Ricostruzione 3D e analisi di strutture neuronali subcellulari sottili utilizzando dati di microscopia elettronica a scansione a fascio ionico focalizzato

Summary

Una pipeline metodologica flessibile per identificare, visualizzare e quantificare sottili processi neuronali subcellulari all'interno di volumi di immagini di microscopia elettronica a scansione a fascio ionico focalizzato utilizzando pacchetti software open source di facile utilizzo.

Abstract

I recenti progressi nelle tecnologie del microscopio elettronico a scansione consentono ora l'analisi tridimensionale (3D) rapida di processi subcellulari ultrasottili. Qui, viene presentata una pipeline metodologica per identificare, visualizzare e analizzare processi neuronali sottili, come quelli che si proiettano nei bottoni presinaptici di altri neuroni (chiamati "spinule"). Utilizzando pacchetti software disponibili gratuitamente, questo protocollo dimostra come utilizzare un albero decisionale per identificare strutture subcellulari neuronali comuni utilizzando criteri morfologici all'interno di volumi di immagini di microscopia elettronica a scansione a fascio ionico focalizzato (FIB-SEM), con particolare attenzione all'identificazione di una diversità di spinule che si proiettano in bottoni presinaptici. In particolare, questo protocollo descrive come tracciare le spinule all'interno delle sinapsi neuronali per produrre ricostruzioni 3D di queste sottili proiezioni subcellulari, dei loro neuriti genitori e dei partner postsinaptici. Inoltre, il protocollo include un elenco di programmi software open source disponibili gratuitamente per l'analisi dei dati FIB-SEM e offre suggerimenti (ad esempio, levigatura, illuminazione) per migliorare le ricostruzioni 3D per la visualizzazione e la pubblicazione. Questo protocollo adattabile offre un punto di ingresso nell'analisi rapida su scala nanometrica delle strutture subcellulari all'interno di volumi di immagini FIB-SEM.

Introduction

Le indagini sulle relazioni struttura-funzione di componenti subcellulari sottili nanometricamente beneficiano spesso della visualizzazione e dell'analisi 3D¹. Tuttavia, gli studi di microscopia elettronica a trasmissione di sezioni seriali sono stati limitati temporalmente e spazialmente dalla necessità di utilizzare un coltello diamantato per tagliare e allineare centinaia o migliaia di sezioni ultrasottili seriali da ≥40 nm. Questi vincoli hanno limitato la capacità di campionare e analizzare efficacemente strutture subcellulari sottili (<40 nm di diametro) e la necessità di diventare esperti nel sezionamento seriale ultrasottile ha ostacolato l'applicazione delle analisi strutturali 3D ^2,3. Tuttavia, i recenti progressi nella microscopia elettronica a scansione a fascio ionico focalizzato (FIB-SEM) hanno rivoluzionato la velocità e la risoluzione dei volumi di immagine ottenibili e ora consentono l'analisi quantitativa di strutture subcellulari sottili come i reticoli endoplasmatici lisci ^4,5, le sinapsi neuronali ^3,6 e le vescicole sinaptiche ^7,8 su larga scala. Inoltre, l'uso più ampio dei volumi di immagini FIB-SEM ha accelerato lo sviluppo di archivi di volumi di immagini FIB-SEM liberamente accessibili⁹ e di software di analisi 3D (ad esempio, Espina¹⁰, IMOD¹¹, Neuromorph¹², Reconstruct¹³, TrakEM¹⁴) che ampliano la portata di questa tecnologia e ora consentono indagini sulla struttura e la funzione delle strutture subcellulari fini.

Una di queste caratteristiche subcellulari su scala nanometrica è la "spinula" sinaptica neuronale. Le spinule sono sottili (~0,06-0,15 μm di larghezza, 0,1-1 μm di lunghezza), proiezioni simili a dita che emanano da un neurone e vengono incapsulate dal neurite (ad esempio, bottone presinaptico) di un altro neurone^15,16. Le spinule incorporate all'interno dei processi neuronali sono state riportate nella letteratura di microscopia elettronica per quasi 60 anni¹⁷ e le sporgenze simili alle spinule sono una caratteristica conservata 18,19,20 e onnipresente^21,22 delle sinapsi eccitatorie. Tuttavia, nonostante la pervasività delle spinule sinaptiche, le loro funzioni rimangono oscure e c'è una carenza di dati necessari per spiegare la loro abbondanza e conservazione strutturale. Questa mancanza di caratterizzazione sperimentale delle spinule è dovuta principalmente alla difficoltà di analizzare quantitativamente la prevalenza e le dimensioni delle spinule. Le loro dimensioni ridotte sono particolarmente adatte per le analisi che utilizzano una risoluzione z (profondità) precedentemente irraggiungibile (ad esempio, ≤15 nm).

