Viene presentato un protocollo per l'applicazione della spettroscopia NMR di potenziamento del rilassamento paramagnetico per rilevare interazioni inter- e intra-molecolari deboli e transitorie in proteine intrinsecamente disordinate.
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Articolo metodologico
Potenziamento del rilassamento paramagnetico per rilevare e caratterizzare le auto-associazioni di proteine intrinsecamente disordinate
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le proteine intrinsecamente disordinate e le regioni intrinsecamente disordinate all'interno delle proteine costituiscono una parte ampia e funzionalmente significativa del proteoma umano. La natura altamente flessibile di queste sequenze consente loro di formare interazioni deboli, a lungo raggio e transitorie con diversi partner biomolecolari. Interazioni specifiche ma a bassa affinità promuovono il legame promiscuo e consentono a un singolo segmento intrinsecamente disordinato di interagire con una moltitudine di siti target. A causa della natura transitoria di queste interazioni, possono essere difficili da caratterizzare con metodi di biologia strutturale che si basano sulle proteine per formare una singola conformazione predominante. La NMR di miglioramento del rilassamento paramagnetico è uno strumento utile per identificare e definire la base strutturale delle interazioni deboli e transitorie. Viene descritto un protocollo dettagliato per l'utilizzo del potenziamento del rilassamento paramagnetico per caratterizzare i complessi di incontro scarsamente popolati che si formano tra proteine intrinsecamente disordinate e la loro proteina, acido nucleico o altri partner biomolecolari.
Introduzione
Il disturbo intrinseco (ID) descrive proteine (IDP) o regioni all'interno delle proteine (IDR) che non si ripiegano spontaneamente in strutture secondarie o terziarie stabili ma sono biologicamente attive. In generale, la funzione degli IDP/IDR è quella di facilitare interazioni specifiche ma reversibili con le biomolecole in condizioni fisiologiche1. Pertanto, gli IDP e gli IDR sono coinvolti in una serie di funzioni cellulari, tra cui il reclutamento, l'organizzazione e la stabilizzazione di complessi multiproteici, ad esempio, l'assemblaggio e l'attività dello spliceosoma2, il reclutamento e l'organizzazione dei compo....
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Protocollo
Requisiti generali per il protocollo: impianti di purificazione delle proteine, spettrometro UV-Vis, spettrometro NMR ad alto campo e software operativo, software di analisi post-elaborazione compreso; NMRPipe32, Sparky33, (o CCPN Analysis34, o NMRViewJ35).
1. Espressione ricombinante e purificazione di una proteina per misure PRE
- Progettare un costrutto di espressione per la proteina di interesse in modo che sia presente un singolo residuo di cisteina. Saranno necessarie mutazioni multiple per introdurre una cisteina libera in diverse ....
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Risultati
I PREs intramolecolari 1H N-Γ2 sono stati registrati su un frammento auto-associante, intrinsecamente disordinato (residui 171-264) derivato dal dominio a bassa complessità della proteina legante l'RNA EWSR142 (Figura 3). Si prevede che i residui in stretta prossimità sequenziale del punto di attacco dell'etichetta di spin (ad esempio, il residuo 178 o 260 nella figura 3) siano significativamente .......
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Discussione
È stato presentato un metodo per caratterizzare le interazioni transitorie che esistono in popolazioni basse tra proteine intrinsecamente disordinate e vari partner di legame che utilizzano PRE. Nell'esempio mostrato, la proteina è auto-associante, e quindi la PRE può derivare da una combinazione di interazioni inter e intramolecolari. Questo metodo è facilmente esteso a campioni eterogenei in cui le interazioni tra due diverse proteine possono essere caratterizzate. Informazioni complementari su come interagiscono le di.......
