Articolo metodologico

Metodo Digital Droplet PCR per la quantificazione dell'efficienza di trasduzione AAV nella retina murina

DOI:

10.3791/63038

⸱

25 dicembre 2021

 ,  ,  ,  , 
1Molecular Biology, Genetics and Bioengineering Program, Sabanci University, 2Nanotechnology Research and Application Center (SUNUM), Sabanci University

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo presenta come quantificare l'efficienza di trasduzione AAV nella retina del topo utilizzando la PCR a goccia digitale (dd-PCR) insieme alla produzione di AAV su piccola scala, all'iniezione intravitreale, all'imaging retinico e all'isolamento del DNA genomico retinico.

Abstract

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Molti laboratori di biologia cellulare retinica ora utilizzano abitualmente virus adeno-associati (AAV) per l'editing genetico e le applicazioni regolatorie. L'efficienza della trasduzione AAV è solitamente critica, il che influisce sui risultati sperimentali complessivi. Uno dei principali determinanti per l'efficienza di trasduzione è il sierotipo o la variante del vettore AAV. Attualmente, sono disponibili vari sierotipi e varianti AAV artificiali con diverse affinità con i recettori di superficie delle cellule ospiti. Per la terapia genica retinica, ciò si traduce in vari gradi di efficienza di trasduzione per diversi tipi di cellule retiniche. Inoltre, la via di iniezione e la qualità della produzione di AAV possono anche influenzare le efficienze di trasduzione AAV retinica. Pertanto, è essenziale confrontare l'efficienza di diverse varianti, lotti e metodologie. Il metodo digital droplet PCR (dd-PCR) quantifica gli acidi nucleici con elevata precisione e consente di eseguire la quantificazione assoluta di un dato target senza alcuno standard o riferimento. Utilizzando la dd-PCR, è anche possibile valutare le efficienze di trasduzione degli AAV mediante quantificazione assoluta dei numeri di copia del genoma AAV all'interno di una retina iniettata. Qui, forniamo un metodo semplice per quantificare il tasso di trasduzione degli AAV nelle cellule retiniche utilizzando la dd-PCR. Con piccole modifiche, questa metodologia può anche essere la base per la quantificazione del numero di copie del DNA mitocondriale e per valutare l'efficienza dell'editing di base, fondamentale per diverse malattie della retina e applicazioni di terapia genica.

Introduzione

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I virus associati all'adeno (AAV) sono ora comunemente usati per una varietà di studi di terapia genica retinica. Gli AAV forniscono un modo sicuro ed efficiente di consegna genica con meno immunogenicità e meno integrazioni del genoma. L'ingresso di AAV nella cellula bersaglio avviene attraverso l'endocitosi, che richiede il legame di recettori e co-recettori sulla superficie cellulare1,2. Pertanto, l'efficienza di trasduzione degli AAV per diversi tipi di cellule dipende principalmente dal capside e dalle sue interazioni con i recettori delle cellule ospiti. Gli AAV hanno sierotipi e ogni sierotipo può avere tropismi cellulari / tissutali distinti ed efficienze di trasduzione. Esistono anche sierotipi e varianti AAV artificiali generati dalla modifica chimica del capside virale, dalla produzione di capsidi ibridi, dall'inserimento di peptidi, dal rimescolamento del capside, dall'evoluzione diretta e dalla mutagenesi razionale3. Anche piccoli cambiamenti nella sequenza aminoacidica o nella struttura del capside possono avere un'influenza sulle interazioni con i fattori delle cellule ospiti e provocare diversi tropismi4. Oltre alle varianti di capside, altri fattori come la via di iniezione e la variazione da lotto a lotto della produzione di AAV possono influenzare l'efficienza di trasduzione degli AAV nella retina neuronale. Pertanto, sono necessari metodi affidabili per il confronto dei tassi di trasduzione per diverse varianti.

La maggior parte dei metodi per determinare l'efficienza di trasduzione AAV si basa sull'espressione genica del reporter. Questi includono imaging fluorescente, immunoistochimica, western blot o analisi istochimica del prodotto del gene reporter5,6,7. Tuttavia, a causa del vincolo dimensionale degli AAV, non è sempre possibile includere geni reporter per monitorare l'efficienza di trasduzione. L'uso di promotori forti come l'ibrido CMV enhancer/chicken beta-actin o Woodchuck hepatitis post-transcriptional regulatory element (WPRE) come sequenza di stabilizzatori di mRNA complica ulteriormente il problema delle dimensioni8. Pertanto, sarà anche utile definire il tasso di trasduzione degli AAV iniettati con una metodologia più diretta.

