Potenziamento del rilassamento paramagnetico per rilevare e caratterizzare le auto-associazioni di proteine intrinsecamente disordinate

Sommario

Viene presentato un protocollo per l'applicazione della spettroscopia NMR di potenziamento del rilassamento paramagnetico per rilevare interazioni inter- e intra-molecolari deboli e transitorie in proteine intrinsecamente disordinate.

Abstract

Le proteine intrinsecamente disordinate e le regioni intrinsecamente disordinate all'interno delle proteine costituiscono una parte ampia e funzionalmente significativa del proteoma umano. La natura altamente flessibile di queste sequenze consente loro di formare interazioni deboli, a lungo raggio e transitorie con diversi partner biomolecolari. Interazioni specifiche ma a bassa affinità promuovono il legame promiscuo e consentono a un singolo segmento intrinsecamente disordinato di interagire con una moltitudine di siti target. A causa della natura transitoria di queste interazioni, possono essere difficili da caratterizzare con metodi di biologia strutturale che si basano sulle proteine per formare una singola conformazione predominante. La NMR di miglioramento del rilassamento paramagnetico è uno strumento utile per identificare e definire la base strutturale delle interazioni deboli e transitorie. Viene descritto un protocollo dettagliato per l'utilizzo del potenziamento del rilassamento paramagnetico per caratterizzare i complessi di incontro scarsamente popolati che si formano tra proteine intrinsecamente disordinate e la loro proteina, acido nucleico o altri partner biomolecolari.

Introduzione

Il disturbo intrinseco (ID) descrive proteine (IDP) o regioni all'interno delle proteine (IDR) che non si ripiegano spontaneamente in strutture secondarie o terziarie stabili ma sono biologicamente attive. In generale, la funzione degli IDP/IDR è quella di facilitare interazioni specifiche ma reversibili con le biomolecole in condizioni fisiologiche¹. Pertanto, gli IDP e gli IDR sono coinvolti in una serie di funzioni cellulari, tra cui il reclutamento, l'organizzazione e la stabilizzazione di complessi multiproteici, ad esempio, l'assemblaggio e l'attività dello spliceosoma², il reclutamento e l'organizzazione dei componenti nei siti di danno al DNA³, l'organizzazione e la stabilizzazione del reclutamento dei complessi di trascrizione⁴ o del rimodellatore della cromatina BAF⁵. Inoltre, gli IDP si trovano nei nessi di segnalazione in cui la loro promiscuità per diversi partner di legame consente loro di mediare il trasferimento di informazioni attraverso le reti proteiche cellulari⁶. Recenti lavori hanno anche rivelato una propensione per le regioni IDR ad auto-associare condensati biomolecolari formanti attraverso il processo di separazione di fase liquido-liquido⁷. Molte delle funzioni sopra menzionate che coinvolgono l'ID sono ora pensate per coinvolgere alcuni aspetti della formazione di condensa⁸. Nonostante l'importanza dell'ID per l'assemblaggio di complessi biomolecolari, la stabilizzazione, l'impalcatura e la trasduzione del segnale, i dettagli atomici delle loro interazioni specifiche sono difficili da identificare poiché gli IDP e gli IDR non sono tipicamente suscettibili di indagini strutturali utilizzando la cristallografia a raggi X o la microscopia elettronica criogenica.

La risonanza magnetica nucleare (NMR) è una tecnica ideale per studiare l'ID in quanto non dipende dalla presenza di insiemi strutturali rigidi o omogenei, ma riferisce sull'ambiente locale immediato dei singoli nuclei. La frequenza di risonanza, o spostamento chimico, di un nucleo in una data molecola è influenzata da deboli campi magnetici indotti dalla distribuzione elettronica locale, che a sua volta dipende dalle lunghezze di legame, dagli angoli, dalla vicinanza di altri nuclei, dalle interazioni con i partner di legame e da altri fattori⁹. Pertanto, ogni nucleo agisce come una sonda strutturale unica e specifica del sito sensibile ai cambiamenti nel suo ambiente chimico locale. Nonostante questi vantaggi, la NMR è una tecnica di massa e lo spostamento chimico osservato è la media di tutti gli ambienti campionati da un particolare nucleo. Una serie di tecniche NMR, molte delle quali sono descritte in questo numero, sono state sviluppate per recuperare informazioni strutturali, dinamiche e cinetiche su conformazioni biomolecolari ad alta energia e scarsamente popolate contenute nello spostamento chimico medio^10,11. Sebbene popolati transitoriamente, l'identificazione e la quantificazione di questi stati sono importanti per determinare i dettagli dei meccanismi funzionali¹². Ad esempio, nel caso degli IDP e degli IDR, l'insieme conformazionale può essere distorto per campionare preferenzialmente conformazioni che sono produttive per la formazione di complessi di incontro con partner di legame fisiologici. L'individuazione di questi stati, così come l'identificazione delle interazioni e dinamiche inter- e intra-molecolari specifiche del residuo, sono importanti per determinare i meccanismi strutturali sottostanti alla funzione e alla formazione delle proteine.

