Il presente protocollo descrive l'iniezione di cellule di osteosarcoma intratibia per generare modelli murini portatori di osteosarcoma ortotopico e lesioni da metastasi polmonari.
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Articolo metodologico
Iniezione di cellule di osteosarcoma intratibiale per generare modelli murini di osteosarcoma ortotopico e metastasi polmonari
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'osteosarcoma è il tumore osseo primario più comune nei bambini e negli adolescenti, con i polmoni come sito metastatico più comune. Il tasso di sopravvivenza a cinque anni dei pazienti con osteosarcoma con metastasi polmonari è inferiore al 30%. Pertanto, l'utilizzo di modelli murini che imitano lo sviluppo dell'osteosarcoma negli esseri umani è di grande importanza per comprendere il meccanismo fondamentale della carcinogenesi dell'osteosarcoma e delle metastasi polmonari per sviluppare nuove terapie. Qui, vengono riportate procedure dettagliate per generare l'osteosarcoma primario e i modelli murini di metastasi polmonari tramite iniezione intratibiale di cellule di osteosarcoma. In combinazione con il sistema di bioluminescenza o di imaging live a raggi X, questi modelli murini viventi vengono utilizzati per monitorare e quantificare la crescita e le metastasi dell'osteosarcoma. Per stabilire questo modello, una matrice di membrana basale contenente cellule di osteosarcoma è stata caricata in una siringa a micro-volume e iniettata in una tibia di ciascun topo atimico dopo essere stata anestetizzata. I topi sono stati sacrificati quando l'osteosarcoma primario ha raggiunto il limite di dimensioni nel protocollo approvato dalla IACUC. Le gambe portanti osteosarcoma e i polmoni con lesioni metastasi sono stati separati. Questi modelli sono caratterizzati da un breve periodo di incubazione, rapida crescita, lesioni gravi e sensibilità nel monitoraggio dello sviluppo di lesioni metastatiche primarie e polmonari. Pertanto, questi sono modelli ideali per esplorare le funzioni e i meccanismi di fattori specifici nella carcinogenesi dell'osteosarcoma e nelle metastasi polmonari, nel microambiente tumorale e valutare l'efficacia terapeutica in vivo.
Introduzione
L'osteosarcoma è il tumore osseo primario più comune nei bambini e negli adolescenti 1,2, che si infiltra principalmente nel tessuto circostante e persino metastatizza ai polmoni quando i pazienti vengono diagnosticati. Le metastasi polmonari sono la sfida principale per la terapia con osteosarcoma e il tasso di sopravvivenza a cinque anni dei pazienti con osteosarcoma con metastasi polmonari rimane basso come 20%-30%3,4,5. Tuttavia, il tasso di sopravvivenza a cinque anni dell'osteosarcoma primario è stato aumentato a circa il 70% dal 1970 a causa dell'introduzione della chemioterapia6. Pertanto, è urgente comprendere il meccanismo fondamentale della carcinogenesi dell'osteosarcoma e delle metastasi polmonari per sviluppare nuove terapie. L'applicazione di modelli murini che meglio imitano la progressione dell'osteosarcoma negli esseri umani è di grande importanza7.
I modelli animali di osteosarcoma sono generati da ingegneria genetica spontanea indotta, trapianto e altre tecniche. Il modello di osteosarcoma spontaneo è usato raramente a causa del lungo tempo di formazione del tumore, del tasso di insorgenza tumorale incoerente, della bassa morbilità e della scarsa stabilità 8,9. Sebbene il modello di osteosarcoma indotto sia più accessibile da ottenere rispetto all'osteosarcoma spontaneo, l'applicazione del modello di osteosarcoma indotto è limitata perché il fattore induttore influenzerà il microambiente, la patogenesi e le caratteristiche patologiche dell'osteosarcoma10. I modelli transgenici stanno aiutando a comprendere la patogenesi dei tumori poiché possono simulare meglio gli ambienti fisiologici e patologici umani; tuttavia, i modelli animali transgenici hanno anche i loro limiti a causa della difficoltà, del lungo termine e dell'alto costo della modifica transgenica. Inoltre, anche nei modelli animali transgenici più ampiamente accettati generati dalla modificazione del gene p53 e Rb, solo il 13,6% del sarcoma si è verificato nelle ossa dei quattro arti11,12.
