Abbiamo simulato la chirurgia clinica per stabilire un protocollo di anastomosi diretta dei nervi bilaterali del plesso brachiale attraverso la via prespinale nei topi, contribuendo allo studio dei meccanismi neurali alla base della riabilitazione dopo il trasferimento nervoso incrociato dopo lesioni del sistema nervoso centrale e periferico.
Articolo metodologico
Un modello murino di anastomosi diretta attraverso la via prespinale per l'intervento chirurgico di trasferimento nervoso incrociato
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'intervento chirurgico di trasferimento del nervo incrociato è stato un approccio potente per la riparazione degli arti superiori feriti nei pazienti con lesioni da avulsione del plesso brachiale. Recentemente, questo intervento chirurgico è stato applicato in modo creativo nel trattamento clinico delle lesioni cerebrali e ha ottenuto una sostanziale riabilitazione del braccio paralizzato. Questo recupero funzionale dopo l'intervento chirurgico suggerisce che l'intervento sensomotorio periferico induce una profonda neuroplasticità per compensare la perdita di funzionalità dopo un danno cerebrale; Tuttavia, il meccanismo neurale sottostante è poco compreso. Pertanto, è necessario un modello animale clinico emergente. Qui, abbiamo simulato la chirurgia clinica per stabilire un protocollo di anastomosi diretta dei nervi bilaterali del plesso brachiale attraverso la via prespinale nei topi. Esperimenti neuroanatomici, elettrofisiologici e comportamentali hanno contribuito a identificare che i nervi trasferiti di questi topi hanno reinnervato con successo l'arto anteriore compromesso e hanno contribuito ad accelerare il recupero motorio dopo una lesione cerebrale. Pertanto, il modello murino ha rivelato i meccanismi neurali alla base della riabilitazione dopo il trasferimento del nervo incrociato dopo lesioni del sistema nervoso centrale e periferico.
Introduzione
Il plesso brachiale (BP) è costituito da cinque nervi con diversi segmenti spinali (C5-T1) responsabili della sensazione e del movimento del braccio, della mano e delle dita. Dopo l'uscita di questi cinque nervi BP dal midollo spinale, si fondono per formare tre tronchi nervosi: il superiore (formato dalla fusione di C5 e C6), mediale (da C7) e inferiore (rami di C8 e T1). Le lesioni gravi, soprattutto a causa di incidenti stradali, spesso portano all'avulsione delle radici nervose della pressione arteriosa e tale disfunzione ha un effetto devastante sui pazienti1. Come potente approccio clinico, è stato eseguito un intervento chirurgico di trasferimento del nervo incrociato per riparare le lesioni da avulsione alla pressione arteriosa ricollegando le estremità nervose lesionate al lato sano della pressione arteriosa 2,3. Questo intervento chirurgico si traduce in miglioramenti funzionali delle mani lesionate e nella riorganizzazione diretta della corteccia sensomotoria in entrambi gli emisferi nei pazienti4. Gli studi sugli animali hanno rivelato che una drastica riorganizzazione nei circuiti corticali è stata indotta dopo aver attraversato il trasferimento nervoso5. Poiché la modificazione sensomotoria periferica può riattivare la plasticità dormiente del cervello maturo, anche la chirurgia di trasferimento del nervo incrociato mostra un grande potenziale nella riparazione delle lesioni cerebrali6.
Recentemente, abbiamo confermato la possibilità dell'uso creativo del trasferimento nervoso incrociato come nuova strategia di cambiamento dei nervi periferici per i problemi con il sistema nervoso centrale. Un tipo di intervento chirurgico di trasferimento del nervo incrociato, il trasferimento controlaterale del settimo nervo cervicale (CC7), è stato applicato per ottenere un significativo recupero funzionale del braccio paralizzato trasferendo il nervo C7 dal lato non paralizzato al lato paralizzato nel paziente dopo una lesione cerebrale7. Una caratteristica unica di questa operazione chirurgica è che i segnali sensoriali e motori dell'arto superiore paralizzato comunicavano all'emisfero controlesionale attraverso il nervo spostato "incrocio sinistra-destra". In particolare, il recupero funzionale causato dalla chirurgia CC7 non si limita alla funzione innervata dal nervo C7 stesso8. Inoltre, la chirurgia CC7 può essere utilizzata non solo per trattare i bambini con paralisi cerebrale, ma anche per ottenere la riabilitazione in pazienti di mezza età e anziani colpiti da ictus. Pertanto, ci sono ragioni sufficienti per credere che il trasferimento nervoso incrociato possa stimolare la neuroplasticità per accelerare il recupero motorio dal danno cerebrale modulando il sistema sensomotorio periferico.