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Dichiarazioni
Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto. Non vengono dichiarati conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Ringraziamo i dottori Jinfa Ying e Kristin Cano per le utili discussioni e l'assistenza tecnica. DSL è un St. Baldrick's Scholar e riconosce il sostegno della St. Baldrick's Foundation (634706). Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla Welch Foundation (AQ-2001-20190330) a DSL, dal Max and Minnie Tomerlin Voelcker Fund (Voelcker Foundation Young Investigator Grant to DSL), UTHSA Start-Up Funds a DSL e da una Greehey Graduate Fellowship in Children's Health a CNJ. Questo lavoro si basa sulla ricerca condotta nelle Structural Biology Core Facilities, parte dei nuclei di ricerca istituzionali presso l'Health Science Center dell'Università del Texas a San Antonio su....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,45 & micro; m e 0,22 µ m filtri per siringhe | Millipore Sigma | SLHVM33RS SLGVR33RS | Filtra il lisato prima della prima fase di purificazione e prima della cromatografia ad esclusione dimensionale. |
| Petri Dish Fisher | FB0875713 | Agar da 100 mm | per la trasformazione batterica. |
| 14N Cloruro di ammonio | Sigma Aldrich | 576794 | L'uso di 15N nel terreno M9 produrrà una proteina visibile NMR, 14N produrrà una proteina invisibile NMR |
| 15N Cloruro di ammonio | Sigma Aldrich | 299251 | L'uso di 15N nel terreno M9 produrrà una proteina visibile NMR, 14N produrrà una proteina invisibile NMR |
| 3 L Pallone deflettore | Fernbach Corning | 431523 | Coltura di espressione batterica |
| 3-Maleimido-Proxyl | Sigma Aldrich | 253375 | Nitroxide spin label |
| 50 mL provette da centrifuga coniche | Thermo Fisher | 14-432-22 | Soluzione/proteina di stoccaggio |
| Filtro centrifugo Amicon | Millipore Sigma | UFC900308 | Concentrazione proteica |
| Ampicillan | Sigma Aldrich | A5354 | Antibiotico per un marcatore selettivo, la scelta esatta dipende dal plasmide del costrutto di espressione |
| Bilancia analitica | Oahus | 30061978 | Explorer Pro, per pesare i reagenti |
| Acido ascorbico | Sigma | Aldrich AX1775 | Riduce l'etichetta di centrifugazione del nitrossido |
| Autoclave | Sterilizzazione della vetreria e dei terreni | ||
| di coltura Cloruro di calcio | Sigma Aldrich | C4901 | Componente del terreno M9 |
| Flaconi per centrifuga | Thermo Fisher | 010-1459 | Raccolta di cellule di E. coli dopo l'espressione proteica ricombinante |
| Centrifuga, manovella | Thomas Scientific | 0241C68 | Centrifuga Boekel a bassa velocità azionata a mano con secchi da 15 mL in grado di ospitare provette NMR |
| Chelex 100 | Sigma Aldrich | C7901 | Rimozione di composti paramagnetici contaminanti dalle soluzioni tampone |
| Workstation | Linux o Mac OS compatibile con pacchetti software per l'elaborazione e l'analisi dei dati NMR come NMRPipe e Sparky | ||
| Deuterium oxide | Sigma Aldrich | 151882 | Necessario per il segnale di blocco NMR |
| Destrosio | Sigma Aldrich | D9434 | M9 Componente del terreno |
| Dibasico Sodio Fosfato Sigma | Aldrich | S5136 | M9 |
| Reagente di Ellman (acido 5,5-ditio-bis-(2-nitrobenzoico) | Thermo Fisher | 22582 | Quantificazione dei residui di cystiene libero Provette |
| centrifuga ad alta velocità | Thermo Fisher | 3114-0050 | Utilizzato per eliminare il lisato batterico. |
| Strumento NMR ad alto campo (600 - 800 MHz) | Bruker | Dotato di una sonda criogenica multicanale e di una colonna IMAC per il controllo della temperatura | |
