Qui delineiamo e dimostriamo un protocollo per l'isolamento primario delle cellule endoteliali sinusoidali epatiche del topo (LSEC). Il protocollo si basa sulla perfusione di collagenasi epatica, sulla purificazione delle cellule non parenchimali mediante centrifugazione a bassa velocità e sulla selezione magnetica delle perline CD146. Abbiamo anche fenotipo e caratterizzato questi LSECs isolati utilizzando la citometria a flusso e la microscopia elettronica a scansione.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Isolamento e caratterizzazione di cellule endoteliali sinusoidali primarie del fegato di topo
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule endoteliali sinusoidali epatiche (LSECs) sono cellule endoteliali specializzate situate all'interfaccia tra la circolazione e il parenchima epatico. Le LSEC hanno una morfologia distinta caratterizzata dalla presenza di fenestrae e dall'assenza di membrana basale. Le LSEC svolgono un ruolo essenziale in molti disturbi patologici del fegato, tra cui la disregolazione metabolica, l'infiammazione, la fibrosi, l'angiogenesi e la carcinogenesi. Tuttavia, poco è stato pubblicato sull'isolamento e la caratterizzazione delle LSEC. Qui, questo protocollo discute l'isolamento di LSEC da topi sani e non alcolici di steatosi epatica (NAFLD). Il protocollo si basa sulla perfusione di collagenasi del fegato di topo e sulla selezione positiva di perline magnetiche di cellule non parenchimali per purificare le LSECs. Questo studio caratterizza le LSEC utilizzando marcatori specifici mediante citometria a flusso e identifica le caratteristiche fenotipiche caratteristiche mediante microscopia elettronica a scansione. Le LSEC isolate seguendo questo protocollo possono essere utilizzate per studi funzionali, compresi saggi di adesione e permeabilità, nonché studi a valle per una particolare via di interesse. Inoltre, questi LSEC possono essere raggruppati o utilizzati singolarmente, consentendo la generazione di dati multi-omica tra cui RNA-seq bulk o singola cellula, proteomica o fosfo-proteomica e Assay for Transposase-Accessible Chromatin utilizzando il sequenziamento (ATAC-seq), tra gli altri. Questo protocollo sarà utile per i ricercatori che studiano la comunicazione delle LSEC con altre cellule epatiche in salute e malattia e consentirà una comprensione approfondita del ruolo delle LSEC nei meccanismi patogenetici del danno epatico acuto e cronico.
Introduzione
Le cellule endoteliali sinusoidali epatiche (LSECs) rivestono le pareti sinusoidi epatiche e sono le cellule non parenchimali più abbondanti nel fegato1. Le LSEC si distinguono dalle altre cellule endoteliali capillari in altre parti del corpo per la presenza di fenestrae e la mancanza di una membrana basale classica o di un diaframma 2,3. Quindi, le LSEC possiedono caratteristiche fenotipiche e strutturali distintive che migliorano la loro permeabilità e capacità endocitica di eliminare una varietà di macromolecole circolanti, inclusi lipidi e lipoproteine. Le LSEC svolgono un ruolo fo....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
I protocolli sugli animali sono stati condotti come approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Mayo Clinic. I topi maschi C57BL / 6J di otto settimane sono stati acquistati dal Jackson Laboratory. I topi sono stati alloggiati in una struttura a temperatura controllata 12: 12-h di ciclo chiaro-buio con libero accesso alla dieta.
1. Preparazione del piatto o del piatto di coltura rivestito di collagene
- Per produrre 50 mL di acido acetico 0,02 mol/L, aggiungere 0,6 mL di acido acetico glaciale a 49,4 mL di H2O.