Sebbene la chirurgia di trasferimento del nervo incrociato abbia raggiunto una sostanziale riabilitazione nel trattamento clinico sia delle lesioni del plesso brachiale (BPI) che delle lesioni cerebrali, i meccanismi neurali alla base di questo intervento chirurgico rimangono poco compresi. La mancanza di un modello animale adatto con caratteristiche cliniche ha limitato lo studio dei meccanismi interni. Tradizionalmente, in clinica, la radice nervosa C7 controlaterale alla lesione viene trasferita sul lato danneggiato attraverso un innesto nervoso (ad es. nervo ulnare, nervo surale o nervo safeno) e collegata al plesso brachiale interessato (ad es. nervo mediano, radice C7 o tronco inferiore)2,3,9. Una modifica relativamente nuova di questo intervento chirurgico prevede che la radice C7 non interessata venga trasferita direttamente al nervo C7 interessato attraverso la via prespinale senza alcuna lacuna, suggerendo una soluzione ottimale7. Attualmente, i topi mostrano un vantaggio nella specificità del tipo di cellula e nella diversità dei ceppi genetici e sono più adatti a studiare i meccanismi neurofisiologici. Pertanto, è stata simulata la chirurgia clinica per stabilire un protocollo per l'anastomosi diretta delle radici nervose bilaterali C7 attraverso la via prespinale nei topi e contribuire allo studio dei meccanismi neurali alla base della riabilitazione dopo il trasferimento del nervo incrociato.
Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura degli Animali da Esperimento dell'Università di Fudan e dall'Accademia Cinese delle Scienze in conformità con le linee guida dell'Istituto Nazionale di Sanità. Sono stati utilizzati topi maschi adulti C57BL/6N di otto settimane.
1. Configurazione preoperatoria
- Garantire una scorta adeguata di strumenti chirurgici sterilizzati in autoclave, attrezzature, farmaci analgesici e farmaci anestetici.
- Garantire uno spazio di lavoro adeguato su un tavolo operatorio.
- Prepara il tavolo operatorio utilizzando una tavola in schiuma chirurgica personalizzata rivestita di pannolini come letto per il topo. Fissare un cuscinetto riscaldante al pannello di schiuma con nastro adesivo medico ricoperto da una garza sterile.
- Crea divaricatori piegando un ago per agopuntura usando una pinza vascolare, piegandolo a metà e poi piegando la punta dell'ago per agopuntura piegato in un gancio. Fissare una striscia di gomma all'estremità dell'ago per agopuntura e utilizzare una puntina da disegno per fissare l'estremità della striscia di gomma alla tavola di schiuma.
- Calibrare lo stereomicroscopio; Scegliere uno stereomicroscopio con una distanza di messa a fuoco adeguata. Coprire i pulsanti di zoom/messa a fuoco con un foglio di alluminio sterilizzato per consentire al chirurgo di regolarli durante l'operazione. Il foglio di alluminio sterilizzato è stato posizionato sui pulsanti di zoom/messa a fuoco consentendo al chirurgo di utilizzarlo con guanti sterili.
2. Anestesia e preparazione del topo
- Pesare il topo e anestetizzare in base al peso corporeo (isoflurano 3%). Assicurarsi che il topo non risponda quando gli spazi interdigitali della zampa vengono pizzicati per confermare la profondità dell'anestesia. Per tutta la durata della procedura deve essere mantenuta un'adeguata profondità dell'anestesia (isoflurano all'1%).
- Applicare l'unguento oftalmico bilateralmente sugli occhi per prevenire l'irritazione o la secchezza della cornea durante l'intervento chirurgico.
- Preparare il sito chirurgico rasando il pelo sul collo e sul petto con un tagliacapelli automatico. Rimuovere e pulire i capelli sciolti.
- Posizionare il mouse in posizione supina sul tappetino riscaldante coperto da una garza sterile. Mantenere la temperatura del mouse a 37 °C durante l'intera operazione. Fissare il topo con del nastro adesivo per far sì che gli arti anteriori si abducano orizzontalmente e impediscano agli arti posteriori e alla coda di muoversi. Sui topi è stato posizionato un telo chirurgico monouso sterilizzato con un'apertura appropriata.
3. Procedura operativa
- Iniettare tramadolo come analgesia preventiva (20 mg/kg, i.p.). Segna l'incisione trasversale sul bordo superiore della clavicola. Utilizzare tre cicli di scrub alternati di soluzione disinfettante iodofora ed etanolo per disinfettare il sito chirurgico. Confermare la profondità dell'anestesia con un pizzicotto del dito del piede prima dell'intervento chirurgico.
- Lavorando al microscopio, praticare un'incisione trasversale di 4 mm lungo il segno utilizzando un bisturi sterile. Allargare l'incisione durante la procedura, se necessario.
