L'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) è un metodo ampiamente utilizzato per caratterizzare le vescicole extracellulari. Questo documento evidenzia i parametri e i controlli sperimentali NTA oltre a un metodo uniforme di analisi e caratterizzazione di campioni e diluenti necessari per integrare le linee guida proposte da MISEV2018 e EV-TRACK per la riproducibilità tra laboratori.
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Articolo metodologico
Migliorare la riproducibilità per soddisfare le informazioni minime per gli studi sulle vescicole extracellulari 2018 Linee guida nell'analisi del tracciamento delle nanoparticelle
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) è stata uno dei numerosi metodi di caratterizzazione utilizzati per la ricerca sulle vescicole extracellulari (EV) dal 2006. Molti ritengono che gli strumenti NTA e i loro pacchetti software possano essere facilmente utilizzati seguendo una formazione minima e che la calibrazione delle dimensioni sia fattibile internamente. Poiché sia l'acquisizione di NTA che l'analisi del software costituiscono la caratterizzazione EV, sono affrontati in Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV2018). Inoltre, sono stati monitorati da Transparent Reporting and Centralizing Knowledge in Extracellular Vesicle Research (EV-TRACK) per migliorare la robustezza degli esperimenti EV (ad esempio, ridurre al minimo le variazioni sperimentali dovute a fattori incontrollati).
Nonostante gli sforzi per incoraggiare la segnalazione di metodi e controlli, molti articoli di ricerca pubblicati non riportano le impostazioni critiche necessarie per riprodurre le osservazioni originali NTA. Pochi articoli riportano la caratterizzazione NTA di controlli negativi o diluenti, evidentemente assumendo che i prodotti disponibili in commercio, come la soluzione salina tamponata con fosfato o l'acqua distillata ultrapura, siano privi di particolato. Allo stesso modo, i controlli positivi o gli standard di dimensione sono raramente riportati dai ricercatori per verificare il dimensionamento delle particelle. L'equazione di Stokes-Einstein incorpora la viscosità del campione e le variabili di temperatura per determinare lo spostamento delle particelle. La segnalazione della temperatura stabile della camera laser durante l'intera raccolta video del campione è, quindi, una misura di controllo essenziale per una replica accurata. Anche la filtrazione di campioni o diluenti non viene riportata di routine e, in tal caso, le specifiche del filtro (produttore, materiale della membrana, dimensione dei pori) e le condizioni di conservazione sono raramente incluse. Gli standard minimi di dettaglio sperimentale accettabile dell'International Society for Extracellular Vesicle (ISEV) dovrebbero includere un protocollo NTA ben documentato per la caratterizzazione dei veicoli elettrici. Il seguente esperimento fornisce la prova che un protocollo di analisi NTA deve essere stabilito dal singolo ricercatore e incluso nei metodi delle pubblicazioni che utilizzano la caratterizzazione NTA come una delle opzioni per soddisfare i requisiti MISEV2018 per la caratterizzazione di singole vescicole.
Introduzione
L'analisi accurata e ripetibile dei veicoli elettrici e di altre particelle su scala nanometrica presenta numerose sfide nella ricerca e nell'industria. La replica della ricerca EV è stata difficile, in parte, a causa della mancanza di uniformità nella segnalazione dei parametri necessari associati alla raccolta dei dati. Per affrontare queste carenze, l'ISEV ha proposto linee guida del settore come un insieme minimo di standard biochimici, biofisici e funzionali per i ricercatori EV e li ha pubblicati come una dichiarazione di posizione, comunemente indicata come MISEV20141. Il ritmo accelerato della ricerca sui veicoli elettrici ha richiesto ....
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Protocollo
1. Linee guida generali del protocollo
- Mantenere il microscopio su un tavolo d'aria o almeno su un tavolo privo di vibrazioni. Assicurarsi che le vibrazioni estranee (ad esempio, picchiettare il piede sul pavimento, toccare il tavolo, chiudere le porte, il traffico del laboratorio) siano ridotte al minimo.
- Impostare e mantenere la temperatura del modulo laser a una temperatura costante per tutte le registrazioni video.
NOTA: la temperatura scelta è stata di 25 °C perché l'analizzatore di dimensioni delle nanoparticelle è stato calibrato a quella temperatura. Pertanto, è importante che tutti gli utenti dello strumento conoscano e....
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Risultati
La tabella 1 contiene i risultati dei video NTA per i campioni di liposomi (18 filtrati e 18 non filtrati) e un diluente DPBS rappresentativo. I confronti tra i due gruppi sono stati completati indipendentemente dal livello della telecamera o dalla soglia di rilevamento in questo documento. I campioni filtrati avevano un diametro medio delle particelle di 108,5 nm, una modalità particellare di 86,2 nm e una concentrazione di 7,4 × 108 particelle/ml. Al contrario, i campioni non filtrati avevan.......
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Discussione
Esistono diversi metodi disponibili per stimare le dimensioni e la concentrazione delle nanoparticelle11. Questi includono metodi di ensemble che generano una stima delle dimensioni da una popolazione, tra cui lo scattering dinamico della luce (DLS), la sedimentazione centrifuga e l'analisi a livello di singola particella: microscopia elettronica, NTA, microscopia a forza atomica e rilevamento di impulsi resistivi sintonizzabili. Di questi, DLS e NTA sono metodi di misurazione delle dimensioni e d.......
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Dichiarazioni
Nessuno degli autori ha conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Il lavoro è stato supportato dallo stato del Kansas al Midwest Institute for Comparative Stem Cell Biology (MICSCB), al Johnson Cancer Research Center a MLW e nih R21AG066488 a LKC. OLS ha ricevuto il supporto GRA dal MICSCB. Gli autori ringraziano il Dr. Santosh Aryal per aver fornito i liposomi utilizzati in questo progetto e i membri dei laboratori Weiss e Christenson per conversazioni e feedback utili. Dr. Hong He è ringraziato per il supporto tecnico. MLW ringrazia Betti Goren Weiss per il suo supporto e i suoi consigli.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Pipettatore | |||
| Provette da Centrifuga, Coniche, Nunc 15 mL | Thermo Sci. | 339650 | |
| Kimwipes | |||
| Detergente per | |||
| Carta | |||
| NanoSight LM-10 | Malvern Panalytical | ||
| NanoSight LM-14 Modulo laser | Malvern Panalytical | ||
| Nanosight NTA Software Ver. 3.2 | Malvern Panalytical | ||
| Tovaglioli di carta Puntali per | |||
| pipette, 1-200 &; Puntali per | BioExpress | P -3243-200X | |
| , 50-1.000 &; L, filtrato, sterile | Soluzione salina BioExpress | P-3243-1250 | |
| fosfato di Dulbecco tamponato (senza Ca o Mg) | Standard Gibco | 14190-144 | |
| , trasferimento di lattice - 100 nm (3 mL) | Standard di NTA4088 | ||
| , trasferimento di lattice - 50 nm (3 ml) | Filtro | Malvern NTA4087 | |
| , 33 mm, .22 & micro; m, MCE, Sterile | marca Fisher | 09-720-004 | |
| Siringa, TB, 1 mL, punta a slittamento | Becton Dickinson | 309659 | |
| per liquidi di scarto |
Riferimenti
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).
- Thery, C., et al.
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Ristampe e permessi