La PCR a goccia digitale (dd-PCR) è una potente tecnica per quantificare il DNA bersaglio da piccole quantità di campioni. La tecnologia dd-PCR dipende dall'incapsulamento del DNA bersaglio e dalla miscela di reazione PCR da parte di goccioline d'olio. Ogni reazione dd-PCR contiene migliaia di goccioline. Ogni goccia viene elaborata e analizzata come reazione PCR indipendente9. L'analisi delle goccioline consente di calcolare il numero assoluto di copie delle molecole di DNA bersaglio in qualsiasi campione semplicemente utilizzando l'algoritmo di Poisson. Poiché l'efficienza di trasduzione degli AAV è correlata al numero di copie dei genomi AAV nella retina neuronale, abbiamo usato il metodo dd-PCR per quantificare i genomi AAV.

Qui, descriviamo una metodologia dd-PCR per calcolare l'efficienza di trasduzione di vettori AAV dal DNA genomico retinico6,10. In primo luogo, gli AAV che esprimono il reporter tdTomato sono stati generati utilizzando il protocollo su piccola scala e titered dal metodo dd-PCR11. In secondo luogo, gli AAV sono stati iniettati per via intravitreale nella retina neuronale. Per dimostrare l'efficienza di trasduzione, abbiamo prima quantificato l'espressione di tdTomato utilizzando la microscopia fluorescente e il software ImageJ. Questo è stato seguito dall'isolamento del DNA genomico per la quantificazione dei genomi AAV nelle retine iniettate utilizzando la dd-PCR. Il confronto dei livelli di espressione di tdTomato con i genomi AAV trasdotti quantificati dalla dd-PCR ha mostrato che il metodo dd-PCR ha quantificato accuratamente l'efficienza di trasduzione dei vettori AAV. I nostri protocolli hanno dimostrato una descrizione dettagliata di una metodologia basata su dd-PCR per quantificare le efficienze di trasduzione AAV. In questo protocollo, mostriamo anche il numero assoluto di genomi AAV che vengono trasdotti dopo iniezioni intravitreali semplicemente utilizzando il fattore di diluizione dopo l'isolamento del DNA genomico e i risultati della dd-PCR. Nel complesso, questo protocollo fornisce un metodo potente, che sarebbe un'alternativa all'espressione del reporter per quantificare le efficienze di trasduzione dei vettori AAV nella retina.

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Protocollo

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Tutti i protocolli sperimentali sono stati accettati dal comitato etico dell'Università Sabanci e gli esperimenti sono stati condotti in conformità con la dichiarazione di "The Association for Research in Vision and Ophthalmology" per l'uso di animali nella ricerca

1. Produzione AAV su piccola scala12

  1. Colture di cellule HEK293T utilizzando piastre da 15 cm in 10 ml completi di DMEM/10% FBS fino al 70-80% di confluenza.
  2. Preparare la miscela di trasfezione con 20 μg di plasmide helper (pHGT1-Adeno1), 7 μg di plasmide capside e 7 μg di vettore AAV2-CBA-tdTomato-WPRE e 136 μL di soluzione di PEI (1 mg/mL) in 5 mL di DMEM.
  3. Aggiungere la miscela di trasfezione preparata da 5 mL in una capsula di coltura cellulare contenente 10 mL di terreno di coltura e incubare le cellule trasfettate per 48-60 ore a 37 °C.
  4. Raccogliere il fluido a 48-60 ore dopo la trasfezione e digerirlo con DNasi I ad una concentrazione finale di 250 U/mL per 30 min a 37 °C.
  5. Centrifugare il mezzo digerito a 4000 x g,4 °C per 30 minuti e quindi filtrarlo con un filtro a siringa da 0,22 μm nella membrana di cellulosa rigenerata pre-bagnata per 100 kDa.
  6. Centrifugare la membrana di cellulosa rigenerata a 4000 x g,4 °C per 30 min ed eliminare il mezzo.
  7. Lavare e centrifugare la membrana di cellulosa rigenerata con PBS contenente 0,001% Pluronic F-68 tre volte a 4000 x g,4 °C per 30 min. Scartare il PBS ad ogni passaggio.
  8. Raccogliere AAV concentrati dalla parte superiore della membrana di cellulosa rigenerata e aliquota per ulteriori usi.
  9. Digerire 5 μL di AAV appena fatto con DNasi I (0,2U/μl) per 15 min a 37 °C per la titolazione. Segue un'incubazione di 10 minuti a 95 °C sia per inattivare la DNasi I che per degradare i capsidi virali.
  10. Preparare una diluizione seriale di 10 volte da AAV digeriti utilizzando lo 0,05% di Pluronic F-68. Utilizzare i primer AAV2-ITR e WPRE per la titolazione (Tabella 1). I titoli sono stati calcolati moltiplicando i risultati della dd-PCR con i fattori di diluizione. I risultati sono stati convertiti in copia del genoma / mL (GC / mL).
    NOTA: le concentrazioni di AAV per la produzione di AAV su piccola scala dovrebbero essere di circa 1 x 1012 GC / mL. Questo protocollo non è applicabile per i ceppi AAV che non rilasciano in modo efficiente AAV in supporti come AAV213.