- Sezionare senza mezzi termini attraverso la fascia sottocutanea e identificare il bordo inferiore della ghiandola sottomandibolare. Tirare la ghiandola sottomandibolare verso l'alto per esporre la fossa sopraclavicolare e lo sterno.
NOTA: Potrebbero esserci vasi sanguigni di piccolo calibro in quest'area. L'elettrocauterizzazione può essere utilizzata per fermare l'emorragia. - Eseguire un'incisione sternotomica mediana parziale (~4 mm) incidendo lo sterno dalla testa alla coda lungo la linea mediana. Proteggere la pleura, il cuore e i vasi sanguigni durante la sternotomia.
- Identifica il muscolo sternoioideo. Tira delicatamente lo sterno con due piccoli divaricatori personalizzati fatti di aghi per agopuntura e identifica il muscolo sternoioideo, sopra la trachea e l'esofago. Ritrarre questo muscolo per esporre l'arteria carotide, la vena giugulare interna, il nervo frenico, il nervo vago, la trachea e l'esofago.
NOTA: Ritrarre delicatamente lo sterno per evitare lo pneumotorace aperto. A differenza degli esseri umani, l'esofago del topo non si trova dietro la trachea ma adiacente alla trachea sul lato sinistro. - Identificare il plesso brachiale sinistro. Sul bordo laterale della vena giugulare interna sinistra, tirare la fascia e il tessuto adiposo verso l'esterno per esporre il plesso brachiale. Cerca il tronco superiore, composto dai nervi C5 e C6, che ha tre rami. Identificare il tronco medio composto dal nervo C7 e il tronco inferiore composto dai nervi C8 e T1, lungo il tronco superiore fino alla coda del topo.
NOTA: Ci sono vasi sanguigni longitudinali sulla superficie del plesso brachiale. Utilizzare l'elettrocauterizzazione per prevenire il sanguinamento. Quando si separa il plesso brachiale sinistro, proteggere il canale chiloso per evitare una fistola chilosa. - Raccogli il nervo C7 sinistro. Sezionare la divisione anteriore e la divisione posteriore del tronco medio (nervo C7) distalmente al livello della divisione-cordone sotto la clavicola e bloccare il nervo C7 con 0,1 mL di lidocaina al 2% mediante infusione locale nel tronco nervoso. Resecare il nervo C7 con le forbici a molla vannas nei suoi punti di fusione con il midollo laterale e il midollo posteriore. Taglia il nervo C7 in modo che la lunghezza di ogni divisione sia simile.
NOTA: Le divisioni anteriore e posteriore del nervo C7 e le divisioni anteriore e posteriore dei tronchi superiori e inferiori corrono per una lunga distanza prima della confluenza, quindi il nervo C7 deve essere liberato a sufficienza prima della resezione. Infatti, il nervo C7 non è sempre diviso in due divisioni; A volte è diviso in tre divisioni o addirittura in quattro in rari casi. - Rimuovere la lamina ventralis C6 sinistra. Proteggere con cura il nervo frenico e sedurre il muscolo scaleno anteriore a livello del segmento C6 per esporre la radice nervosa C7. Tagliare piccoli rami del nervo C7 innervando il muscolo paraspinale con micropinze. Estrarre delicatamente il nervo C7 e asportare con cautela la lamina ventrale C6.
NOTA: C'è una prominenza ossea tra il lato mediale dell'arteria carotide sinistra e il lato laterale dell'esofago. Questa prominenza ossea è la lamina ventralis della 6avertebra cervicale . Il muscolo longitudinale del bordo laterale della lamina ventralis C6 è il muscolo scaleno anteriore e il nervo frenico corre sulla superficie del muscolo scaleno anteriore. - Raccogli il nervo C7 destro. Grave il muscolo scaleno anteriore sul lato destro, simile al lato sinistro, e sezionare la radice nervosa C7 destra vicino al forame intervertebrale. Sezionare il nervo C7 destro dal suo livello di divisione.
NOTA: Tagliare con cura il nervo C7 destro per evitare danni ai vasi sanguigni sotto il nervo. - Trasferisci il nervo C7 sinistro.
- Rimuovere il muscolo lungo colli accanto ai corpi vertebrali parzialmente su entrambi i lati. Separare ed espandere senza mezzi termini lo spazio tra la trachea-esofago e il corpo vertebrale.
- Inviare una mezza piega 5-0 di suture in nylon dal lato destro del corpo vertebrale al lato sinistro attraverso la via prespinale.
- Agganciare il nervo C7 sinistro con un tubo di infusione e guidare il nervo verso il lato destro attraverso la via prespinale.
- Ritrarre delicatamente la trachea e l'esofago e collegare le divisioni anteriore e posteriore del nervo C7 sinistro alla radice nervosa C7 destra senza tensione utilizzando suture in nylon 12-0. Suturare l'epinevrio attorno ai nervi con 4-5 punti di sutura per coaptare fortemente i nervi.