Qui, viene presentata una pipeline di analisi FIB-SEM per l'identificazione, la visualizzazione e l'analisi di strutture subcellulari sottili (con sezioni trasversali larghe ≤40 nm) che possono fungere da punto di ingresso sia per i nuovi arrivati che per gli esperti di FIB-SEM. Questo protocollo funge da base per l'identificazione delle strutture subcellulari neuronali all'interno di un volume di immagini 3D FIB-SEM, sottolineando come utilizzare criteri specifici per riconoscere e classificare i sottotipi di spinule e sinapsi. Inoltre, il protocollo dimostra come importare volumi di immagini in una piattaforma software di analisi 3D gratuita (Reconstruct), utilizzare questo software per tracciare spinule all'interno di sinapsi neuronali eccitatorie e produrre ricostruzioni 3D di queste proiezioni subcellulari, dei loro neuriti genitori e dei bottoni presinaptici incapsulanti. Infine, il protocollo mostra come utilizzare un software di rending 3D gratuito e open source (Blender) per levigare la "pelle" sulle ricostruzioni 3D per la visualizzazione e la potenziale pubblicazione, descrivendo in dettaglio i vantaggi e le potenziali insidie di questa tecnica.

Protocol

1. Dati sul volume dell'immagine e dimensione dell'oggetto subcellulare: considerazioni e registrazione

1. Ottenere un volume di immagine FIB-SEM di qualità dell'area di interesse contenente gli oggetti subcellulari di interesse.
   NOTA: Questo protocollo utilizza segmenti di un volume di immagine FIB-SEM dalla corteccia visiva primaria del furetto tardo adolescente (24,2 x 16,2 x 2,4 μm, voxel isotropi da 4 nm) e un volume FIB-SEM liberamente accessibile dall'ippocampo CA1 di ratto adulto (10,2 x 7,7 x 5,3 μm; voxel isotropi da 5 nm) reso disponibile dal laboratorio Knott (https://www.epfl.ch/labs/cvlab/data/data-em/). È fondamentale preparare i blocchi di tessuto per FIB-SEM utilizzando un protocollo che preservi i dettagli ultrastrutturali e produca un elevato contrasto in condizioni di imaging FIB-SEM^23,24. È importante sottolineare che il tessuto deve essere ripreso in modo tale che la risoluzione del voxel dell'immagine FIB-SEM risultante sia di <0,5 × la dimensione del diametro della più piccola struttura subcellulare di interesse. Ad esempio, poiché i siti di protrusione della spinule nei bottoni presinaptici possono avere un diametro di 30 nm, una dimensione del voxel di <15 nm sarebbe appropriata per campionare queste strutture al di sopra del criterio di Nyquist. Inoltre, è utile visualizzare i tessuti a risoluzione isotropa (uguale in tutte le dimensioni) (ad esempio, voxel 5 x 5 x 5 nm) per consentire la visualizzazione e la ricostruzione di strutture fini che hanno dimensioni uguali in tutti i piani x/y/z.
2. Scaricare e installare la distribuzione Fiji di ImageJ²⁵ (https://imagej.net/software/fiji/downloads).
3. Allineare il volume dell'immagine.
   NOTA: Mentre i moderni sistemi FIB-SEM producono volumi di immagine approssimativamente allineati, la registrazione da immagine a immagine può ancora soffrire di deriva sub-pixel.
   1. Nelle Fiji, vai su Plugin | Registrati e scegli Registra sezioni dello stack virtuale. Consultare il Manuale dell'utente per assistenza (https://imagej.net/Register_Virtual_Stack_Slices). Iniziare con una registrazione rigida e poi utilizzare una tecnica affine se necessario.
4. Ridimensiona il volume dell'immagine.
   1. Apri il volume dell'immagine allineato nelle Figi facendo clic su File | Importazione | Sequenza di immagini e la navigazione nella cartella con le immagini allineate.
   2. Nella finestra di dialogo, fare clic su Ordina i nomi numericamente se le immagini sono denominate in ordine numerico. Fare clic su Usa stack virtuale per prestazioni Fiji più veloci.
   3. Una volta aperta l'immagine, fare clic su Immagine | Proprietà e inserire la dimensione fisica dei pixel del volume dell'immagine in micrometri nelle caselle di altezza, larghezza e profondità dei pixel. Digitare um OR μm in ciascuna delle caselle più a destra. Salvare il volume dell'immagine allineato come file .tiff facendo clic su File | Salva con nome | Tiff.
      NOTA: Se l'immagine è stata ridimensionata, la parte superiore dell'immagine dovrebbe ora indicare le dimensioni dell'immagine in micrometri (ad esempio, 9,82 x 8,65 μm).