2. Iniezione intravitreale di AAV

  1. Preparazione dell'attrezzatura
    1. Prima di iniziare, preparare una microsiringa da 10 μL con un ago smussato da 36 G. Risciacquare cinque volte con etOH al 70%, cinque volte in ddH2O e infine cinque volte con PBS.
    2. Caricare la quantità appropriata di AAV nella microsiringa per ogni iniezione.
    3. Preparare l'ago chirurgico (sutura, seta, 6/0), nastro, pinza e forbici.
  2. Iniezione intravitreale
    1. Applicare 1 goccia di tropicamide allo 0,5% e al 2,5% di fenilefrina cloridrato (ad es. Midfrina) contenente collirio prima dell'anestesia per dilatare le pupille.
    2. Anestetizzare i topi con isoflurano 5% (1 L/min) e continuare con isoflurano all'1,5% (1 L/min) durante la procedura. Una piccola camera isoflurano viene utilizzata per la prima induzione.
    3. Verificare la profondità dell'anestesia con la perdita del riflesso di raddrizzamento, il riflesso di astinenza e la risposta al pizzico della coda.
    4. Applicare 0,3% di tobramicina e 0,1% di desametasone soluzione oftalmica sterile su ciascun occhio prima della procedura di iniezione. L'applicazione del collirio previene la secchezza ed esercita effetti antinfiammatori e antibatterici.
    5. Utilizzare il gancio chirurgico per stabilizzare la palpebra superiore. Tirare leggermente indietro per esporre la parte dorsale dell'occhio. Fissare il gancio alla panca per tenerlo in posizione.
    6. Rimuovere la congiuntiva (meno di 1 mm2) con le forbici dell'iride curva per esporre la sclera dell'occhio sotto il microscopio di dissezione. Utilizzare una siringa da insulina fresca e sterile (30 G) per perforare la sclera.
    7. Inserire l'ago della microsiringa attraverso la stessa puntura utilizzando un micromanipolatore. Posizionare la punta dell'ago dietro la lente al centro della oculare.
    8. Iniettare 1 μL di AAV2/BP2 e AAV2/PHP. Vettori S con concentrazioni di 1,63 x10 12 GC/mL e 1,7 x 1012 GC/mL lentamente nel vitreo dell'occhio. Il controllo del volume di iniezione viene eseguito manualmente. Lasciare l'ago in posizione per 1 minuto e prelevare lentamente l'ago.
    9. Rilasciare la palpebra e applicare un trattamento topico anti-infiammatorio e antibatterico con gel contenente lo 0,3% di tobramicina e lo 0,1% di desametasone sul oculare. Monitorare e valutare i topi nei giorni successivi in base al foglio di punteggio in termini di aspetto (occhi luminosi, pelo curato, curvatura), comportamento (attività, immobilizzazione, automutilazione) e peso corporeo su una scala da 0 a 3. Ogni condizione ha un punteggio da 0-3 e un punteggio totale di 3 o superiore è un criterio di terminazione.
    10. Metti gli animali nella gabbia dopo il recupero.

3. Imaging a fluorescenza e fondo oculare

  1. Filtrare il topo e dilatare la pupilla posizionando gocce di 0,5% di tropicamide e 2,5% di fenilefrina cloridrato in ciascun occhio.
  2. Anestetizzare l'animale con la procedura di cui sopra con isoflurano. Valutare attentamente la profondità dell'anestesia pizzicando le zampe.
  3. Posizionare il mouse sullo stadio di imaging e verificare la corretta dilatazione controllando attraverso la fotocamera del fondo oculare. Applicare gel topico (0,2% carbomer 980) sulla superficie degli occhi per proteggere gli occhi dalla disidratazione in anestesia e per utilizzarlo come gel di accoppiamento per l'imaging.
  4. Manipolare la fase di imaging per allinearla con il nasello dell'obiettivo. Regolare lo stage in base alle esigenze per centrare l'occhio del mouse. Una volta che l'occhio è centrato, sposta lentamente l'obiettivo fino a quando non entra in contatto con l'occhio.
  5. Eseguire l'imaging del fondo e della fluorescenza su entrambi gli occhi per seguire l'espressione di tdTomato a 1 settimana e 2 settimane dopo l'iniezione intravitreale (Figura 3B)14. Prendi immagini di fondo e fluorescenza con impostazioni identiche per il confronto dell'espressione del reporter.

