Questo protocollo mostra un approccio accurato e oggettivo per visualizzare le titolazioni virali utilizzando il viola cristallino, confrontandolo con la microscopia ottica e la colorazione immunocitochimica.
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Articolo metodologico
Uso di Crystal Violet per migliorare la lettura basata sull'effetto citopatico visivo per la titolazione virale utilizzando i saggi TCID50
In questo articolo
Sommario
Abstract
La titolazione virale è un test chiave per la ricerca virologica. Il rilevamento dell'effetto citopatico (CPE) tramite saggi TCID50 e saggi di unità di formazione della placca (PFU) sono i due metodi principali per calcolare il titolo di un virus e sono spesso basati sul rilevamento al microscopio o sulla colorazione cellulare per la visualizzazione. Nel caso del test TCID50, la visualizzazione oggettiva si basa comunemente sulla colorazione immunocitochimica (ICC) del virus intracellulare per calcolare i titoli combinati con il rilevamento visivo cpe tramite microscopia. Tuttavia, la colorazione ICC è costosa e richiede tempo. In questo studio, abbiamo confrontato l'osservazione visiva della CPE tramite microscopia, la colorazione ICC e la colorazione viola cristallina per determinare i titoli di due virus che formano CPE, il virus dell'influenza A (IAV) di origine suina e il virus della sindrome riproduttiva e respiratoria suina (PRRSV). Mostriamo che sia la colorazione viola cristallo che icc sono più accurate del rilevamento visivo CPE, presentando livelli di precisione quasi identici sia su IAV che su PRRSV. Per questo motivo, qui presentiamo la colorazione viola cristallina come un modo più rapido e conveniente per determinare le titolazioni virali su un test TCID50 per virus che formano CPE titolati in linee cellulari.
Introduzione
La titolazione virale tramite test TCID50 è una tecnica comunemente usata nella ricerca sulle malattie infettive1. Sebbene nel tempo siano state proposte variazioni sulla matematica alla base di questo metodo1,2,3,4, i metodi attualmente applicati di rilevamento delle infezioni si basano sulla conferma visiva attraverso la presenza di effetto citopatico (CPE) utilizzando la microscopia5. Per confermare la visualizzazione CPE in modo più obiettivo sui saggi TCID50, la colorazione intrac....
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Protocollo
1. Protocollo di titolazione
NOTA: Utilizzare un virus citopatico che infetta le cellule aderenti. Per questa dimostrazione sono stati utilizzati il virus dell'influenza A (IAV) di origine suina (A/California/07/2009/(H1N1)) e il virus della sindrome riproduttiva e respiratoria suina (PRRSV) di tipo 2, ceppo NC 1-7-4.
- Titolare questi virus in 96 piastre di pozzo per 7 giorni in un armadio di biosicurezza situato in un laboratorio di livello di biosicurezza 2 (BSL-2).
- Per eseguire queste titolazioni, seminare 96 piastre di pozzo con la linea cellulare richiesta. Per PRRSV, utilizzare la linea cellulare MA-1....
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Risultati
Le equazioni utilizzate per calcolare matematicamente il titolo erano state precedentemente descritte2,3.
In breve, per PRRSV, applichiamo il metodo Karber:
Titolo (TCID50) = 10 T + 1.3 dove:
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Discussione
Le titolazioni virali sono abitualmente utilizzate nella ricerca virologica, con il rilevamento PFU e i saggi TCID50 più comunemente usati1,2,3,4. Entrambi i metodi si basano sul rilevamento di CPE nelle cellule infette e, anche se possono essere valutati visivamente tramite microscopia, di solito viene applicata una colorazione per ottenere un risultato più obiettivo o addirittura per.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori vorrebbero ringraziare il Dr. Frank Scholle per i suoi utili commenti nel manoscritto, Chloe Mariant per il suo aiuto con le immagini al microscopio e Teresa M. Tiedge per la sua utile revisione in inglese.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| piastre per colture cellulari a 96 pozzetti | Genesee | 25-221 | trasparente a fondo piatto |
| Thermo Fisher | 1122 | ||
| Cristallovioletto | Thermo Fisher | C581-25; C581-100 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| Siero fetale bovino | BioWest | S1480 | |
| Paraformaldehide | Thermo Fisher | J19943 | |
| Anticorpo primario dell'influenza | Bioss | BS-0344R | |
| Anticorpo primario PRRSV | Bioss | BS-10043R | |
| Saponina | Thermo Scientific | ||
| Anticorpo secondario | Invitrogen | 31460 | |
| Tris cloridrato | Thermo Scientific | AM9856 |
Riferimenti
- Kärber, G. Contribution to the collective treatment of pharmacological series experiments. Naunyn-Schmiedeberg's Archive for Experimental Pathology and Pharmacology. 162 (4), 480-483 (1931).
- Ramakrishnan, M. A.
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Ristampe e permessi