2. Identificazione di neuriti e spinuli sinaptici

1. Durante lo scorrimento della pila (utilizzando i tasti freccia o la rotellina del mouse), fare riferimento all'albero decisionale di identificazione dei neuriti (Figura 1) e agli esempi di neuriti sezionati (Figura 2) per individuare e identificare gli oggetti di interesse.
   1. Identificare le spinule sinaptiche come sporgenze legate alla membrana di un neurite che diventa completamente avvolto all'interno di un neurite presinaptico o postsinaptico.
      NOTA: L'identificazione positiva della spinule sinaptica richiede l'evidenza visiva della membrana dell'oggetto sporgente della spinulo che si invagina nella membrana invertita di una struttura presinaptica o postsinaptica e la presenza della spinule legata alla membrana completamente incapsulata dalla membrana della struttura pre- o postsinaptica in almeno un'immagine.
2. Creazione di regioni di interesse (ROI) nelle Figi
   1. Fare clic su uno strumento appropriato nella barra degli strumenti delle Figi (ad esempio, uno strumento ovale), quindi fare clic e trascinare sull'immagine per formare un ROI. Registra questo ROI in ROI Manager digitando la lettera "T".
      NOTA: Il ROI Manager dovrebbe ora apparire con le coordinate dell'immagine come nome predefinito.
   2. Rinomina il ROI come desiderato facendo clic sul pulsante Rinomina in ROI Manager e digitando il nome desiderato nella casella di testo visualizzata. Rinominare le ROI in base a criteri quantitativi (ad esempio, il 12^° bouton presinaptico che viene analizzato e ha due sinapsi con spine postsinaptiche potrebbe essere chiamato B12_s,s).
      NOTA: Per associare ogni ROI a una "slice" di immagine (piuttosto che averla presente nell'intero stack di immagini) e per rendere visibili i nomi ROI sulle singole immagini, fare clic su queste opzioni in ROI Manager | Altro | Finestra Opzioni e quindi fare clic sulle caselle di controllo Mostra tutto ed Etichette nella parte inferiore di Gestione ROI. Si noti che questo passaggio è fondamentale quando si salvano le ROI all'interno di un volume di immagine perché l'associazione delle ROI all'intero volume dell'immagine piuttosto che alle singole immagini può portare a un doppio conteggio degli oggetti all'interno del volume.
   3. Per salvare tutte le ROI attualmente presenti in ROI Manager come file, fai clic sul pulsante Deseleziona in ROI Manager, fai clic sul pulsante Altro e scorri verso il basso fino a Salva.
      NOTA: Questo file .zip salvato può ora essere aperto nelle Fiji per ricaricare tutte queste ROI nel ROI Manager.

