Articolo metodologico

Ricostruzione 3D e analisi di strutture neuronali subcellulari sottili utilizzando dati di microscopia elettronica a scansione a fascio ionico focalizzato

DOI:

10.3791/63030

⸱

20 settembre 2021

 , 
1Division of Sciences & Mathematics, School of Interdisciplinary Arts & Sciences, University of Washington, Tacoma

In questo articolo

Sommario

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Una pipeline metodologica flessibile per identificare, visualizzare e quantificare sottili processi neuronali subcellulari all'interno di volumi di immagini di microscopia elettronica a scansione a fascio ionico focalizzato utilizzando pacchetti software open source di facile utilizzo.

Abstract

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I recenti progressi nelle tecnologie del microscopio elettronico a scansione consentono ora l'analisi tridimensionale (3D) rapida di processi subcellulari ultrasottili. Qui, viene presentata una pipeline metodologica per identificare, visualizzare e analizzare processi neuronali sottili, come quelli che si proiettano nei bottoni presinaptici di altri neuroni (chiamati "spinule"). Utilizzando pacchetti software disponibili gratuitamente, questo protocollo dimostra come utilizzare un albero decisionale per identificare strutture subcellulari neuronali comuni utilizzando criteri morfologici all'interno di volumi di immagini di microscopia elettronica a scansione a fascio ionico focalizzato (FIB-SEM), con particolare attenzione all'identificazione di una diversità di spinule che si proiettano in bottoni presinaptici. In particolare, questo protocollo descrive come tracciare le spinule all'interno delle sinapsi neuronali per produrre ricostruzioni 3D di queste sottili proiezioni subcellulari, dei loro neuriti genitori e dei partner postsinaptici. Inoltre, il protocollo include un elenco di programmi software open source disponibili gratuitamente per l'analisi dei dati FIB-SEM e offre suggerimenti (ad esempio, levigatura, illuminazione) per migliorare le ricostruzioni 3D per la visualizzazione e la pubblicazione. Questo protocollo adattabile offre un punto di ingresso nell'analisi rapida su scala nanometrica delle strutture subcellulari all'interno di volumi di immagini FIB-SEM.

Introduzione

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Le indagini sulle relazioni struttura-funzione di componenti subcellulari sottili nanometricamente beneficiano spesso della visualizzazione e dell'analisi 3D1. Tuttavia, gli studi di microscopia elettronica a trasmissione di sezioni seriali sono stati limitati temporalmente e spazialmente dalla necessità di utilizzare un coltello diamantato per tagliare e allineare centinaia o migliaia di sezioni ultrasottili seriali da ≥40 nm. Questi vincoli hanno limitato la capacità di campionare e analizzare efficacemente strutture subcellulari sottili (<40 nm di diametro) e la necessità di diventare esperti nel sezionament....

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Protocollo

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1. Dati sul volume dell'immagine e dimensione dell'oggetto subcellulare: considerazioni e registrazione

  1. Ottenere un volume di immagine FIB-SEM di qualità dell'area di interesse contenente gli oggetti subcellulari di interesse.
    NOTA: Questo protocollo utilizza segmenti di un volume di immagine FIB-SEM dalla corteccia visiva primaria del furetto tardo adolescente (24,2 x 16,2 x 2,4 μm, voxel isotropi da 4 nm) e un volume FIB-SEM liberamente accessibile dall'ippocampo CA1 di ratto adulto (10,2 x 7,7 x 5,3 μm; voxel isotropi da 5 nm) reso disponibile dal laboratorio Knott (https://www.epfl.ch/labs/cvlab/data/data-em/). È fo....

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Risultati

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Quantificazione della percentuale di spinule sinaptiche all'interno della popolazione di bouton presinaptica eccitatoria nella corteccia visiva primaria del furetto
Sebbene le sporgenze simili a spinule dai neuriti ai bottoni presinaptici eccitatori siano state osservate per decenni19,26, la loro potenziale importanza per la funzione sinaptica è rimasta oscura. Questi esperimenti sono stati progettati per determinare la proporzione di bottoni .......

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Discussione

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Questa pipeline di analisi del volume di immagini FIB-SEM è in grado di produrre ricostruzioni 3D affidabili e misurazioni quantitative di strutture subcellulari sottili. Mentre le attuali tecniche semi-automatizzate che utilizzano reti neurali profonde e algoritmi di segmentazione possono aumentare la velocità e l'efficienza nella ricostruzione di strutture cellulari che possiedono un contrasto di membrana relativamente elevato all'interno di grandi volumi di immagini3.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Bridge Fund dell'Università di Washington e dal Tacoma Pilot RRF Fund dell'Università di Washington. Molte grazie alla Dott.ssa Claudia Lopez e alla Dott.ssa Jessica Riesterer dell'MMC presso l'Oregon Health & Sciences University per il supporto tecnico FIB-SEM, al Dott. Graham Knott per l'uso del volume di immagini FIB-SEM CA1 e agli studenti dell'UW Tacoma del corso Neuronal Reconstructions (TBIOMD 495) per la loro pazienza ed eccellenza nel lavorare con questo protocollo.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Fiji (ImageJ)https://imagej.net/software/fiji/downloads
Ricostruiscihttps://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0
BlenderFoundation Blender https:/www.blender.org

Riferimenti

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  1. Holler, S., Kostinger, G., Martin, K. A. C., Schuhknecht, G. F. P., Stratford, K. J. Structure and function of a neocortical synapse. Nature. 591 (7848), 111-116 (2021).
  2. Xu, C. S., Pang, S., Hayworth, K. J., Hess, H. F. Transforming FIB-SEM. Volume microscopy: Multiscale imaging with photons, electrons, and io....

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