Il trapianto è uno dei metodi di produzione di modelli di cancro metastatico primario e a distanza più comunemente usati negli ultimi anni grazie alla sua semplice manovra, al tasso di formazione del tumore stabile e alla migliore omogeneità13. Il trapianto comprende il trapianto eterotopico e il trapianto ortotopico in base ai siti di trapianto. Nel trapianto eterotopico di osteosarcoma, le cellule dell'osteosarcoma vengono iniettate al di fuori dei siti primari di osteosarcoma (osso) degli animali, comunemente sotto la pelle, per via sottocutanea14. Sebbene il trapianto eterotopico sia semplice senza la necessità di eseguire interventi chirurgici negli animali, i siti in cui vengono iniettate le cellule dell'osteosarcoma non rappresentano l'effettivo microambiente dell'osteosarcoma umano. Il trapianto ortotopico di osteosarcoma è quando le cellule dell'osteosarcoma vengono iniettate nelle ossa degli animali, come la tibia15,16. Rispetto agli innesti eterotopici, gli innesti di osteosarcoma ortotopico sono caratterizzati da un breve periodo di incubazione, rapida crescita e forte natura erosiva; pertanto, sono modelli animali ideali per gli studi relativi all'osteosarcoma17.
Gli animali più comunemente usati sono topi, cani e pesci zebra18,19. Il modello spontaneo di osteosarcoma è solitamente usato nei cani perché l'osteosarcoma è uno dei tumori più comuni nei cani. Tuttavia, l'applicazione di questo modello è limitata a causa del lungo tempo di formazione del tumore, del basso tasso di tumorigenesi, della scarsa omogeneità e della stabilità. I pesci zebra sono spesso usati per costruire modelli tumorali transgenici o knockout a causa della loro rapida riproduzione20. Ma i geni zebrafish sono diversi dai geni umani, quindi le loro applicazioni sono limitate.
Questo lavoro descrive le procedure dettagliate, le precauzioni e le immagini rappresentative per la produzione dell'osteosarcoma primario nella tibia con metastasi polmonari tramite iniezione intratibiale di cellule di osteosarcoma in topi atimici. Questo metodo è stato applicato per creare l'osteosarcoma primario nella tibia del topo per la valutazione dell'efficacia terapeutica, che ha mostrato un'elevata riproducibilità21,22.
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal comitato per il benessere degli animali dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Shanghai. Topi atimici MASCHI BALB/c di quattro settimane sono stati acclimatati per una settimana prima dell'intervento chirurgico per iniezione ortotopica di cellule di osteosarcoma. I topi sono stati alloggiati in gabbie per topi ventilate individualmente con cinque topi per gabbia in un ciclo luce / buio di 12 ore con accesso ad libitum al mangime SPF e acqua sterile.
1. Preparazione delle cellule
- Il giorno dell'iniezione della cellula di osteosarcoma (143B-Luciferasi), lavare l'80%-90% delle cellule confluenti coltivate in un piatto di coltura cellulare di 10 cm due volte con PBS (pH 7,4) e tripsinizzare con 1,5 ml di tripsina allo 0,25% per 3 minuti. Quindi, aggiungere 6 ml di mezzi MEM contenenti siero al 10% per estinguere la tripsina e raccogliere le cellule in un tubo centrifugo da 15 ml.
NOTA: La linea cellulare 143B-Luciferasi è ottenuta dalla linea cellulare 143B trasfetta con il vettore pLV-luciferasi23. - Aspirare 20 μL di sospensione cellulare nella camera della piastra di conteggio delle celle e calcolare la concentrazione cellulare utilizzando un contatore automatico di celle (vedere Tabella dei materiali).
- Centrifugare le celle a 800 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Aspirare il surnatante con una pipetta e risospese il pellet cellulare in una matrice di membrana basale da 8,5 mg/mL (vedere Tabella dei materiali) fino a una concentrazione finale di 2 x 107 celle/mL.
- Mantenendo le cellule sul ghiaccio, portarle in sala operatoria. Le celle devono essere utilizzate entro 2 ore.
NOTA: per evitare dosi di iniezione imprecise (ad esempio, a causa dello spazio morto nelle siringhe), viene preparata una sospensione cellulare extra (di solito due volte il volume richiesto di sospensione cellulare). La matrice della membrana basale viene mantenuta sempre sul ghiaccio poiché ha proprietà di coagulazione al di sopra della temperatura ambiente24.
2. Chirurgia per iniezione ortotopica delle cellule dell'osteosarcoma
NOTA: gli strumenti chirurgici sono mostrati nella Figura 1.
- I topi sono stati allevati in condizioni specifiche prive di agenti patogeni. Tutte le procedure sono state eseguite in un armadio asettico con strumenti sterili.
- Anestetizzare i topi esponendoli al 2% di isoflurano e al 98% di ossigeno (portata di ossigeno, 2 L/min).
