Articolo metodologico

Tecnica per ottenere cellule staminali mesenchimali dal tessuto adiposo e dalla caratterizzazione della frazione vascolare stromale nella crioconservazione a lungo termine

DOI:

10.3791/63036

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30 dicembre 2021

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1Genetics Division, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2TechLife Biotech, São Lucas Cell Therapy Group, 3Division of Plastic Surgery, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)

In questo articolo

Sommario

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Il presente protocollo descrive una metodologia migliorata per l'isolamento ADSC con conseguente enorme resa cellulare con guadagno di tempo rispetto alla letteratura. Questo studio fornisce anche un metodo semplice per ottenere un numero relativamente elevato di cellule vitali dopo la crioconservazione a lungo termine.

Abstract

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Le cellule staminali mesenchimali umane derivate dal tessuto adiposo sono diventate sempre più attraenti in quanto mostrano caratteristiche appropriate e sono una fonte accessibile per applicazioni cliniche rigenerative. Diversi protocolli sono stati utilizzati per ottenere cellule staminali derivate dal tessuto adiposo. Questo articolo descrive diversi passaggi di un protocollo migliorato che consente di risparmiare tempo per ottenere una quantità più significativa di ADSC, mostrando come crioconservare e scongelare ADSC per ottenere cellule vitali per l'espansione della coltura. Sono stati raccolti cento millilitri di lipoaspirato, utilizzando una liposuzione a siringa a tre fori e calibro 3 mm da 26 cm, dalla zona addominale di nove pazienti successivamente sottoposti a addominoplastica elettiva. L'isolamento delle cellule staminali è stato effettuato con una serie di lavaggi con soluzione salina tamponata fosfato (DPBS) di Dulbecco integrata con calcio e l'uso di collagenasi. Le cellule della frazione vascolare stromale (SVF) sono state crioconservate e la loro vitalità è stata controllata mediante immunofenotipizzazione. La resa cellulare SVF era 15,7 x 105 cellule/ml, compresa tra 6,1-26,2 cellule/ml. Le cellule SVF aderenti hanno raggiunto la confluenza dopo una media di 7,5 (±4,5) giorni, con una resa cellulare media di 12,3 (± 5,7) x 105 cellule/ml. La vitalità della SVF scongelata dopo 8 mesi, 1 anno e 2 anni variava tra il 23,06% e il 72,34% con una media del 47,7% (±24,64) con la vitalità più bassa correlata ai casi di congelamento a due anni. L'uso della soluzione DPBS integrata con calcio e tempi di riposo del sacchetto per la precipitazione dei grassi con un tempo più breve di digestione della collagenasi ha comportato un aumento della resa cellulare finale delle cellule staminali. La procedura dettagliata per ottenere alte rese di cellule staminali vitali era più efficiente per quanto riguarda il tempo e la resa cellulare rispetto alle tecniche degli studi precedenti. Anche dopo un lungo periodo di crioconservazione, cellule ADSC vitali sono state trovate nella SVF.

Introduzione

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Le cellule staminali mesenchimali umane sono vantaggiose sia nella ricerca di base che in quella applicata. L'uso di questo tipo di cellula adulta supera le questioni etiche - rispetto all'uso di cellule embrionali o di altro tipo - essendo una delle aree di studio più promettenti nell'ingegneria della rigenerazione dei tessuti autologhi e nella terapia cellulare1, come l'area neoplastica, il trattamento delle malattie degenerative e le applicazioni terapeutiche nell'area della chirurgia ricostruttiva 2,3,4, 5. È stat....

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Protocollo

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Il presente studio è approvato dal Comitato Etico dell'UNIFESP (numero di protocollo: 0029/2015 CAAE: 40846215.0.0000.5505), eseguito dopo aver ottenuto il consenso informato scritto dei pazienti secondo la Dichiarazione di Helsinki (2004). Il campione del presente studio è composto da nove pazienti di sesso femminile, di età compresa tra 33 e 50 anni (età media 41,5) e indice di massa corporea iniziale medio (BMI) di 24,54 (compreso tra 22,32-26,77) (Tabella 1) che sono state sottoposte a addominoplastica estetica a causa dell'eccesso di pelle dopo gravidanze, presso la Divisione di Chirurgia Plastica dell'Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP),....