Viene descritto un protocollo per l'utilizzo della NMR di potenziamento del rilassamento paramagnetico (PRE) per studiare stati transitori e scarsamente popolati importanti per la formazione di complessi biomolecolari mediati da IDP/IDR¹³. Questo approccio è utile per studiare le interazioni transitorie proteina-proteina come quelle che promuovono l'assemblaggio di fibrille amiloidi da α-sinucleina 14,15 o l'autoassociazione di FUS^16, nonché per caratterizzare specifiche interazioni proteina-proteina come tra proteine di segnalazione¹⁷. Viene presentato un esempio di IDP auto-associante, in cui specifiche interazioni inter- e intra-molecolari si traducono in stati preferenzialmente compattati e interazioni sito-specifiche che guidano l'auto-associazione.

Il PRE deriva dall'interazione dipolare magnetica di un nucleo ad un centro paramagnetico con un tensore g isotropo, comunemente fornito sotto forma di un elettrone spaiato su un gruppo nitroxide o come atomo metallico paramagnetico¹⁸ (Figura 1). Mentre gli atomi con tensori g anisotropi producono anche un effetto PRE, l'analisi di questi sistemi è più difficile a causa degli effetti confondenti forniti dagli spostamenti pseudo-di contatto (PCS) o dall'accoppiamento dipolare residuo (RDC)^13,19. La forza dell'interazione tra un nucleo e il centro paramagnetico dipende dalla distanza <^r-6> tra i due. Questa interazione si traduce in un aumento dei tassi di rilassamento nucleare, che causa un allargamento della linea rilevabile anche per interazioni a lungo raggio (~10-35 Å), perché il momento magnetico dell'elettrone spaiato è così forte^20,21. Il rilevamento di stati transitori con il PRE è possibile se sono soddisfatte le seguenti due condizioni; (1) l'interazione transitoria è in rapido scambio sulla scala temporale NMR (lo spostamento chimico osservato è una media ponderata per la popolazione degli stati di scambio); e (2) la distanza tra nuclei e centro paramagnetico è più breve nello stato popolato transitoriamente che nello stato maggiore¹¹. Il PRE trasversale è indicato con Γ₂ e, per motivi pratici, è calcolato dalla differenza nei tassi di rilassamento trasversale ¹H tra un campione contenente un centro paramagnetico e un controllo diamagnetico. Per una trattazione approfondita della teoria del PRE e dei relativi spostamenti pseudo-di contatto nei regimi di scambio rapido e lento, si rimanda il lettore alle recensioni complete di Clore e collaboratori^13,22. Qui, viene considerata solo la situazione in cui ¹H N-Γ₂ è nel regime di scambio veloce, dove a causa della dipendenza ^r-6 del PRE, il tasso di rilassamento osservato è correlato sia alla distanza a cui il centro paramagnetico si avvicina al nucleo sia alla quantità di tempo che trascorre in quella conformazione. Pertanto, le conformazioni transitorie che non implicano un approccio ravvicinato producono un piccolo PRE mentre interazioni più strette, anche se di breve durata, produrranno un PRE più grande.

Per gli IDP, il PRE viene utilizzato per misurare e differenziare le interazioni che si verificano all'interno di una singola molecola (intramolecolare) e tra molecole separate (intermolecolari). Attaccando un centro paramagnetico a una proteina NMR visibile (ad esempio, ¹⁵N-marcata) o NMR invisibile (ad esempio, abbondanza naturale ¹⁴N), è possibile determinare la fonte (inter- o intra-molecolare) del PRE (Figura 2). La mutagenesi sito-diretta che introduce un residuo di cisteina è un approccio conveniente per attaccare un centro paramagnetico (spin-label) a una proteina²³. Sono stati proposti diversi tipi di molecole per l'uso come etichette di spin, tra cui la chelazione dei metalli (a base di EDTA) e i radicali liberi (a base di nitroxide)²⁴. Sono state descritte varie etichette di spin nitroxide e sono disponibili con diverse sostanze chimiche reattive alla cisteina come metanetiosolfonato, maleimmide e iodoacetamide^25,26 (Figura 1). La flessibilità intrinseca del tag o del linker può essere problematica per alcune analisi e, in queste situazioni, sono state proposte diverse strategie per limitare il movimento del tag, ad esempio aggiungendo gruppi chimici ingombranti o l'uso di un secondo linker per ancorare il tag alla proteina (attacco a due siti)^{27, 28}. Inoltre, i tag disponibili in commercio possono contenere proteine diastereomeriche, ma generalmente ciò non contribuirà al PRE²⁹ osservato. L'uso del 3-Maleimido-PROXYL legato ad una cisteina libera tramite chimica maleimmide è descritto poiché è prontamente disponibile, economico, non reversibile e l'agente riducente tris(2-carbossietil)fosfina (TCEP) può essere mantenuto nella soluzione per tutta la reazione di etichettatura. Poiché 3-Maleimido-PROXYL ha un tensore g isotropo, non vengono indotti PCS o RDC e le stesse assegnazioni di spostamento chimico possono essere utilizzate sia per i campioni paramagnetici che diamagnetici¹³.