- Produrre 50 μg/mL di collagene di tipo I in acido acetic....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Schemi sperimentali e messa a punto delle apparecchiature:
In questo protocollo, il fegato di topo è stato digerito utilizzando un circuito di perfusione chiuso, quindi le cellule non parenchimali e gli epatociti sono stati separati mediante centrifugazione a bassa velocità a 50 x g per 2 minuti. Le LSEC primarie sono state isolate utilizzando la selezione di perline magnetiche CD146 dalla frazione non parenchimale. Gli schemi sperimentali sono mostrati nella Figura 1A
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Nel manoscritto attuale, descriviamo un protocollo per l'isolamento LSEC dal fegato di topo costituito dalla perfusione di collagenasi in due fasi e dalla successiva selezione cellulare attivata magneticamente (MACS). Questo protocollo consiste nei seguenti tre passaggi: (1) Perfusione attraverso il PV con un tampone privo di calcio seguito da un tampone contenente collagenasi per ottenere la dispersione delle cellule epatiche; (2) Esclusione degli epatociti con centrifugazione a bassa velocità; e (3) selezione positiva .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Tutti gli autori non hanno conflitti da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases del NIH (1RO1DK122948 to SHI) e dal NIH Silvio O. Conte Digestive Diseases Research Core Centers P30 grant mechanism (DK084567). Il supporto è stato fornito a KF anche dalla Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Overseas Research Fellowships. Vorremmo anche ringraziare il Dr. Gregory J. Gores e Steven Bronk per il loro design originale e l'ottimizzazione dell'apparato di perfusione della collagenasi.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Catetere intravenoso (IV) da 2,0 pollici 20 G | Terumo, SOmerset, NJ, USA | SR-OX2051CA | |
| 2... Vassoio perfuion da 3 pollici con un foro al centro | personalizzato; prodotto in casa | ||
| 405/520 colorante di vitalità | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germania | 130-110-205 | |
| 4 pollici regolare curvo pinze da medicazione | Fisher Brand | FS16-100-110 | |
| 5-0 Sutura di seta Perma-Hand | Ethicon, Raritan, NJ, USA | A182H | |
| Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluorà 488 | MBL International, Woburn, MA, USA | D317-A48 | |
| BSA stock | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germania | 130-091-376 | |
| Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-topo | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germania | 130-118-407 | |
| CD146 (LSEC) MicroBeads, topo | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germania | 130-092-007 | |
| Anti-CD45-Viogreen, anti-topo | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germania | 130-110-803 | |
| Collagene di tipo I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | |
| Collagenasi II | Gibco, Waltham, MA, USA | 17101-015 | |
| Mezzo di crescita delle cellule endoteliali | ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA | 211-500 | |
| Reagente bloccante FcR, topo | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germania | 130-092-575 | |
| Software FlowJo, versione 10.6 | Becton, Dickinson and Company | ||
| Forbici fini temprate | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14091-11 | |
| Riscaldato (37 ° C) e un apparecchio di perfusione a ricircolo umidificato dotato di iniezione di ossigeno a una velocità di 10 psi. | su misura; fatto in casa | ||
| Hitachi S 4700 microscopio elettronico a scansione | Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA | SEM096 | |
| Colonne LS | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germania | 130-042-401 | |
| Filtri di pre-separazione MACS (70 μ m) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germania | 130-095-823 | |
| Tampone di risciacquo MACS | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germania | 130-091-222 | |
| MACS Smart Strainer (70 μ m) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germania | 130-098-462 | |
| Citometro a flusso MACSQunt | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germania | ||
| Inserto per colture cellulari Millicell Millipore | Sigma, Burlington, MA, USA | Contatore | |
| Nexcelom | Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA | Cellometro Auto T4 Plus | |
| Percoll | GE Healthcare, Chicago, IL, USA | 17-0891-01 | |
| Forbici chirurgiche | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14001-12 | |
| Pinza per medicazione curva molto piccola | F.S.T, Foster city, CA, USA | 11063-07 |
Riferimenti
- Morin, O., Goulet, F., Normand, C. Liver sinusoidal endothelial cells: isolation, purification, characterization and interaction with hepatocytes. Revisiones Sobre Biologia Celular: RBC. 15, 1-85 (1988).
- Ibrahim, S. H.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