3. Determinare l'area di interesse e trasferire il volume dell'immagine al software di analisi 3D

1. Determinare se è consigliabile trasferire l'intero volume dell'immagine al software di ricostruzione e analisi 3D o se è necessario creare un substack più piccolo (vedere 3.3.2) per analizzare un numero inferiore di immagini e/o regioni di interesse dallo stack originale.
2. Eseguire un piccolo studio "pilota" su un'area relativamente piccola contenente l'oggetto o gli oggetti di interesse per stimare la dimensione dell'effetto e il numero di oggetti di interesse necessari per ottenere la potenza desiderata per i confronti statistici. Utilizzare una stima conservativa della dimensione del volume dell'immagine richiesto per campionare gli oggetti di interesse se questi oggetti subcellulari sono distribuiti in modo non uniforme all'interno del volume dell'immagine.
3. Per utilizzare una parte del volume dell'immagine per l'analisi 3D, duplicare prima il volume dell'immagine facendo clic su Immagine | Duplicare.
   1. Per utilizzare una parte ritagliata dell'immagine per l'analisi, scegliere lo strumento rettangolo dalla barra degli strumenti delle Figi e disegnare la regione di interesse desiderata; Se ciò non è desiderato, continuare con il passaggio successivo.
   2. Vai all'immagine | Pile | Strumenti | Crea Substack. Digita l'intervallo di immagini da includere all'interno del sottostack (ad esempio, includi immagini da 1 a 500 digitando da 1 a 500) nella casella di testo.
   3. Fare riferimento alle considerazioni sul campionamento di cui sopra (nota dopo 1.1) per determinare la risoluzione z richiesta in base alle dimensioni degli oggetti di interesse. Ad esempio, se il volume dell'immagine ha una profondità del voxel di 5 nm, è possibile campionare l'oggetto di interesse a intervalli di 10 nm nella dimensione z in modo che le Figi mantengano ogni altra immagine nel substack. Per fare ciò, digitare il numero dell'ennesima immagine dopo l'intervallo (ad esempio, per includere solo ogni altra immagine in un intervallo di immagini da 1 a 500, digitare da 1 a 500 - 2).
      NOTA: Ogni pacchetto software di analisi 3D (vedere la Tabella 1) avrà i propri requisiti di importazione dei file. Questo protocollo si concentra sull'importazione di volumi di immagini salvati come file .tiff nel software Reconstruct.

4. 3D ricostruzioni e analisi di strutture subcellulari sottili in Reconstruct

NOTA: È molto vantaggioso utilizzare un mouse dotato di rotellina durante l'utilizzo di Reconstruct. Inoltre, se la maggior parte o tutte le tracce verranno eseguite manualmente, l'utilizzo di uno stilo per disegnare i contorni su un computer con touchscreen può aumentare notevolmente l'efficienza delle tracce.