^L'1H_{N-T 2} viene misurato utilizzando una strategia a due punti temporali (T a, T_b) che in precedenza ha dimostrato di essere accurata quanto la raccolta di una serie di evoluzione completa composta da 8 _a 12 punti temporali³⁰. Il primo punto temporale (T _a) è fissato il più vicino possibile allo zero e la lunghezza ottimale del secondo punto temporale dipende dalla grandezza del PRE più grande atteso per un dato campione e può essere stimato da: T_b ~ 1,15 / (R 2,dia + Γ 2) dove R _2,dia rappresenta l'R ₂ del campione diamagnetico¹³. Se la grandezza dei PRE più grandi è sconosciuta, impostare T _b a ~ una volta ^l'1H T 2 della proteina è una buona stima iniziale e ulteriormente ottimizzata regolando T₂ per migliorare il segnale al rumore. Questa strategia di misurazione a due punti riduce significativamente il tempo sperimentale necessario per misurare i PR e consente di calcolare la media del segnale, in particolare perché vengono utilizzati campioni relativamente diluiti per ridurre al minimo gli effetti dei contatti non specifici tra le molecole. Una sequenza di impulsi basata su HSQC viene utilizzata per misurare ¹H N-T₂ ed è stata descritta in dettaglio altrove³⁰. Per una migliore sensibilità, gli impulsi duri dei trasferimenti INEPT avanti e indietro possono essere sostituiti con impulsi sagomati; in alternativa, la sequenza viene prontamente convertita in una lettura basata su TROSY³¹. Poiché gli IDP hanno tipicamente tassi di rilassamento trasversale molto più lunghi con conseguenti larghezze di linea più strette (a causa del disturbo intrinseco) rispetto alle proteine globulari di dimensioni simili, lunghi tempi di acquisizione nella dimensione indiretta possono essere utilizzati per migliorare la risoluzione spettrale e alleviare la limitazione della dispersione dello spostamento chimico inerente agli IDP.

PRE è uno strumento utile per studiare le interazioni proteina-proteina e proteina-acido nucleico, in particolare le interazioni che sono transitorie o scarsamente popolate. Viene fornito un protocollo dettagliato per la preparazione di un campione NMR adatto alla misurazione dei PRE, comprese le fasi per la purificazione delle proteine, l'etichettatura dello spin diretto al sito, l'impostazione e la calibrazione del programma di impulsi, l'elaborazione e l'interpretazione dei dati NMR. Importanti considerazioni sperimentali sono notate in tutto ciò che può influire sulla qualità dei dati e sui risultati sperimentali, compresa la concentrazione del campione, la selezione dell'etichetta di spin e la rimozione dei componenti paramagnetici.

Protocollo

Requisiti generali per il protocollo: impianti di purificazione delle proteine, spettrometro UV-Vis, spettrometro NMR ad alto campo e software operativo, software di analisi post-elaborazione compreso; NMRPipe³², Sparky³³, (o CCPN Analysis³⁴, o NMRViewJ³⁵).

1. Espressione ricombinante e purificazione di una proteina per misure PRE

1. Progettare un costrutto di espressione per la proteina di interesse in modo che sia presente un singolo residuo di cisteina. Saranno necessarie mutazioni multiple per introdurre una cisteina libera in diverse posizioni nella proteina di interesse³⁶.
2. Esprimere e purificare un campione di abbondanza naturale (¹⁴N) o ¹⁵N-marcato della proteina di interesse utilizzando un protocollo stabilito³⁷.
   NOTA: I sistemi di espressione di E. coli forniscono un metodo economico e robusto per l'espressione di proteine ricombinanti poiché l'arricchimento isotopico di ¹⁵N è un requisito minimo per la spettroscopia NMR eteronucleare biomolecolare. I passaggi tipici sono l'espressione in mezzi minimi, la purificazione cromatografica e la rimozione del tag di purificazione di affinità. Questo protocollo presuppone che sia stato stabilito un robusto protocollo di espressione e purificazione in grado di produrre proteine sufficienti di qualità adeguata per le indagini NMR.
   1. Mantenere 1 mM di agente riducente (DTT o TCEP) nei tamponi in tutte le fasi di purificazione per prevenire la reazione della cisteina libera e la formazione di legami disolfuro intermolecolari per gli IDP.
      NOTA: Alcuni sistemi possono essere più tolleranti e meno inclini all'aggregazione di condizioni non riducenti a seconda delle caratteristiche specifiche della proteina, nonché della temperatura, del pH e del sistema tampone scelto per la purificazione³⁸.
   2. Rimuovere i tag di affinità utilizzati per la purificazione prima di procedere poiché possono interagire in modo non specifico con la proteina in modi imprevedibili o possibilmente contenere residui reattivi di cisteina che potrebbero inavvertitamente servire come sito di attaccamento non intenzionale.
   3. Preparare un campione di riferimento ^{marcato con 15}N senza mutazioni della cisteina miscelato con una versione solubile dello spin-label per valutare il contributo dei PRE del solvente.