NOTA: È fondamentale scegliere un tubo di infusione in plastica di spessore adeguato. Un tubo troppo sottile potrebbe danneggiare il nervo e un tubo troppo spesso potrebbe danneggiare la trachea e l'esofago. Inoltre, lo spazio tra la trachea-esofago e il corpo vertebrale è uno spazio a forma di "V" e il taglio di parte del lungo collo muscolare può accorciare la via di trasferimento.
4. Chiusura della ferita
- Irrigare la ferita con soluzione fisiologica normale sterile e asciugarla con una garza sterile.
- Suturare lo sterno e chiudere la pelle utilizzando suture monofilamento 5-0.
5. Cure postoperatorie
- Aspetta che il topo si svegli dall'anestesia. Trasferisci il topo in una gabbia pulita senza materiale da lettiera ma riscaldata con una coperta riscaldante. Osserva il topo finché non è deambulante. Utilizzare il tramadolo (20 mg/kg, i.p.) come analgesia postoperatoria.
- Metti i topi in una gabbia di recupero e monitorala fino al recupero. Ripristinare l'acqua e la dieta dei topi dopo l'operazione. Monitora i topi dopo l'intervento ogni giorno per segni di compromissione o infezione, tra cui malnutrizione, postura curva e pelo arruffato. A due settimane dall'intervento chirurgico, dovrebbe avvenire la rimozione dei punti di sutura.
NOTA: Applicare l'unguento all'eritromicina sulla superficie della ferita ogni giorno per tre giorni consecutivi. - Se si osservano complicazioni, come l'edema della ferita, queste devono essere immediatamente risolte.
6. Analisi comportamentale
NOTA: Tutti i test e le analisi comportamentali sono stati eseguiti da un osservatore cieco rispetto ai gruppi sperimentali.
- Test del cilindro
NOTA: Il test del cilindro valuta l'uso degli arti anteriori durante l'esplorazione verticale spontanea all'interno di un cilindro a 4 e 8 settimane dopo l'intervento chirurgico21.- Posiziona i topi in un cilindro trasparente (diametro 9 cm, altezza 15 cm) su una cornice rialzata.
- Per facilitare l'osservazione e la registrazione, fissare uno specchio con un angolo di 45° sotto il cilindro.
- Registrare l'allevamento spontaneo di ciascun topo osservato con l'aiuto dello specchio per 10 minuti.
- Determinare manualmente il periodo di tempo durante il quale (i) la zampa destra, (ii) la zampa sinistra o (iii) entrambe le zampe sono entrate in contatto con le pareti di vetro. Conta un totale di 20 movimenti durante ogni sessione. Escludere dall'analisi i topi che non sono attivi durante il test.
- Assegna un punteggio alle prestazioni del test come:
- Test di camminata sulla griglia
NOTA: Il test della camminata a griglia valuta l'esatto posizionamento delle zampe anteriori sui pioli di una griglia durante l'esplorazione spontanea a 4 e 8 settimane dopo l'intervento chirurgico. 22.- Posiziona i mouse su una griglia metallica (20 cm x 24 cm) con fori quadrati da 25 mm e lascia che esplorino liberamente per 10 minuti mentre registrano la loro performance con una videocamera.
- Segna una scivolata del piede nel caso di uno dei seguenti casi:
- Cerca i casi in cui la zampa manca completamente un piolo (nel qual caso l'arto cade tra i pioli e l'animale perde l'equilibrio).
- Cerca i casi in cui la zampa è posizionata correttamente su un piolo ma scivola via mentre sopporta il peso del corpo.
- Esprimere il risultato del test come slittamento del piede dell'arto anteriore destro / slittamento totale del piede. Sebbene né il test del cilindro né il test del camminata sulla griglia richiedano un addestramento, ottieni punteggi di base testando ogni animale una volta prima dell'intervento chirurgico.
Risultati
La lesione cerebrale unilaterale spesso causa una disfunzione permanente dell'arto controlaterale a causa delle limitazioni della plasticità neurale compensativa negli adulti10,11. In precedenza, abbiamo riportato che la chirurgia CC7 potrebbe essere utilizzata per trattare gli arti superiori emiplegici in pazienti adulti dopo lesioni cerebrali7. Per valutare l'efficacia del protocollo per l'anastomosi diretta dei nervi C7 bilaterali attraverso la via prespinale, abbiamo eseguito l'intervento chirurgico di trasferimento del nervo incrociato nei topi a seguito di lesione cerebrale traumatica unilaterale (TBI). La Figura 1 descrive le procedure TBI e verifica l'intervallo e l'effetto del danno. In primo luogo, un impattatore elettrico per la contusione corticale (eCCI) è stato utilizzato per danneggiare la corteccia cerebrale dell'emisfero sinistro (anteroposteriore = da +1,0 mm a -2,0 mm, mediolaterale = da 0,5 mm a 3,5 mm) nei topi adulti per provocare lesioni cerebrali unilaterali. Dopo 2 settimane, le strutture anatomiche hanno confermato che questo protocollo di trauma cranico ha quasi distrutto la corteccia sensomotoria, una posizione importante per l'avvio dei movimenti. Questi topi con trauma cranico unilaterale hanno mostrato difetti motori significativi dell'arto anteriore destro.