4. Isolamento della retina

  1. Eutanasia degli animali dopo l'imaging del fondo e della fluorescenza mediante inalazione di CO2 per la raccolta della retina a 2 settimane di tempo.
  2. Sposta il bulbo oculare in avanti con l'aiuto di una pinza splitter da 13,5 cm.
  3. Rimuovere la lente insieme al vitreo rimanente applicando una leggera pressione con la pinza.
  4. Tagliare la connessione del bulbo oculare al nervo ottico con pinze curve di precisione e spremere delicatamente la retina con la stessa pinza curva.
  5. Trasferire le retine sezionate in un tubo di microcentrifuga.
  6. Snap congelare la retina posizionando i tubi nell'azoto liquido.

5. Isolamento del DNA genomico tissutale

  1. Isolare il DNA genomico con un kit di DNA genomico tissutale basato sulla digestione della proteinasi K commercializzato.
  2. Digerire la retina a 55 °C, 200 x g per 30 minuti con la Proteinasi K, già fornita nel kit.
  3. Eseguire la fase di incubazione della RNasi, le fasi di lavaggio con tampone di lavaggio I e II e infine la fase di eluizione secondo il protocollo del produttore.
  4. Aggiungere un ulteriore passaggio di centrifuga dopo l'ultimo lavaggio per rimuovere l'etanolo residuo.
  5. Misurare la concentrazione di DNA genomico e conservare i campioni a -20 °C.

6. Analisi PCR digitale a goccia di campioni di retina di topo per la quantificazione dei genomi virali

  1. Diluire i DNA genomici dalle retine iniettate in soluzione di F-68 pluronico allo 0,05% per raggiungere una concentrazione finale di 1 ng/μL per ciascun campione.
  2. Eseguire reazioni separate per WPRE e 18S utilizzando primer specifici target con una concentrazione finale di 125 nM per ciascun primer.
  3. Eseguire la generazione di goccioline in un mix di reazione PCR da 20 μL, tra cui 1 ng di DNA genomico, 125 nM primer e 2x evagreen supermix.
  4. Caricare la miscela di campioni nella parte centrale della cartuccia per la generazione di goccioline.
  5. Dopo aver effettuato il caricamento del campione sulla cartuccia, aggiungere 70 μL di olio di generazione di gocce nella fila inferiore della cartuccia.
  6. Mettere la guarnizione sopra la cartuccia e posizionarla nel generatore di gocce. Assicurarsi che non vi sia spazio tra la guarnizione e la cartuccia.
  7. Prelevare delicatamente circa 40 μL di goccioline che vengono generate nel pozzetto superiore. Aggiungere la soluzione di goccioline alla piastra di reazione PCR semi-gonna a 96 pozzetti.
  8. Sigillare la piastra PCR con il sigillante a piastre PCR utilizzando un foglio di tenuta in alluminio.
  9. Posizionare la piastra PCR in un termociclatore termosaldato a 96 pozzetti. Utilizzare il protocollo PCR; 95 °C per 5 min, 40 cicli di 95 °C per 30 s, 60 °C per 1 min, 4 °C per 5 min, 90 °C per 5 min e 4 °C di tenuta infinita. Applicare una velocità di rampa di 2 °C/s ad ogni ciclo per garantire che le goccioline raggiungano la temperatura corretta per ogni passo durante il ciclo
  10. Posizionare la piastra PCR nel lettore di gocce per quantificare le goccioline utilizzando il software dd-PCR. Un modello viene configurato utilizzando impostazioni specifiche per evagreen.
  11. Analizza i dati utilizzando un grafico grafico 1D con ciascun campione per l'intensità di fluorescenza rispetto al numero di goccioline. Il valore di soglia è disposto in modo che le goccioline sopra la soglia siano assegnate come positive e quelle inferiori come negative. Segue l'applicazione dell'algoritmo di Poisson per determinare la concentrazione iniziale del DNA bersaglio in unità di copie/μL. Il rapporto tra WPRE e 18S viene calcolato per misurare l'efficienza di trasduzione AAV.