2. Coniugazione dell'etichetta di spin nitroxide 3-Maleimido-PROXYL

1. Conservare o scambiare la proteina purificata in un tampone degassato contenente 50 mM Tris pH 7 e 1 mM TCEP; il tampone può anche contenere fino a 8 M di urea, se necessario per favorire la solubilità delle proteine.
   In alternativa, diluire rapidamente una soluzione madre proteica in almeno 10 equivalenti di volume di tampone Tris pH 7 da 50 mM degassato e tampone TCEP da 1 mM. Assicurarsi che la concentrazione proteica prima di aggiungere spin-label sia di almeno 100 μM.
2. Aggiungere 3-Maleimido proxyl da una soluzione madre a 20x molare in eccesso della proteina di interesse. Proteggere il campione dalla luce e dall'ossigeno e incubare per una notte a temperatura ambiente o 4 °C; Un leggero oscillolamento o nutazione può migliorare l'efficienza dell'etichettatura.
3. Preparare le soluzioni stock dell'etichetta di spin sciogliendo la polvere proxy 3-Maleimido in etanolo al 95%. Le aliquote dello stock possono essere conservate a -80 °C per meno di 6 mesi.
4. Passaggio critico: rimuovere l'etichetta di spin libero non reagito per evitare pre di solvente non specifici. Ottenere questo risultato mediante filtrazione su gel o (preferibilmente) dialisi estesa del campione proteico. Questo passaggio introdurrà anche la proteina in un tampone adatto per la RMN.
   NOTA: gli agenti riducenti devono essere preparati freschi e deve essere considerata la compatibilità tra i componenti tampone; ad esempio, il TCEP si degrada rapidamente in tamponi a base di fosfato e questa combinazione dovrebbe essere evitata³⁹.
5. Trattare tutti i tamponi utilizzati da questo passo in avanti con una resina chelante selettiva per metalli bivalenti e di transizione per rimuovere ioni paramagnetici o quencher spin-label. Se la proteina non può essere immagazzinata in un tampone NMR, concentrare la proteina da diluire rapidamente in un tampone adatto per la NMR.
6. Monitoraggio dell'efficienza dell'incorporazione di etichette di spin.
   1. Utilizzare il reagente di Ellman (acido 5,5-ditio-bis-(2-nitrobenzoico) per quantificare i gruppi sulfidrilici liberi nella soluzione⁴⁰.
      NOTA: i protocolli dettagliati sono disponibili presso il produttore. Ai fini qui, è importante determinare l'incorporazione dell'etichetta di spin, la concentrazione di gruppi sulfidrilici liberi viene confrontata con la concentrazione proteica totale. La percentuale di gruppi sulfidrilici liberi è la percentuale di molecole che non hanno un'etichetta di spin nitroxide attaccata.
   2. Monitorare l'intensità del picco corrispondente al residuo di cisteina marcato per giudicare l'incorporazione spin-label nella proteina di interesse.
      NOTA: Questo è un approccio rapido ed efficace per determinare il grado di etichettatura di spin della proteina. L'incorporazione completa dell'etichetta di spin comporterà la scomparsa del picco dallo spettro. Con la scarsa dispersione caratteristica degli IDP, il picco corrispondente al residuo mutante di cisteina potrebbe non essere sempre facilmente identificato, e quindi si raccomanda l'uso del reagente di Ellman (fase 2.6.1).

3. Preparare il campione NMR per misurare la PRE intra o intermolecolare

1. Preparare il campione per la misurazione della PRE intramolecolare
   1. Preparare ¹⁵N proteine arricchite isotopicamente, marcate con spin ad una concentrazione di almeno 100 μM ma non superiore a 300 μM in un tampone adatto per NMR. Il volume totale del campione (incluso D₂O) è compreso tra 500 e 550 μL.
      NOTA: I tamponi NMR comuni includono fosfato, acetato, (bi)carbonato e TRIS. Anche i buffer di Good come MES, HEPES possono essere appropriati. Prestare attenzione quando si selezionano i buffer per garantire che non vi sia cross-reattività con altri componenti della soluzione.
   2. Assicurarsi che il pH sia ~ 7,2 o inferiore per ridurre al minimo gli effetti dello scambio protonico ammidico con acqua. Mantenere la concentrazione di sale il più bassa possibile (in genere inferiore a 150 mM), anche se la considerazione principale è quella di mantenere la stabilità proteica.
      NOTA: Gli approcci per condurre esperimenti NMR in condizioni di alta salsedine sono stati descritti altrove⁴¹.
2. Preparare il campione per la misurazione della PRE intermolecolare
   1. Seguire questo passaggio o passaggio 3.1; Non vengono eseguiti contemporaneamente. Preparare ¹⁴N di abbondanza naturale, proteine marcate con spin nel tampone NMR scelto.
   2. Preparare il campione proteico mescolando ¹⁵N proteine arricchite isotopicamente non marcate con spin con proteine marcate con spin ad abbondanza naturale 1%-50% ¹⁴N, in modo che la concentrazione finale sia identica al campione preparato al punto 3.1.1. Il volume totale del campione (incluso D₂O) è compreso 500 - 550 μL.
   3. Ottimizzare empiricamente il rapporto tra le ^{proteine 15}N e ¹⁴N per ogni proteina studiata. I rapporti di 1%, 5% e 20% di ¹⁴proteine marcate con N-spin sono buoni punti di partenza.
      NOTA: Un accumulo del PRE in funzione dell'aggiunta di ¹⁴proteine marcate con N-spin indica un effetto specifico; il PRE osservato è specifico del campione poiché dipende dalla distanza e dalla popolazione (come discusso sopra), e quindi saranno necessari rapporti più elevati di ¹⁴proteine marcate con N-spin se l'interazione è particolarmente transitoria¹⁷.
3. Trasferire il campione NMR (intra- o intermolecolare) in un tubo NMR da 5 mm appropriato per l'uso in magneti ad alto campo utilizzando una pipetta di vetro a gambo lungo (9") o una micropipetta. Assicurarsi che tutti i campioni NMR includano il 5% -10% di D₂O per facilitare il blocco del campo.
   NOTA: i tubi NMR che utilizzano tappi polimerici per ridurre il volume di campione necessario non sono raccomandati per le misurazioni PRE a causa delle difficoltà legate all'efficace spessomazione del campione.

