). Lavare il tubo e premere leggermente i corpi cavernosi per valutare la sensibilità del trasduttore (Figura 4). Per evitare cadute accidentali, fissare il tubo sul piano di lavoro con del nastro adesivo.
4. Utilizzare i seguenti parametri per la stimolazione CN: tensione a 1,0 V, frequenza a 20 Hz, larghezza dell'impulso a 5 ms. Applicare 1 minuto di stimolazione con 5 minuti di riposo tra la stimolazione successiva.
   NOTA: Ruotare il rubinetto a 3 vie sul canale del trasduttore di pressione quando si avvia la misurazione.

5. Assistenza postoperatoria

1. Posizionare i ratti su un cuscinetto riscaldato (37 °C) e monitorarli attentamente per il recupero dall'anestesia.
2. Per il controllo del dolore postoperatorio, fornire farmaci antinfiammatori non steroidei (come Carprofene, 0,5 mg/kg, iniezione sottocutanea) (vedere Tabella dei materiali) quando i ratti si riprendono completamente.
3. Sposta i ratti nella gabbia asettica e monitorali per 2 giorni per valutare lo stato di nutrimento, lo stato mentale e l'infezione della ferita incisionale.

Risultati

La procedura chirurgica ha prodotto una tipica curva di risposta ICP utilizzando questo protocollo con le impostazioni di stimolazione raccomandate. La curva di risposta ICP aumenta istantaneamente quando si stimola il nervo e diminuisce quando la stimolazione viene ritirata (Figura 5). È essenziale esaminare la linea di pressione intracavernosa prima di misurare l'ICP, il che influisce sulla valutazione dell'aumento dei valori di ICP (F...

Discussione

La disfunzione erettile è una grave complicanza della chirurgia pelvica o del trauma. Sebbene sia sottoposto a un'operazione di risparmio nervoso, il tasso di incidenza della disfunzione erettile è di circa il 14-90% nella prostatectomia radicale (RP)¹². A causa della problematica rigenerazione della lesione CN, l'effetto clinico curativo è meno che soddisfacente. Pertanto, è essenziale un modello animale stabile di lesione del CN per esplorare i trattamenti della...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Ago da 25 G	BD in Biologia	367391
Ritrattore addominale	Scienze della Vita RWD	R22009-01
Pad operatorio per animali	Fornito dal Laboratorio Chiave Provinciale di Imaging Biomedico del Guangdong	NA
Pinze di piegatura	Scienze della Vita RWD	F12011-10
Sistema biologico di acquisizione e elaborazione del segnale	Techman Software	BL-420S
Elettrodo bipolare	Techman Software	AC0047
Carprofen	Sigma-Aldrich	MFCD00079028
Pinze emostatiche HARTMAN per zanzara	Scienze della Vita RWD	F22002-10
Eparina	Tecnologia Biochimica di Shanghai Aladdin	2608411
Micro portaago	Scienze della Vita RWD	F31047-12
Force di microchirurgia	Scienze della Vita RWD	F11001-11
Bisturi	Scienze della Vita RWD	S32003-12
Pentobarbital sodico	Laboratorio Chiave Provinciale del Guangdong di Imaging Biomedico	NA
Sprague– Ratto di Dawley	Centro Medico Veterinario da Laboratorio del Guangdong	GDMLAC-035
Forbici a filo	Scienze della Vita RWD	S15001-11
Pinze tissutali	Scienze della Vita RWD	F13019-12
Forbici tessuti	Scienze della Vita RWD	S13029-14