| , HisTrap FF | Cytvia | 17528601 | Frazionamento iniziale del lisato batterico grezzo |
| Isopropil B-D-tiogalattoside (IPTG) | Sigma Aldrich | I6758 | Induce l'espressione proteica per i geni sotto il controllo dell'operatore lac |
| LB agar | Thermo Fisher | 22700025 | Gli articoli sono utilizzati per trasformare E. coli per esprimere proteine di interesse, le sostituzioni per uno qualsiasi di questi articoli con prodotti simili sono accettabili. |
| Brodo LB | Thermo Fisher | 12780052 | |
| Sistema cromatografico a bassa pressione | Bio-Rad | 7318300 | BioRad BioLogic è utilizzato per il chomatografo a bassa pressione, come l'esecuzione di colonne IMAC |
| Solfato di magnesio | Sigma Aldrich | M7506 | M9 Componente del terreno |
| Sistema cromatografico a media pressione | Bio-Rad | 7880007 | BioRad NGC dotato di un rivelatore a più lunghezze d'onda, monitor di pH e conducibilità e collettore automatico di frazioni |
| Soluzione vitaminica MEM | Sigma Aldrich | M6895 | M9 Componente del terreno |
| Microfluidizzatore | Avestin | EmulsiFlex-C3 | Fornisce una lisi cellulare batterica rapida ed efficiente |
| Micropipette | Thermo Fisher | Set calibrato di micropipetter con puntali monouso correttamente montati (disponibile presso diversi produttori, ad es. Eppendorf) | |
| Fosfato di potassio monobasico | Sigma Aldrich | 1551139 | componenti multimediali M9 |
| Sigma | Aldrich | 255688 | Per rimuovere il campione dalla provetta |
| NMR Provetta per campioni NMR | NewEra | NE-SL5 | Adatto per spettrometri |
| NMR ad alto campoCentrifuga preparativa | Beckman Coulter | Avanti J-HC | Raccolta di cellule di E. coli dopo l'espressione proteica ricombinante |
| Provette da centrifuga in polistirene a fondo tondo | Corning | 352057 | lisato batterico chiaro |
| Eppendorf | S44I200005 | Crescita a temperatura controllata di colture starter ed di espressione di E. coli | |
| Cloruro di sodio | Sigma Aldrich | S5886 | Componente del media M9 |
| Bagno d'acqua sonicante e sorgente di vuoto | Thomas Scientific | Utilizzato per degassare soluzioni tampone | |
| Sonicatore Thermo Fisher | FB505110 | Utilizzato per la lisi cellulare batterica o il taglio del DNA batterico | |
| Spettrofotometro | Dilufotometro Implen | OD600 Monitoraggio | della crescita delle colture di espressione proteica di E.coli |
| Esculsione di dimensioni Superdex 200 16/600 colum | Cytvia | 28989333 | Fase finale di purificazione delle proteine |
| Software Topspin, versione 3.2 o successiva | Bruker | Software operativo per lo strumento NMR | |
| Trasformazione di cellule di E. coli competenti | Thermo Fisher | C600003 | One Shot BL21 Star (DE3) E. coli chimicamente competente, altri ceppi possono essere compatibili |
| Tris(2-carbossietil)fosfina (TCEP) | ThermoFisher | 20490 | Riducente compatibile con alcune coniugazioni sulfidril-reattive |
| Spettrofotometro UV-Vis | Implen | NP80 | Misura della concentrazione proteica. |
| Bagnomaria, temperatura controllata | ThermoFisher | FSGPD25 | Per la fase di shock termico della trasformazione batterica Estratto di |
| lievito | Sigma Aldrich | Y1625 | Per l'integrazione di terreni M9, se necessario |
Riferimenti
- Dyson, H. J., Wright, P. E. Intrinsically unstructured proteins and their functions. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 6 (3), 197-208 (2005).
- Korneta, I., Bujnicki, J. M. Intrinsic disorder in the human spliceosomal proteome. PLoS Computational Biology<....
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Ristampe e permessi