La Figura 2 descrive le procedure CC7. Il diagramma del percorso della chirurgia CC7 ha rivelato che il percorso A, che rappresenta la via prespinale, era l'approccio più breve rispetto agli altri. La lunghezza del percorso A è ancora inferiore alla lunghezza del nervo C7 prelevato sul lato sinistro (lato non paralizzato). Questa scoperta ha fornito la base anatomica per la scelta della via prespinale per completare l'intervento chirurgico di trasferimento del nervo. L'intervento chirurgico CC7 è stato eseguito in anastomosi diretta per via prespinale a due settimane dal trauma cranico. Il nervo cervicale 7 (C7) sul lato non paralizzato è stato trasferito direttamente sul lato paralizzato invece di creare le sue connessioni cerebrali originali. La Figura 3 mostra i risultati della microscopia elettronica che hanno rivelato che il nervo C7 trasferito si è rigenerato con successo. Lo spessore della guaina mielinica del nervo C7 trasferito è aumentato gradualmente, a partire da 4 settimane dopo l'intervento chirurgico CC7, ed è stato quasi paragonabile a quello del gruppo di controllo a 8 settimane dopo l'intervento chirurgico CC7. La Figura 4 identifica la reinnervazione muscolare del nervo C7 trasferito utilizzando registrazioni elettromiografiche. L'anastomosi indotta in modo stabile dall'anastomosi dell'estremità prossimale del nervo C7 stimola i potenziali d'azione in più muscoli dell'arto anteriore interessato a 4 settimane dall'intervento, in accordo con i risultati della microscopia elettronica. La Figura 5 mostra che il nervo C7 trasferito contiene fibre motorie dal corno ventrale e fibre sensoriali dai gangli della radice dorsale del segmento C7 del midollo spinale sul lato sano attraverso l'etichettatura retrograda della subunità B (CTB) della tossina del colera.
La Figura 6 mostra che il modello murino ha anche mostrato un significativo recupero motorio dopo un trauma cranico unilaterale, in linea con i risultati degli studi clinici. Per verificare l'effetto della chirurgia CC7 sul recupero della funzione motoria lesa dopo trauma cranico, sono stati stabiliti un gruppo TBI + Sham e un gruppo Control + Sham. I topi del gruppo TBI + Sham e del gruppo TBI + CC7 hanno ricevuto contemporaneamente le stesse procedure per lesioni da trauma cranico, mentre i topi del gruppo Control + Sham hanno ricevuto solo un intervento chirurgico fittizio. Mentre i topi del gruppo TBI + CC7 hanno ricevuto un intervento chirurgico di trasferimento del nervo, i topi del gruppo TBI + sham e del gruppo Control + Sham sono stati sottoposti a resezione bilaterale del nervo cervicale 7 (C7). Nei test sui cilindri, il gruppo TBI + CC7 ha mostrato un tasso di utilizzo significativamente più elevato dell'arto anteriore compromesso rispetto al gruppo TBI sia a 4 che a 8 settimane dall'intervento chirurgico CC7 (p < 0,01). Nei test di griglia, il gruppo TBI + CC7 ha mostrato un tasso di errore inferiore rispetto al gruppo TBI a 4 settimane dopo l'intervento chirurgico CC7. Inoltre, il tasso di errore del gruppo TBI + CC7 era significativamente inferiore a quello del gruppo TBI a 8 settimane dopo l'intervento chirurgico CC7 (p < 0,05). Questi risultati comportamentali hanno mostrato che la chirurgia CC7 potrebbe migliorare la funzione motoria dell'arto colpito nei topi con trauma cranico. Insieme, questi risultati suggeriscono che il nervo C7 trasferito ricostruito dalla chirurgia CC7 attraverso la via prespinale è stato rigenerato con successo e ha reinnervato l'arto anteriore compromesso, contribuendo al ripristino motorio nei topi adulti con trauma cranico unilaterale.