4. Impostare lo spettrometro NMR e sperimentare parametri specifici

1. Prestare estrema attenzione quando si lavora intorno a spettrometri NMR superconduttori ad alto campo.
   NOTA: I pericoli includono lesioni dovute all'improvvisa accelerazione di oggetti metallici verso il magnete, interferenze con dispositivi medici impiantati e asfissia dovuta a un improvviso rilascio di gas N 2 e He₂ in caso di spegnimento del magnete. I seguenti passaggi presuppongono che il lettore abbia seguito la formazione richiesta, sia a conoscenza di questi e di altri pericoli locali e abbia ricevuto l'approvazione dal gestore della struttura per utilizzare lo spettrometro NMR. In caso di dubbi su un passo o un'istruzione, consultare il responsabile della struttura o l'utente esperto per prevenire potenziali lesioni personali o danni allo spettrometro.
2. I passaggi seguenti presuppongono uno spettrometro NMR commerciale che esegue una versione moderna del software di controllo dell'acquisizione. Scaricare il programma di impulsi e i file dei parametri e inserirli nelle directory appropriate.
   NOTA: Un programma di impulsi e un set di parametri adatti per l'uso con uno spettrometro Bruker e TopSpin (3.2 o successivo) sono disponibili su richiesta degli autori.
   1. Passaggio critico: si presuppone familiarità con l'installazione di programmi a impulsi NMR non nativi; Consultare il responsabile della struttura o un utente esperto, se necessario.
3. Posizionare il campione nel magnete, bloccare il segnale ²H utilizzando il comando Lock, sintonizzare e abbinare il canale ¹H secondo i protocolli della struttura (la procedura esatta dipenderà dal fatto che la sonda sia dotata di un modulo di sintonizzazione e corrispondenza remoto).
4. Regolare gli spessori utilizzando la subroutine topshim per ottimizzare la soppressione del segnale del solvente.
5. Calibrare gli impulsi ¹H e ¹⁵N 90° utilizzando metodi standard.
   1. Calibrare l'impulso ¹H utilizzando il programma popt (utilizzare prima pulsecal per stimare la lunghezza dell'impulso).
   2. Calibrare l'impulso ^{di 15}N rispetto a un campione standard; Assicurati che questo valore sia stato calibrato di recente discutendo con un direttore tecnico o un utente esperto.
   3. In alternativa, calibrare l'impulso di ¹⁵N sul campione variando uno degli impulsi a 90° di un esperimento HMQC fino a raggiungere un segnale nullo.
   4. Determinare l'attenuazione corretta per gli impulsi sagomati utilizzando la subroutine dello strumento forma (stdisp).
   5. Aprire il file di forma dell'impulso appropriato facendo clic sull'icona della cartella. Gli impulsi sagomati si trovano nella sezione dei parametri di impulso di ACQUPARS.
   6. Caricare il file di definizione dell'impulso e fare clic su Analizza forma d'onda > Integra forma. Immettere l'impulso duro calibrato ^{di 1}H 90°, la lunghezza dell'impulso sagomato desiderato e la rotazione (90° o 180°).
   7. Calcolare il livello di potenza dell'impulso sagomato aggiungendo la variazione del livello di potenza all'attenuazione per l'impulso calibrato a 90°.
6. Registrare uno standard ¹H, ¹⁵N HSQC (hsqcetfpf3gpsi) per ottimizzare la larghezza di sweep, la frequenza del supporto e controllare la soppressione dell'acqua²⁵.
7. Regolare la larghezza della sweep e il numero di incrementi di quota indiretti utilizzando i comandi sw e td o direttamente nelle finestre di dialogo appropriate. Tipicamente, per la raccolta di PRE, le larghezze spettrali vengono scelte in modo che lo spettro non sia piegato.