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Risultati

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La produzione di AAV su piccola scala è un metodo veloce ed efficiente che fornisce vettori per iniezioni intravitreali (Figura 1). La produzione di AAV su piccola scala di solito fornisce titoli nell'intervallo 1 x 1012 GC / ml che è sufficiente per rilevare l'espressione del reporter nella retina (Figura 2). Il titering di AAV utilizzando dd-PCR dà risultati coerenti. I primer specifici ITR2 e WPRE vengono utilizzati di routine e la concentrazione i...

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Discussione

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In questo protocollo, abbiamo generato due vettori AAV che hanno diverse proteine del capside e poi li abbiamo titolati di conseguenza. Uno dei passaggi più cruciali di questo protocollo è quello di produrre quantità sufficienti di AAV che produrranno un'espressione reporter rilevabile dopo la trasduzione12,13.

Il titering degli AAV è anche un fattore importante per regolare i dosaggi di AAV per le iniezioni intravitreali. Una volta...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Vorremmo ringraziare Oezkan Keles, Josephine Jüttner e il Prof. Botond Roska, Istituto di Oftalmologia Molecolare e Clinica di Basilea, Complex Viruses Platform per il loro aiuto e supporto per la produzione di AAV. Vorremmo anche ringraziare il Prof. Jean Bennett, Perelman School of Medicine, l'Università della Pennsylvania per il ceppo AAV8 / BP2. Il lavoro sugli animali viene eseguito presso la struttura per animali della Gebze Technical University. Per questo, ringraziamo Leyla Dikmetas e il Prof. Uygar Halis Tazebay per l'assistenza tecnica e il supporto alla zootecnia. Vorremmo anche ringraziare la dottoressa Fatma Ozdemir per i suoi commenti sul manoscritto. Questo lavoro è supportato da TUBITAK, grant numbers 118C226 e 121N275, e Sabanci University Integration grant.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piastre ddPCR semi-bordate a 96 pozzettiBioRad12001925ddPCR
Filtro AmiconMilliporeUFC910096AAV
C1000 TOUCH 96 POZZETTI PROFONDIBioRad1851197ddPCR
C57BL/6JRj ceppo di topiJanvierC57BL/6JRj
Guarnizioni DG8 CartucceBioRad1863009ddPCR
DG8BioRad1864008ddPCR
DMEMLonzaBE12-604QAAV
DPBSPAN BIOTECHL 1825AAV
Olio per la generazione di goccioline eva verdeBioRad1864006ddPCR
Olio per lettore di gocceBioRad1863004ddPCR
FBSPAN BIOTECHp30-3306AAV
Guarnizioni in lamina per PX1 Sigillante per piastre PCRBioRad1814040ddPCR
Siringhe per insulinaBD Medical320933Iniezione intravitreale
IsofluranoADEKA ILAC SANAYI VE TICARETanestetico
Microiniettore MM33World Precision Instruments82-42-101-0000Iniezione intravitreale
Micron IVPhoenix Research LabsMicron IVIl sistema di microscopia basato su una fotocamera a colori a 3 CCD, un frame grabber e un software standard consente ai ricercatori di visualizzare le retine dei topi.
Mydfrin (%2,5 fenilefrina cloridrato)AlconS01FB01dilatazione pupillare
Nanofil siringa 10 μ lWorld Precision InstrumentsNANOFILAgo per iniezione intravitreale
RN G36, 25 mm, PST 2World Precision InstrumentsNF36BL-2Iniezione intravitreale
PEI-MAXPolyscience24765-1AAV
Penicillina-StreptomicinaPAN BIOTECHP06-07100AAV
Plasmide pHGT1-Adeno1PlasmidFactoryPF1236AAV
Pluronic F-68Gibco24040032AAV
PX1 PCR Sistema di sigillatura per piastreBioRad1814000ddPCR
QX200 ddPCR EvaGreen SupermixBioRad1864034ddPCR
QX200 Lettore di gocce/Generatore di gocce QX200BioRad1864001ddPCR
SPLITTER FORCEP WATCHER
MAKER - LUNGHEZZA = 13,5 CM		endostallo medicoEJN-160-0155
Filtro per siringa sterile per isolamentoAISIMOASF33PS22SKit DNA
genomico tissutaleEcoSpinE1070Isolamento del gDNA
Tobradex (0,3% tobramicina / 0,1% desametasone)AlconS01CA01antinfiammatorio / antibiotico
Tropamide (% 0,5 tropicamide)Bilim Ilac Sanayi ve Ticaret AS.S01FA06dilatazione pupillare
TurbonucleaseAccelagenN0103LAAV
Viscotears (carbomer 2 mg/g)Bausch+LombS01XA20lubrificante collirio
N01AB06 della retina AAV

Riferimenti

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