Figura 1: Caratterizzazione della lesione cerebrale traumatica unilaterale. (A) Schema che mostra la posizione del mouse in eCCI. (B) I parametri e l'intervallo di danno dell'eCCI. (C) Sezione coronale rappresentativa che mostra la corteccia lesionata (2 settimane dopo il trauma cranico, barra della scala = 500 μm). Abbreviazione: eCCI = impattatore elettrico per contusione corticale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Il diagramma elementare chirurgico. (A) Diagramma schematico che mostra il disegno sperimentale per l'esecuzione del trasferimento del nervo C7 controlaterale in topi con trauma cranico. Il cerchio rosso mostra la posizione del trauma. La doppia barra rossa all'interno del rettangolo tratteggiato mostra il nervo suturato. (B) Una sezione trasversale mostra tre vie alternative del trasferimento del nervo C7 controlaterale nei topi. Percorso A, la linea blu rappresenta il percorso prespinale del nervo trasferito; Il percorso B, la linea verde, raffigura il percorso pretracheale del nervo trasferito; Il percorso C, la linea rossa, raffigura il tunnel sottocutaneo del nervo trasferito. (C) Il grafico mostra la lunghezza delle vie e il nervo C7 prelevato in (B). La lunghezza del percorso A (3,3 ± 0,10 mm) era significativamente inferiore alla lunghezza del nervo C7 raccolto (4,05 ± 0,11 mm; * p < 0,05, ANOVA unidirezionale, n = 20 in ciascun gruppo). La lunghezza del percorso C (14,15 ± 0,20 mm) era significativamente maggiore di quella del nervo C7 raccolto (*** p < 0,001, ANOVA unidirezionale, n = 20 in ciascun gruppo). La lunghezza del percorso B era di 4,2 ± 0,08 mm (n=20). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: L'analisi al microscopio elettronico di una sezione trasversale del nervo. (A,B) Immagini del nervo nei topi di controllo. Barra della scala = 5 μm (A) e 1 μm (B). (C,D) Immagini del nervo rigenerato un mese dopo l'intervento. Barra graduata = 5 μm (C) e 1 μm (D). (E, F) Immagini del nervo rigenerato a un certo punto cinque mesi dopo l'intervento chirurgico. Barra della scala = 5 μm (E) e 1 μm (F). (G, H) Immagine del nervo rigenerato a due mesi dall'intervento. Barra della scala = 5 μm (G) e 1 μm (H). Ingrandimento di A, C, E e G, 2.000x; ingrandimento di B, D, F e H, 15.000x. (I) Il rapporto G (il rapporto tra il diametro interno e quello esterno della guaina mielinica) è inferiore nei campioni del gruppo di controllo rispetto ai campioni di 4 settimane e uguale ai campioni a 6-8 settimane dopo l'intervento chirurgico (***: p < 0,001; confronto a diversi assoni di gruppo con t-test; n = 3 topi in ciascun gruppo). Abbreviazioni: CC7= trasferimento controlaterale del settimo nervo cervicale; CC7-XW = X settimane dopo l'intervento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: L'analisi elettromiografica dopo il trasferimento del nervo C7 controlaterale indica la velocità di rigenerazione del nervo. (A) Diagramma schematico che mostra la stimolazione del trasferimento elettronico e la registrazione dell'elettromiografia in vivo . L'intensità della stimolazione è stata la stessa per tutto il test (2 mA). Il sito di stimolazione è il nervo C7 prossimale all'anastomosi. (B, C) Fotografie che mostrano il potenziale d'azione registrato al grande pettorale a due settimane (B) e quattro settimane (C) dopo l'intervento chirurgico. (D, E) L'EMG è stato registrato nell'estensore digitorum 4 settimane (D) e 8 settimane (E) dopo l'intervento. (F) A tre settimane, i CMAP sono emersi nel tricipite brachiale. (G) A quattro e otto settimane, i CMAP del tricipite brachiale sono aumentati. (H) L'ampiezza media del grande pettorale ha raggiunto ~0,25 mV ± 0,16 mV a 4 settimane rispetto a 0,45 mV ± 0,03 mV a 8 settimane, mostrando una differenza significativa tra i due punti temporali (*** p < 0,001, t-test, n = 6 in ciascun gruppo). (I) L'ampiezza media del tricipite brachiale ha raggiunto ~0,15 mV ± 0,01 mV a 4 settimane rispetto a 0,46 mV ± 0,02 mV a 8 settimane, mostrando una differenza significativa tra i due punti temporali (***: p < 0,001, t-test, n = 6 in ciascun gruppo). (J) L'ampiezza media dell'estensore digitorum ha raggiunto ~0,11 mV ± 0,01 mV a 4 settimane rispetto a 0,29 mV ± 0,02 mV a 8 settimane, mostrando una differenza significativa tra i due punti temporali (***: p < 0,001, t-test, n = 6 in ciascun gruppo). Abbreviazioni: EMG = elettromiografia; CMAP = potenziale d'azione muscolare