5. Impostare l'esperimento ¹H_{N-T 2}

1. Calibrare gli impulsi sagomati come descritto sopra (4.4.5-4.5.7). I file dei parametri dell'impulso sagomato per l'esperimento PRE sono Eburp2.1000 (impulso a 90°), Reburp.1000 e Iburp2.1000. Immettere le lunghezze di impulso calibrate nella sezione dei parametri di impulso della scheda ACQUPARS .
2. Questo esperimento ^{misura 1 H} N-T₂ usando l'approccio a due punti di ritardo³⁰.
   1. Impostare i ritardi modificando il file vdlist, il primo ritardo (T_a) è impostato su 0,01 ms.
   2. Scegliere il secondo ritardo, (T b) utilizzando la relazione con il PRE massimo atteso (T _b ~ 1,15/(R 2,dia + Γ 2) dove R _2,dia rappresenta l'R ₂ del campione diamagnetico¹³. Senza una conoscenza preliminare dell'entità del contributo PRE al rilassamento osservato, un buon punto di partenza è impostare T _b a ~1x ¹H T₂.
   3. Quindi determinare un valore adatto confrontando i primi incrementi (elaborati con il comando efp) degli spettri T _a e T b e regolando T _b in modo tale che il segnale decada tra il 40% e il 50% del suo valore iniziale.
      NOTA: Questo approccio ottimizza il rapporto segnale-rumore spettrale, una considerazione necessaria per i campioni che non possono essere altamente concentrati (< 50 μM). I valori appropriati di T_b dipendono dal campione, ma in genere variano da 8 a 40 ms per una proteina di dimensioni medie.
3. Determinare il numero di punti complessi da registrare e il numero di scansioni per una media del segnale sufficiente. Poiché gli IDP hanno ¹⁵N T 2 più lunghi rispetto alle proteine ripiegate di dimensioni comparabili, possono essere utilizzati tempi di acquisizione più lunghi nella dimensione indiretta.
   NOTA: Questo valore dipende dalle caratteristiche specifiche della proteina, ma può essere approssimativamente stimato dal ¹⁵N T₂ e ottimizzato monitorando il decadimento del segnale nel FID. Per la dimensione diretta, 1024* punti complessi (larghezza di sweep 13 ppm, tempo di acquisizione 112,6 ms) sono sufficienti per la maggior parte dei campioni.
4. Utilizzare il comando expt per calcolare il tempo dell'esperimento e quindi avviare l'esperimento con il comando zg.

6. Fai un campione diamagnetico riducendo lo spin-label con acido ascorbico

1. Sciogliere l'ascorbato di sodio nel tampone NMR e regolare il pH in modo che corrisponda al tampone NMR originale.
2. Calcolare la concentrazione di sodio ascorbato in modo che un eccesso molare di ascorbato di 10x sulla concentrazione dell'etichetta di spin possa essere aggiunto con la minima variazione del volume del campione. Ad esempio, per un campione proteico da 100 μM, è appropriato uno stock di ascorbato di 100 mM. La riduzione dell'etichetta di spin richiederà l'aggiunta di 5,5 μL di soluzione madre di acido ascorbico, che è solo l'1 % del volume totale del campione.
3. Aggiungere la quantità necessaria di acido ascorbico al tubo NMR posizionando una goccia sotto il bordo del tubo, tappare il tubo, capovolgere con attenzione il tubo per miscelare e quindi ruotare a 200-400 x g per 10-20 s in una centrifuga a manovella per depositare il campione sul fondo del tubo.
4. Avvolgere il tubo NMR in un foglio per proteggerlo dalla luce e lasciare che la reazione proceda per almeno 3 ore.
5. Registrare ¹H N-T₂ sul campione diamagnetico utilizzando gli stessi parametri utilizzati per il campione paramagnetico.
6. Ricalibrare gli impulsi. Tuttavia, non avrebbero dovuto cambiare dalle misurazioni paramagnetiche; Se sono significativamente diversi (> differenza di 0,5 μs), considerare la qualità del campione (ad esempio, degradazione, precipitazione).
7. Assicurarsi che tutti i parametri di acquisizione, inclusi i ritardi di rilassamento specificati (vdlist), il numero di scansioni fittizie, il numero di scansioni raccolte, il numero di punti complessi raccolti, il tempo di acquisizione, le larghezze di scansione e le frequenze portanti rimangano gli stessi per i campioni diamagnetici e paramagnetici.

7. Spettri paramagnetici e diamagnetici di processo

1. Copiare i dati nel computer locale o nella workstation in cui sono installati e configurati NMRPipe e Sparky. Creare una cartella denominata proc nella directory dei dati dell'esperimento che contiene il file ser.
2. Copiare gli script NMRPipe fid.com, p3d.com e nmrproc.com in proc (gli script di elaborazione sono disponibili su richiesta degli autori).
   1. Utilizzare lo script fid.com per convertire il formato dati Bruker (ser) in formato NMRPipe.
   2. Utilizzare lo script p3D.com per dividere i piani pseudo3D in singoli spettri.
   3. Utilizzare lo script nmrproc.com per leggere l'output dello script fid.com, applicare la soppressione del solvente, una funzione finestra, aggiungere zeri ai dati grezzi (riempimento zero), applicare la correzione di fase, eseguire una trasformazione di Fourier, tagliare i dati per la visualizzazione e scrivere i dati elaborati su disco. Lo script produrrà un file per ogni ritardo di rilassamento registrato (T _a e T_b).
      NOTA: ognuno di questi script è personalizzabile per ottimizzare l'elaborazione per i dettagli specifici di ogni esperimento. Tutorial e set di dati di esempio sono inclusi nella distribuzione NMRPipe disponibile sul sito Web NMRPipe³². NMRDraw può essere utilizzato per la visualizzazione spettrale durante l'elaborazione (ad esempio, impostando angoli di fase corretti, ecc.). Le opzioni disponibili per i comandi NMRPipe possono essere visualizzate utilizzando il comando nmrPipe -help.