1. Scaricare e installare Reconstruct (https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0) per l'utilizzo su un computer che esegue Microsoft Windows in un ambiente nativo o virtuale.
2. Inizia una nuova ricostruzione creando una nuova cartella per i file di ricostruzione, cliccando su Serie | Nuovo, e salvando questa ricostruzione (file .ser) con il nome del file desiderato nella cartella che è stata appena creata.
3. Importare il volume dell'immagine .tiff salvato in Ricostruisci.
   1. Vai a Serie | Importazione | Immagini, fare clic su Seleziona nella finestra Importa immagini e individuare il file del volume dell'immagine. Nella finestra Importa immagini , cercare i file del volume dell'immagine che appaiono come una riga separata per ogni immagine nel volume.
   2. Importante: digita la dimensione corretta in pixel nella casella di testo Dimensione pixel in modo che corrisponda alla dimensione in pixel x/y (in μm) del volume dell'immagine. Fatto ciò, fai clic sul pulsante Importa nella finestra Importa immagini .
      NOTA: Una volta importate le immagini, dovrebbe esserci un'immagine al centro della finestra Ricostruisci e l'elenco Importa immagini dovrebbe essere vuoto.
   3. Se c'è un'immagine al centro della finestra Ricostruisci e l'elenco Importa immagini è vuoto, fai clic su Esci nella finestra Importa immagini .
   4. Imposta lo spessore della sezione (ad esempio, l'altezza del voxel o la dimensione z) facendo clic su Sezione | Elenca le sezioni, evidenziando tutte le sezioni elencate, quindi facendo clic su Modifica | Spessore nel menu Elenco sezioni e digitando lo spessore della sezione (in μm) nella casella di testo (ad esempio, 0,005 per una sezione spessa 5 nm).
      NOTA: Ricorda che se lavori con un substack da un volume di immagine originale più grande che include solo ogni ennesima sezione (vedi passaggio 3.3.3), è necessario tenere conto di queste sezioni "mancanti" nello spessore totale della sezione. Ad esempio, se lo spessore della sezione del volume dell'immagine originale (noto anche come altezza del voxel) era di 0,005 μm e il sottostack include solo una sezione su tre (ad esempio, 1-500-3), lo spessore della sezione di questo sottostack è 0,015 μm (ovvero 0,005 μm x 3 sezioni).
4. Traccia gli oggetti di interesse.
   1. Vai alla serie | Opzioni | Scheda Nomi/Colori per assegnare un nome al nuovo oggetto. Selezionare un colore per il contorno e il riempimento interno delle tracce dell'oggetto, quindi fare clic su OK.
      NOTA: Reconstruct tenterà di collegare tutte le tracce con lo stesso nome di un unico oggetto. Fare riferimento al manuale Reconstruct per le convenzioni di denominazione delle tracce (ad esempio, non includere spazi nei nomi). I colori delle tracce servono semplicemente per visualizzare le tracce; il colore della ricostruzione 3D di questo oggetto può essere facilmente modificato in seguito.
   2. Sulla barra degli strumenti, seleziona lo strumento Disegna a mano libera che assomiglia a una matita. Tieni premuto il tasto sinistro del mouse e trascina il mouse per tracciare la membrana dell'oggetto; Rilascia il pulsante sinistro del mouse per completare automaticamente la traccia. Fare clic su Pagina su / Pagina giù o utilizzare la rotellina del mouse per passare alla sezione ottica successiva nel volume dell'immagine e creare progressivamente tracce fino al completamento della struttura.
5. Tracciamento delle spinule sinaptiche
   NOTA: Le spinule incorporate all'interno dei bottoni presinaptici appaiono come strutture trasparenti legate alla membrana, occasionalmente con materiale opaco agli elettroni simile all'actina e/o pieghe simili a membrane al loro interno.
   1. Avanza attraverso il volume dell'immagine e individua il sito di invaginazione della spinule nel bottone presinaptico, facendo attenzione a differenziare le spinule dai reticoli endoplasmatici, dai vacuoli, dagli endosomi, dagli autofagosomi e da altri organelli subcellulari.