composto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Marcatura retrograda CTB dei neuroni motori e sensoriali del nervo C7 trasferito. (A-C) Il CTB è stato iniettato all'estremità distale dell'anastomosi del nervo C7 a 4 settimane dopo l'intervento chirurgico CC7. (A) I neuroni sensoriali sono stati etichettati per il DRG. (B, C) I motoneuroni del nervo C7 trasferito sono stati marcati per il corno anteriore spinale. Ingrandimento, 20x. Barra della scala = 200 μm (A, B); 100 μm (C). Abbreviazioni: CTB = subunità B della tossina del colera; DRG = ganglio della radice dorsale; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindolo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Cambiamenti comportamentali dopo l'intervento chirurgico di CC7. (A) Le immagini mostrano il test del cilindro dei topi. (B) Grafico riassuntivo che mostra l'effetto del trasferimento di CC7 a 4 settimane e 8 settimane dopo l'intervento chirurgico sui topi con trauma cranico (n = 6 topi). p = 0,001; Test t spaiato. L'uso medio dell'arto anteriore compromesso è stato del 54,17% ± del 3,01% nel gruppo Controllo + Sham rispetto al 22,5% ± al 2,14% nel gruppo TBI + Sham; Il 35,83% ± il 2,39% nel gruppo TBI + CC7 a 4 settimane dall'intervento chirurgico CC7, indicando una differenza significativa (ANOVA unidirezionale; p < 0,05, n = 6 in ciascun gruppo). A 8 settimane dal trasferimento di CC7, l'utilizzo è stato rispettivamente del 53,33% ± 3,80%, del 24,17% ± del 3,01% e del 40,00% ± dell'1,83% nei gruppi di controllo + sham, TBI + gruppo sham e TBI + CC7, una differenza significativa (*p < 0,05, ANOVA unidirezionale, n = 6 in ciascun gruppo). (C) Le immagini mostrano il test del cammino della griglia. (D) Il grafico mostra che i tassi medi di errore dell'arto anteriore compromesso nel gruppo TBI + Sham erano dell'85,41% ± dell'1,59% (n = 6) pari al gruppo TBI + CC7 dell'80,17% ± del 2,19% (n = 6), ed entrambi erano superiori al gruppo Control + Sham (50,99% ± 11,69%). A 8 settimane dall'intervento chirurgico, il tasso di errore nel gruppo TBI + CC7 era del 76,87 ± dell'1,07% (n = 6), che è significativamente inferiore a quello del gruppo TBI + Sham (83,06% ± 1,41%; p < 0,05, ANOVA unidirezionale, n = 6 in ciascun gruppo). Abbreviazioni: CC7= trasferimento controlaterale del settimo nervo cervicale; TBI = trauma cranico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussione
In clinica, la chirurgia di trasferimento del nervo incrociato è stata utilizzata per trattare pazienti con lesione da avulsione del plesso brachiale e dopo danni cerebrali, come ictus e trauma cranico 7,9,12. In particolare, il danno cerebrale è una grave condizione neurologica che può portare a diverse complicazioni, tra cui epilessia, ernia cerebrale e infezione13. Non tutti i pazienti con lesione cerebrale unilaterale sono idonei per la chirurgia CC7. In generale, la chirurgia CC7 è stata eseguita in pazienti con emiplegia centrale in fase cronica (6 mesi dopo la lesione) per evitare il più possibile l'influenza dell'edema cerebrale. I pazienti con decadimento cognitivo e tetraplegia dopo lesioni cerebrali sono esclusi dal trattamento per la chirurgia CC7.
La maggior parte degli studi ha riportato l'utilizzo di un approccio sottocutaneo e l'anastomosi dell'innesto del nervo surale o ulnare per trasferire la radice nervosa C7 controlaterale14,15. Tuttavia, la rigenerazione nervosa con tali metodi richiede sei mesi, il che può ostacolare il processo di recupero motorio e persino potenzialmente influenzare la plasticità cerebrale14. In studi precedenti, il trasferimento controlaterale C7 è stato eseguito nei ratti e il nervo C7 bilaterale è stato utilizzato tramite 4 filamenti del nervo surale autoinnestato interposizionale. Tuttavia, non ci sono state segnalazioni di trasferimento del nervo C7 attraverso la via prespinale nei topi. Abbiamo eseguito un intervento chirurgico CC7 della via prespinale modificata nei topi e verificato la velocità di recupero funzionale dopo il trasferimento del nervo C7. In questo studio, il trasferimento del nervo C7 controlaterale attraverso la via prespinale ha migliorato la funzione dell'arto paralizzato un mese dopo l'intervento chirurgico, riflettendo un tempo di recupero più breve del modello animale innestato di nervi. Pertanto, questo modello potrebbe simulare con precisione situazioni cliniche e gettare le basi per ulteriori esperimenti.