8. Trasferisci le assegnazioni di risonanza ed estrai le altezze dei picchi

1. Modificare le informazioni di intestazione del file per ogni file dello spettro (T _a, T_b per campioni paramagnetici e diamagnetici) utilizzando il comando sethdr [nome file] -ndim 2.
2. Utilizzare Sparky per estrarre le altezze di picco³³ seguendo i passaggi 8.3-8.5. Altri pacchetti software, tra cui NMRPipe (NMRDraw)³², CCPN Analysis 34 e NMRViewJ³⁵ sono anche appropriati.
3. Leggi i file spettrali in Sparky. In questa fase il set di dati sarà costituito da uno spettro per ogni spettro del punto temporale (T _a, T_b), sia per i campioni paramagnetici che diamagnetici, misurati per ogni posizione dello spin-label nella proteina.
4. Usa Sparky per selezionare i picchi (comando: F8, quindi fai clic e trascina) e trasferisci le assegnazioni utilizzando lo strumento Trasferisci elenco picchi da un elenco di picchi di riferimento.
   NOTA: Le assegnazioni di risonanza della proteina di interesse sono necessarie per l'interpretazione specifica della sequenza dei PREs osservati³⁶.
   1. Imposta i contorni in entrambi gli spettri paramagnetici e diamagnetici allo stesso livello. Assicurati di impostare i contorni in modo che gli spettri raccolti dopo il ritardo non escludano intenzionalmente i picchi ma siano abbastanza alti in modo che gli spettri T_a non siano eccessivamente rumorosi.
5. Salvare le nuove liste di picco per ogni spettro e includere l'intensità di picco misurata e il rapporto segnale/rumore calcolato da Sparky (comando: lt per aprire la lista dei picchi, fare clic sulle opzioni per includere l'intensità e le colonne SNR, comando: salva).

9. Estrarre ¹H_{N-T 2} tassi per ogni residuo e calcolare PRE

1. Importa gli elenchi dei picchi in un software per fogli di calcolo o in un linguaggio di programmazione preferito come Python.
   NOTA: Per ogni posizione spin-label sulla proteina, il set di dati sarà costituito da quattro liste di picco con intensità di picco associate, una ciascuna di T _a e T_b sia per gli esperimenti paramagnetici che diamagnetici.
2. Calcolare ¹H_N R₂ sia per i campioni paramagnetici che diamagnetici usando l'equazione:
   
   
3. Utilizzare l'equazione precedente per determinare la velocità di rilassamento per ciascun residuo per i campioni paramagnetici e diamagnetici.
4. Determinare il tasso ¹H N-Γ₂ per ciascun residuo usando l'equazione:
   
5. Utilizzare il rapporto segnale/rumore calcolato Sparky (SNR) per calcolare l'incertezza dell'altezza di picco per ciascun residuo.
6. Propagare l'errore utilizzando l'equazione:
   
7. Grafico ¹H_{N-Γ 2} in funzione del numero di residui utilizzando un grafico a dispersione comprendente l'errore calcolato al punto 9.6.

Risultati

I PREs intramolecolari ¹H N-Γ₂ sono stati registrati su un frammento auto-associante, intrinsecamente disordinato (residui 171-264) derivato dal dominio a bassa complessità della proteina legante l'RNA EWSR1⁴² (Figura 3). Si prevede che i residui in stretta prossimità sequenziale del punto di attacco dell'etichetta di spin (ad esempio, il residuo 178 o 260 nella figura 3) siano significativamente ...