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Risultati

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La caratterizzazione dei nove individui studiati, compresa la loro età, peso, altezza e BMI, sono mostrati nella Tabella 1.

In base alla resa cellulare inizialmente presentata, il volume cellulare inoculato in coltura è stato calcolato per essere il più vicino possibile alla capacità del matraccio di coltura da 75 cm2. Il volume campione seminato in ciascun caso è descritto nella tabella 2. Quindi, in base alla resa cellulare iniziale, è stato deter.......

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Discussione

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Resa di isolamento
E' assodato che il processo di crioconservazione, frequentemente richiesto nella terapia cellulare, comporta una significativa perdita cellulare, talvolta superiore al 50%29,30,35. Pertanto, un miglioramento tecnico per ottenere un'elevata resa cellulare iniziale in isolamento è fondamentale. Il metodo di raccolta del lipoaspirato e il metodo di isolamento delle cellule devono concentrarsi .......

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Dichiarazioni

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Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

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Ringraziamo i pazienti che si sono offerti volontari per partecipare e il personale medico e infermieristico dell'Ospedale di San Paolo. Questo studio è stato sostenuto dalla Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) e dal Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Brasile.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1,8 mL criovialiNunc Thermo Fisher Scientific 340711
150 mL sacca di trasferimento di cloruro di polivinileJP FARMA80146150059
2% Alizarina Red S Solution, pH 4,2Sigma AldrichA5533
Adrenalina (1 mg/mL)HipolaborNA
Alcian Blue solutionSigma Aldrich1,01,647
Citometro a flusso Antibiotico-Antimicotico 100xGibco15240062
BD FACSCalibur con analisi BD CellQues Pro BDBioSciencesNA
Cloruro di calcio 10%Merck102379
Clorexidina gluconato 4%VICPHARMA NA
Collagenasi, Tipo I, polvereGibco17018029
DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium)Gibco11966025
DPBS no calcio, no magnesium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Saline Gibco Cell Therapy Systems)GibcoA1285801
DPBS with calcium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)GibcoA1285601
Siero fetale bovinoGibco10500056
Formaldeide 4%Sigma Aldrich1,00,496
Microscopio a luce invertitaNikon Eclipse TS100NA
Saggio di cellule vive e morteThermofisher01-3333-41 | 01-3333-42
Anticorpo monoclonale: CD105BD BioSciences745927
Anticorpo monoclonale: CD11BBD BioSciences746004
Anticorpo monoclonale: CD19BD BioSciences745907
Anticorpo monoclonale: CD34BD BioSciences747822
Anticorpo monoclonale: CD45DAKOM0701
Anticorpo monoclonale: CD73BD BioSciences746000
Anticorpo monoclonale: CD90BD BioSciences553011
Anticorpo monoclonale: HLA-DRBD BioSciences340827
Contenitore per congelamento Mr. FrostyThermo Fisher Scientific5100-0001
PBS (soluzione salina tamponata con fosfato) 1x pH 7,4Gibco 
StemPro Kit di differenziazione per l'adipogenesiGibcoA1007001
Kit di differenziazione per condrogenesi StemProGibcoA1007101
Kit di differenziazione per osteogenesi StemProGibcoA1007201
Connettore sterile con una punta con sito di iniezione dell'agoConnettore Origen Biomedical, USANAMarchio di codice: IBS
Soluzione di blu di tripano 0,4%Sigma Aldrich93595
Tripsina-EDTA 0,25% 1x, rosso fenoloGibco25200056
10010023

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Frese, L., Dijkman, P. E., Hoerstrup, S. P. Adipose tissue-derived stem cells in regenerative medicine. Transfusion Medicina and Hemotherapy. 43 (4), 268-274 (2016).
  2. Alperovich, M., et al. Adipose stem cell therapy in cancer reconstruction: a....

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Cellule staminali mesenchimalicrioconservazione cellulareisolamento di cellule staminalicitometria a flussosaggio con blu trypanespansione della coltura cellularemarcatori delle cellule staminalidigestione con collagenasi

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