Come sezionare la radice nervosa e ridurre il rischio sono questioni essenziali per il trasferimento di C7. A differenza dell'uomo, il plesso brachiale del topo si trova nel torace sotto la clavicola 5,16. Pertanto, la strategia di accesso ha dovuto essere modificata per consentire l'osservazione della radice del nervo C7 e della colonna vertebrale17. La sternotomia è un approccio operatorio sicuro ed efficace ed è comunemente applicata negli esperimenti sui topi in chirurgia cardiotoracica18,19. La lamina ventrale C6 è anche un ostacolo al trasferimento dei nervi. Pertanto, è stato eseguito un intervento chirurgico di sternotomia per sezionare la radice nervosa C7 e recidere la lamina ventrale C6 per ridurre la distanza di trasferimento.
Sebbene la via prespinale possa aumentare significativamente il tasso di successo dell'anastomosi diretta della chirurgia di trasferimento del nervo, non tutti i topi possono essere anastomizzati direttamente. Ciò è dovuto principalmente alle differenze anatomiche in questi topi. Il tronco medio (nervo C7) si fonde con il tronco superiore o inferiore in una posizione molto vicina al forame intervertebrale. Pertanto, la lunghezza dei nervi C7 disponibili per il prelievo è insufficiente. Attualmente, l'unico approccio è il trapianto di nervi o la sostituzione dei topi. Questo modello è tipicamente impiegato nei topi di 8 settimane (20-25 g), poiché i topi sono maturi e i nervi C7 sono di dimensioni adeguate per essere maneggiati. Sebbene questo protocollo chirurgico sia applicabile anche ai topi giovani, la difficoltà dell'operazione aumenterà significativamente nei topi più giovani.
La funzione motoria degli arti anteriori dei topi nel gruppo TBI + CC7 è aumentata significativamente a un mese e due mesi, suggerendo che il nervo C7 trasferito ha contribuito al recupero dell'arto anteriore compromesso. La rimielinizzazione è fondamentale per il recupero neurale funzionale. Uno studio precedente ha dimostrato che le guaine mieliniche dei nervi danneggiati si rigeneravano dopo un mese, coerentemente con questi risultati20. Qui, il nervo trasferito è maturato gradualmente, il che era coerente con il test comportamentale. L'elettromiografia è stata utilizzata per testare ulteriormente il tasso di recupero funzionale dopo il trasferimento del nervo. I risultati hanno dimostrato che il nervo trasferito ha innervato il muscolo interessato 4 settimane dopo l'operazione. In particolare, questo studio è il primo a determinare il punto temporale della reinnervazione con un'anastomosi diretta dopo l'intervento chirurgico di trasferimento del nervo incrociato.
In sintesi, abbiamo simulato la chirurgia clinica per stabilire un protocollo per l'anastomosi diretta dei nervi bilaterali del plesso brachiale attraverso la via prespinale nei topi e abbiamo confermato la funzione del nervo spostato. Il modello murino ha contribuito a chiarire i meccanismi neurali alla base della riabilitazione dopo il trasferimento nervoso incrociato dopo lesioni del sistema nervoso centrale e periferico.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (82071406, 81902296 e 81873766).
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Siringa da 1 ml | KDL | K-20200808 | |
| 12-0 suture in nylon | Chenghe | 20082 | |
| 5-0 intrecciato di seta | MERSILK, ETHICON | QK312 | |
| 75% etanolo | GENERALE-REAGENTE | P1762077 | |
| Ago per agopuntura | Chengzhen | 190420 | Utilizzare per fare divaricatori |
| Clipper automatico | Codos | CHC-332 | |
| C57BL / 6N topi | SLAC laboratorio (Shanghai) | C57BL / 6Slac | |
| Elettrocauterizzazione | Gutta Cutter | SD-GG01 | |
| Unguento eritromicina | Baiyunshan | H1007 | |
| Soluzione di disinfezione iodoforo | Lionser | 20190220 | |
| Nastro medico | Transpore, 3M | 1527C-0 | |
| Micro porta aghi | Chenghe | X006-202003 | |
| Micro-pinza | Chenghe | B001-201908 | |
| Micro-forbici | 66VT | 1911-2S276 | |
| Microscopio operatorio | OLYMPUS | SZX7 | |
| Forbice oftalmica | Chenghe | X041D1251 | |
| Pentobarbital sodico | Sigma 20170608 | ||
| Provetta per infusione in plastica | KDL | C-20191225 | |
| Soluzione salina normale sterile | KL | L121021109 | |
| Pinze vascolari | Jinzhong | J31020 | |
| Cuscinetto riscaldante | RWD | 69027 |
Riferimenti
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