Discussione

È stato presentato un metodo per caratterizzare le interazioni transitorie che esistono in popolazioni basse tra proteine intrinsecamente disordinate e vari partner di legame che utilizzano PRE. Nell'esempio mostrato, la proteina è auto-associante, e quindi la PRE può derivare da una combinazione di interazioni inter e intramolecolari. Questo metodo è facilmente esteso a campioni eterogenei in cui le interazioni tra due diverse proteine possono essere caratterizzate. Informazioni complementari su come interagiscono le di...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,45 & micro; m e 0,22 µ m filtri per siringhe	Millipore Sigma	SLHVM33RS SLGVR33RS	Filtra il lisato prima della prima fase di purificazione e prima della cromatografia ad esclusione dimensionale.
Petri Dish Fisher	FB0875713	Agar da 100 mm	per la trasformazione batterica.
14N Cloruro di ammonio	Sigma Aldrich	576794	L'uso di 15N nel terreno M9 produrrà una proteina visibile NMR, 14N produrrà una proteina invisibile NMR
15N Cloruro di ammonio	Sigma Aldrich	299251	L'uso di 15N nel terreno M9 produrrà una proteina visibile NMR, 14N produrrà una proteina invisibile NMR
3 L Pallone deflettore	Fernbach Corning	431523	Coltura di espressione batterica
3-Maleimido-Proxyl	Sigma Aldrich	253375	Nitroxide spin label
50 mL provette da centrifuga coniche	Thermo Fisher	14-432-22	Soluzione/proteina di stoccaggio
Filtro centrifugo Amicon	Millipore Sigma	UFC900308	Concentrazione proteica
Ampicillan	Sigma Aldrich	A5354	Antibiotico per un marcatore selettivo, la scelta esatta dipende dal plasmide del costrutto di espressione
Bilancia analitica	Oahus	30061978	Explorer Pro, per pesare i reagenti
Acido ascorbico	Sigma	Aldrich AX1775	Riduce l'etichetta di centrifugazione del nitrossido
Autoclave			Sterilizzazione della vetreria e dei terreni
di coltura Cloruro di calcio	Sigma Aldrich	C4901	Componente del terreno M9
Flaconi per centrifuga	Thermo Fisher	010-1459	Raccolta di cellule di E. coli dopo l'espressione proteica ricombinante
Centrifuga, manovella	Thomas Scientific	0241C68	Centrifuga Boekel a bassa velocità azionata a mano con secchi da 15 mL in grado di ospitare provette NMR
Chelex 100	Sigma Aldrich	C7901	Rimozione di composti paramagnetici contaminanti dalle soluzioni tampone
Workstation			Linux o Mac OS compatibile con pacchetti software per l'elaborazione e l'analisi dei dati NMR come NMRPipe e Sparky
Deuterium oxide	Sigma Aldrich	151882	Necessario per il segnale di blocco NMR
Destrosio	Sigma Aldrich	D9434	M9 Componente del terreno
Dibasico Sodio Fosfato Sigma	Aldrich	S5136	M9
Reagente di Ellman (acido 5,5-ditio-bis-(2-nitrobenzoico)	Thermo Fisher	22582	Quantificazione dei residui di cystiene libero Provette
centrifuga ad alta velocità	Thermo Fisher	3114-0050	Utilizzato per eliminare il lisato batterico.
Strumento NMR ad alto campo (600 - 800 MHz)	Bruker		Dotato di una sonda criogenica multicanale e di una colonna IMAC per il controllo della temperatura
, HisTrap FF	Cytvia	17528601	Frazionamento iniziale del lisato batterico grezzo
Isopropil B-D-tiogalattoside (IPTG)	Sigma Aldrich	I6758	Induce l'espressione proteica per i geni sotto il controllo dell'operatore lac
LB agar	Thermo Fisher	22700025	Gli articoli sono utilizzati per trasformare E. coli per esprimere proteine di interesse, le sostituzioni per uno qualsiasi di questi articoli con prodotti simili sono accettabili.
Brodo LB	Thermo Fisher	12780052
Sistema cromatografico a bassa pressione	Bio-Rad	7318300	BioRad BioLogic è utilizzato per il chomatografo a bassa pressione, come l'esecuzione di colonne IMAC
Solfato di magnesio	Sigma Aldrich	M7506	M9 Componente del terreno
Sistema cromatografico a media pressione	Bio-Rad	7880007	BioRad NGC dotato di un rivelatore a più lunghezze d'onda, monitor di pH e conducibilità e collettore automatico di frazioni
Soluzione vitaminica MEM	Sigma Aldrich	M6895	M9 Componente del terreno
Microfluidizzatore	Avestin	EmulsiFlex-C3	Fornisce una lisi cellulare batterica rapida ed efficiente
Micropipette	Thermo Fisher		Set calibrato di micropipetter con puntali monouso correttamente montati (disponibile presso diversi produttori, ad es. Eppendorf)
Fosfato di potassio monobasico	Sigma Aldrich	1551139	componenti multimediali M9
Sigma	Aldrich	255688	Per rimuovere il campione dalla provetta
NMR Provetta per campioni NMR	NewEra	NE-SL5	Adatto per spettrometri
NMR ad alto campoCentrifuga preparativa	Beckman Coulter	Avanti J-HC	Raccolta di cellule di E. coli dopo l'espressione proteica ricombinante
Provette da centrifuga in polistirene a fondo tondo	Corning	352057	lisato batterico chiaro
Eppendorf		S44I200005	Crescita a temperatura controllata di colture starter ed di espressione di E. coli
Cloruro di sodio	Sigma Aldrich	S5886	Componente del media M9
Bagno d'acqua sonicante e sorgente di vuoto	Thomas Scientific		Utilizzato per degassare soluzioni tampone
	Sonicatore Thermo Fisher	FB505110	Utilizzato per la lisi cellulare batterica o il taglio del DNA batterico
Spettrofotometro	Dilufotometro Implen	OD600 Monitoraggio	della crescita delle colture di espressione proteica di E.coli
Esculsione di dimensioni Superdex 200 16/600 colum	Cytvia	28989333	Fase finale di purificazione delle proteine
Software Topspin, versione 3.2 o successiva	Bruker		Software operativo per lo strumento NMR
Trasformazione di cellule di E. coli competenti	Thermo Fisher	C600003	One Shot BL21 Star (DE3) E. coli chimicamente competente, altri ceppi possono essere compatibili
Tris(2-carbossietil)fosfina (TCEP)	ThermoFisher	20490	Riducente compatibile con alcune coniugazioni sulfidril-reattive
Spettrofotometro UV-Vis	Implen	NP80	Misura della concentrazione proteica.
Bagnomaria, temperatura controllata	ThermoFisher	FSGPD25	Per la fase di shock termico della trasformazione batterica Estratto di
lievito	Sigma Aldrich	Y1625	Per l'integrazione di terreni M9, se necessario