      NOTA: A differenza degli organelli legati alla membrana, assicurarsi che gli spinuli sinaptici sporgano sempre da (cioè membrana estroflessa) un neurite/glia e siano ricevuti da (cioè membrana invertita) una struttura pre o postsinaptica. Questa evidenza visiva di invaginazione spinulica dovrebbe verificarsi nelle immagini ≥2 e una spinula completamente incapsulata legata alla membrana dovrebbe essere presente all'interno della struttura pre- o postsinaptica nell'immagine ≥1. Le piccole spinule possono essere rivestite di clatrina. Per differenziare gli eventi di invaginazione spinule dall'endocitosi rivestita di clatrina nel neurite pre o postsinaptico, assicurarsi che l'identificazione positiva delle spinule rivestite di clatrina richieda la conferma visiva della membrana estrovettrice coincidente dall'oggetto genitore spinulo che si proietta nella membrana invertente di una struttura pre o postsinaptica all'interno della stessa immagine.
   2. Avanzare attraverso il volume dell'immagine per individuare il sito di proiezione/origine della spinule dal neurite/glia genitore; fare riferimento alla Figura 1 e alla Figura 2 per identificare queste strutture padre.
   3. Iniziare la traccia della spinule nel sito di protrusione della membrana nella struttura ricevente (ad esempio, bottoni presinaptici) e continuare a disegnare la spinule per tutto il tempo in cui appare come una struttura legata alla membrana all'interno del neurite pre o postsinaptico incapsulante.
   4. Continuare a tenere premuto il pulsante sinistro del mouse (o continuare a disegnare lungo la membrana della spinula con uno stilo se si utilizza un computer touch screen) mentre si traccia la membrana della spinule con il puntatore del mouse.
   5. Quando viene raggiunto il punto in cui è iniziata la traccia, rilasciare il pulsante sinistro del mouse.
      NOTA: se si rilascia il pulsante sinistro del mouse troppo presto, la traccia viene completata automaticamente, spesso con risultati indesiderati. In questo caso, è sufficiente premere Elimina mentre questa traccia è evidenziata nell'elenco delle tracce.
   6. Ripetere i passaggi 4.5.2-4.5.5 per ogni sezione in cui appare la spinula.
      NOTA: Ricordarsi di tracciare la spinula come una struttura incapsulata legata alla membrana all'interno del bottone quando appropriato. Poiché Reconstruct non consente la sottrazione automatica di strutture subcellulari incapsulate (ad esempio, spinule, organelli subcellulari) dal volume della struttura incapsulante, ciò può essere eseguito post-hoc (ad esempio, semplicemente sottraendo il volume della spinule dal volume totale del bottone presinaptico).
6. Ricostruire oggetti in 3D in Reconstruct
   1. Vai a Serie | Opzioni | 3D e assicurarsi che il pulsante di opzione Tracce sia selezionato.
   2. Aprire l'elenco degli oggetti facendo clic su Oggetti | Elencare gli oggetti.
   3. Una volta caricati i nomi degli oggetti tracciati nella finestra, fare doppio clic sul nome degli oggetti nell'elenco degli oggetti per visualizzarli in 3D. Attendi che venga visualizzata la finestra Scena 3D .
   4. Assicurarsi che l'inizio, la fine e i conteggi delle tracce siano corretti nell'elenco oggetti per ogni oggetto, in modo che il valore Count = End - Start. Se l'opzione Conteggio ≠ fine - Inizio per un oggetto, è possibile che una o più tracce di questo oggetto siano state erroneamente omesse.
   5. Ruota le tracce 3D dell'oggetto o degli oggetti tenendo premuto il pulsante sinistro del mouse e muovendo il mouse e/o tenendo premuto il pulsante destro del mouse e muovendo il mouse avanti e indietro per ingrandire e rimpicciolire. Assicurarsi che le tracce dell'oggetto siano allineate in modo appropriato e che sembri esserci una transizione graduale tra ogni traccia successiva.
   6. Se necessario, ripercorrere le singole tracce per rimuovere gli errori che portano a spigoli vivi e/o transizioni tra le tracce.
   7. Posiziona una skin mesh tetraedrica sull'oggetto navigando su Serie | Oggetto | scheda 3D e facendo clic sul pulsante di opzione Superficie Boissonnat .
   8. Nella finestra Scena 3D , fare clic su Scena | Deselezionare, quindi fare doppio clic sul nome dell'oggetto desiderato nell'elenco degli oggetti.
   9. Ruota gli oggetti per garantire transizioni fluide tra le tracce e ridisegna le tracce se necessario.
   10. Per modificare i colori e la trasparenza dell'oggetto, fare clic sul nome dell'oggetto nell'elenco degli oggetti, quindi fare clic su Scena | Colore/trasparenza... nel menu Elenco oggetti . Fare doppio clic sul nome dell'oggetto in Elenco oggetti per visualizzare questa modifica nella finestra Scena 3D .
       NOTA: Il colore, la trasparenza e la levigatura dell'oggetto possono essere modificati con un maggiore grado di controllo e specificità utilizzando Blender (vedi 5.4-5.6).
7. Analisi quantitativa di oggetti 3D
   1. Vai a Serie | Opzioni | Elenchi e fare clic su tutte le misure desiderate nelle sezioni Elenco oggetti e Elenco tracce di questa finestra.
   2. Esporta le misure dell'oggetto aprendo l'elenco degli oggetti (Oggetto | Elenca oggetti...) e poi cliccando su Elenco | Salva.
   3. Salvare le misure dell'oggetto come visualizzate nell'elenco degli oggetti come file delimitato da virgole (.csv).
   4. Importa il file .csv nel software di analisi dei dati che preferisci. Per importare in un foglio di calcolo (ad esempio, Microsoft Excel), è sufficiente fare doppio clic sul file o aprire una nuova cartella di lavoro vuota, fare clic su File | Importazione | CSV e segui le istruzioni.
   5. Per misurare le distanze tra gli oggetti in 3D (ad esempio, per misurare la distanza di proiezione di una spinule sinaptica all'interno di un bottone presinaptico), utilizzare la funzione Z-trace in Ricostruisci.
   6. Innanzitutto, assegnare un nuovo nome alla traccia passando alla serie | Opzioni | Scheda Nomi/Colori e digitando un nome per la traccia Z.
   7. Quindi, fai clic sullo strumento Z-trace nella barra degli strumenti.
   8. Per disegnare la traccia Z della distanza di proiezione di una spinula sinaptica, fare clic sull'inizio della spinula sinaptica facendo clic con il tasto sinistro del mouse, quindi premere i pulsanti Pagina su o Pagina giù per avanzare nel volume dell'immagine mentre si fa clic sui punti successivi lungo la membrana della spinula sinaptica all'interno di ciascuna sezione.
   9. Completa questa traccia Z facendo clic con il tasto destro del mouse.
   10. Esporta le misurazioni Z-trace facendo clic su Traccia | Elenca tracce... per visualizzare l'elenco delle tracce e quindi fare clic su Elenco | Salva per salvare le misurazioni dell'elenco delle tracce come file .csv.
8. Aggiunta di un cubo di scala
   1. Passare a una delle prime o ultime immagini dello stack
   2. Vai alla serie | Opzioni | Nomi/Colori e digitare un nome per il cubo di scala.
   3. Nella barra degli strumenti, fai clic sullo strumento Disegna rettangolo e disegna un piccolo quadrato (dimensione non importante) adiacente agli oggetti ma senza oscurarli. Vai alla serie | Opzioni | 3D, fare clic sull'opzione Casella nell'area Genera e specificare la dimensione del cubo di scala (in μm) digitandone le dimensioni nelle caselle A:, B:, C: nell'area Dimensioni (ad esempio, digitare 0,5 per A, B e C per generare un cubo di scala di 0,5 μm/lato).
      NOTA: Prima di tentare di ricostruire il cubo in scala in 3D, assicurarsi di avere gli oggetti 3D desiderati già ricostruiti nella scena 3D utilizzando l'opzione Tracce o Superficie Boissonnat . Ricordarsi di modificare l'opzione Genera in superficie Boissonnat e le dimensioni di A, B e C in -1 dopo aver ricostruito il cubo in scala (ad esempio, dopo il passaggio 4.8.5).
   4. Apri l'elenco degli oggetti e fai doppio clic sul nome del cubo in scala; attendere che il cubo di scala appaia nella finestra della scena 3D .
   5. Per spostare il cubo in scala rispetto agli altri oggetti, vai alla sezione Serie | Opzioni | 3D e digitare il numero di μm desiderato per spostare il cubo della bilancia nelle caselle X, Y e/o Z . Fare clic su OK per chiudere la finestra, quindi fare doppio clic sul nome del cubo di scala nell'elenco degli oggetti.
      NOTA: In alternativa, questo può essere fatto utilizzando Blender (vedi sotto).

5. Importazione, ricolorazione, levigatura e aggiunta di trasparenza alle ricostruzioni 3D in Blender

NOTA: Per assistenza dettagliata nell'uso di Blender, consultare il manuale di Blender e/o la miriade di video "come fare" sull'utilizzo di ciascuna funzione di Blender (basta fare una ricerca web per Blender E funzione desiderata). Quello che segue è un breve primer su come ricolorare, levigare e aggiungere trasparenza alle ricostruzioni 3D.

1. Scarica e installa l'ultima versione di Blender, la suite di software 3D gratuita e open source (www.blender.org).
2. In Ricostruisci, salvare le ricostruzioni 3D visualizzando gli oggetti desiderati nella finestra della scena 3D e quindi facendo clic su Scena | Esporta come | VRML 2.0.
3. In Blender, vai su File | Importazione | X3D estensibile 3D (.x3d/.wrl). Fare clic sul file VRML 2.0 salvato da Reconstruct , quindi fare clic sul pulsante Importa X3D/VRML2 .
4. Ricolora le ricostruzioni.
   1. Nella finestra Raccolta scene, nell'angolo in alto a destra, fare clic per deselezionare/deselezionare l'icona a forma di occhio per l'oggetto Cubo predefinito e fare clic sui nomi dei singoli oggetti per evidenziare ogni oggetto nella scena. Rinominare questi oggetti in base alle esigenze.
   2. Fare clic sul nome del primo oggetto da ricolorare nella finestra Collezione di scene .
   3. Fare clic sul Contesto circolare. Materiale nella parte inferiore della striscia di icone a destra, quindi fare clic su Aggiungi materiale. Di seguito dovrebbe apparire un elenco di opzioni. Quindi, fai clic sulla barra accanto all'opzione Colore base e scegli la luminanza e la tonalità desiderate per l'oggetto.
   4. Per modificare l'aspetto metallico, la lucentezza e le qualità riflettenti dell'oggetto, regolate le opzioni Metallico, Speculare, Ruvidità e Lucentezza per produrre l'effetto desiderato.
      NOTA: Affinché alcune opzioni appaiano nella Scena (ad esempio, trasparenza, lucentezza), potrebbe essere necessario essere nell'impostazione Viewport Shading: Look Dev o Viewport Shading: Renderizzata . Per passare a entrambe le impostazioni della finestra, passa il mouse sopra le icone del globo in alto a destra e fai clic sull'impostazione della finestra desiderata.
   5. Per modificare l'angolo di illuminazione, fai clic sull'oggetto Luce nella finestra Raccolta scene, fai clic sull'icona Mostra Gizmo in alto a destra, quindi trascina la luce intorno alla scena per ottenere l'effetto di luce desiderato. Modificare l'intensità della luce nella finestra Dati oggetto che appare sotto la finestra Raccolta scene quando è selezionato l'oggetto Luce .
   6. Per ruotare separatamente gli oggetti negli assi selezionati, fare clic sui nomi degli oggetti nella finestra Raccolta scene, premere il tasto R , quindi fare clic sulla lettera dell'asse di rotazione (tasto x, y o z ) e spostare il mouse per produrre la rotazione desiderata. Per afferrare e spostare gli oggetti, selezionarli nella finestra Raccolta scene, premere il tasto G , quindi utilizzare il mouse per spostare gli oggetti nella scena.
5. Rimesh (cioè leviga) le ricostruzioni.
   1. Fare clic sul nome dell'oggetto di interesse dalla finestra Raccolta scene, quindi utilizzare il cardanico e la rotellina del mouse per centrare e ingrandire l'oggetto.
   2. Fare clic sull'icona della chiave inglese Context.Modifiers sulla striscia di icone a destra, fare clic su Aggiungi modificatore, quindi su Remesh (sotto l'intestazione Genera). Utilizzare il menu a discesa per selezionare Smooth, fare clic sul pulsante Smooth Shading e modificare la profondità e la scala Octree per ottenere la levigatezza desiderata.
      NOTA: È utile essere nella finestra Viewport Shading: Wireframe (opzione icona globo in alto a destra) durante la rimeshazione per visualizzare direttamente i risultati. Il remeshing creerà mesh tetraedriche di dimensioni diverse sull'oggetto. Durante la levigatura dell'oggetto per rimuovere gli artefatti di sezionamento o tracciamento, fare attenzione a mantenerne la forma e i contorni originali. Inizia con una profondità di ottree = 7 e una scala = 0,95, quindi diminuisci lentamente questi numeri se necessario. Presta particolare attenzione agli oggetti piccoli e sottili, come le spinule e le densità postsinaptiche, poiché il piccolo volume di questi oggetti diminuisce la gamma di levigatura che può essere eseguita senza alterare la loro forma originale.
6. Aggiungi trasparenza agli oggetti.
   NOTA: Rendere trasparenti gli oggetti è importante quando è desiderabile mostrare la relazione 3D di un oggetto (ad esempio, spinule, vescicole presinaptiche, mitocondri, endosomi) che risiede all'interno di un altro oggetto (ad esempio, un bottone presinaptico).
   1. Fare clic sul nome dell'oggetto desiderato nella finestra Raccolta scene. Scorri fino alla fine del Contesto. Finestra del materiale (icona in basso a destra nell'elenco a destra), aprire la sezione Impostazioni e utilizzare il menu a discesa per modificare la modalità di fusione in Alpha Blend. Quindi, apri la sezione Superficie , scorri verso l'alto fino ad Alfa e modifica il numero in un valore inferiore a uno (1 = completamente opaco, 0 = completamente trasparente).
7. Esporta istantanee delle ricostruzioni 3D.
   1. Una volta ottenuta la colorazione, l'uniformità e l'illuminazione ottimali per le ricostruzioni 3D, salva l'immagine all'interno della scena cliccando sulla voce del menu Finestra e selezionando Salva Screenshot.
   2. Nelle opzioni Salva screenshot in basso a sinistra, scegli il tipo di file, il formato del colore e la compressione desiderati.
   3. Digita il nome del nuovo screenshot nella casella di testo del nome del file in alto, quindi salva lo screenshot nella posizione desiderata.

Results

Quantificazione della percentuale di spinule sinaptiche all'interno della popolazione di bouton presinaptica eccitatoria nella corteccia visiva primaria del furetto
Sebbene le sporgenze simili a spinule dai neuriti ai bottoni presinaptici eccitatori siano state osservate per decenni^19,26, la loro potenziale importanza per la funzione sinaptica è rimasta oscura. Questi esperimenti sono stati progettati per determinare la proporzione di bottoni ...

Discussion

Questa pipeline di analisi del volume di immagini FIB-SEM è in grado di produrre ricostruzioni 3D affidabili e misurazioni quantitative di strutture subcellulari sottili. Mentre le attuali tecniche semi-automatizzate che utilizzano reti neurali profonde e algoritmi di segmentazione possono aumentare la velocità e l'efficienza nella ricostruzione di strutture cellulari che possiedono un contrasto di membrana relativamente elevato all'interno di grandi volumi di immagini^3...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fiji (ImageJ)			https://imagej.net/software/fiji/downloads
Ricostruisci			https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0
Blender	Foundation Blender https		:/www.blender.org