- Applicare una piccola quantità di unguento oftalmico sugli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
NOTA: eseguire l'intera procedura in un'area ben ventilata. Prima dell'iniezione di cellule di osteosarcoma, assicurarsi che ogni topo sia in anestesia profonda da un pizzico di punta; se il mouse ha ancora risposte, come contrazioni o scatti, attendere a lungo fino a quando le risposte precedenti scompaiono. - Tenere ogni mouse in posizione supina. Tenere la caviglia del mouse usando il pollice e l'indice e disinfettare il sito di iniezione della tibia con un tampone di etanolo al 70%.
NOTA: Per tenere saldamente la caviglia del mouse, sia il pollice che la punta delle dita indice sono di grande importanza per le procedure successive. - Ruotare l'articolazione della caviglia di ciascun topo verso l'esterno per spostare la tibia e il perone e piegare l'articolazione del ginocchio in una posizione adatta fino a quando il plateau prossimale della tibia (la parte superiore della tibia) è chiaramente visibile attraverso la pelle (Figura 2A).
- Attaccare l'ago a una siringa da 1 mL e puntare la punta dell'ago verso il sito di iniezione. Assicurarsi che l'ago della siringa sia parallelo all'asse lungo della tibia.
- Inserire per via percutanea l'ago attraverso o adiacente al legamento rotuleo mentre passa attraverso la capsula cutanea / articolare; th0en, ruotare la siringa (da 1/2 a 3/4 di cerchio) per praticare un foro attraverso la piattaforma della tibia verso l'estremità distale della tibia (cavità midollare) per l'iniezione di cellule di osteosarcoma con una siringa a micro-volume (Figura 2B,C).
NOTA: la rotazione simultanea della tibia può essere percepita durante la perforazione se la punta dell'ago è accurata. Assicurarsi che il needling si muova in avanti con la rotazione della siringa piuttosto che essere spinto direttamente in avanti fino a quando circa la metà dell'ago si trova nella tibia.
- Inserire per via percutanea l'ago attraverso o adiacente al legamento rotuleo mentre passa attraverso la capsula cutanea / articolare; th0en, ruotare la siringa (da 1/2 a 3/4 di cerchio) per praticare un foro attraverso la piattaforma della tibia verso l'estremità distale della tibia (cavità midollare) per l'iniezione di cellule di osteosarcoma con una siringa a micro-volume (Figura 2B,C).
- Controllare se l'ago della siringa ha fatto un movimento prominente nel canale midollare per garantire il successo della perforazione.
NOTA: Eseguire un esame a raggi X (vedere Tabella dei materiali) per confermare la corretta posizione dell'ago e raccogliere le immagini. - Caricare la sospensione cellulare di osteosarcoma 143B (dal punto 1.5) in una siringa di micro-volume e sostituire la siringa da 1 mL nella tibia con la siringa a microvolume caricata a cellule da 143B (Figura 2D). Iniettare lentamente ~ 10 μL (ignorare la soluzione preesistente nell'ago) di sospensione cellulare 143B nella tibia di ciascun topo atimico (circa 2 x 105 cellule) senza applicare alta pressione.
- Premere il sito di iniezione con un batuffolo di cotone per 20-30 s quando la siringa di micro-volume viene rimossa.
- Rimettere ogni topo in una gabbia pulita e monitorare attentamente fino a quando il mouse non è completamente recuperato dall'anestesia (circa 10 minuti).
- Monitorare la crescita del tumore in vivo utilizzando un sistema di imaging a raggi X. Misurare il diametro più lungo (a) e il diametro corto (b) della massa tumorale ogni settimana con una pinza per il calcolo del volume tumorale (V): V = 1/2 x a x b2.
NOTA: Anestetizzare i topi esponendoli al 2% di isoflurano e al 98% di ossigeno. I topi sono stati anestetizzati per l'imaging a raggi X. L'iniezione intratibia di cellule di osteosarcoma marcate con luciferasi o proteine fluorescenti consente il monitoraggio delle lesioni da osteosarcoma primarie e metastatiche.
NOTA: gli endpoint umani dei topi con osteosarcoma a causa della crescita tumorale del ginocchio e delle metastasi polmonari erano basati sui seguenti criteri: (1) Punteggio delle condizioni corporee, (2) soglia di perdita di peso del 20%, (3) diametro massimo medio dei tumori di 2 cm o (4) comportamento animale gravemente limitato.
3. Esame patologico (raccolta di campioni di osteosarcoma metastatico primario e polmonare per l'analisi)
- Sei settimane dopo l'iniezione di cellule di osteosarcoma, sacrificare i topi per lussazione cervicale dopo averli esposti per inalazione di CO2 .
- Tenere il mouse in posizione supina e allungare entrambi gli arti posteriori.
- Separare le gambe intere che portano osteosarcoma dall'area inguinale.
NOTA: Assicurarsi che tutte le gambe siano separate dallo stesso sito anatomico. - Preparare il campione istologico di gambe portanti osteosarcoma rimuovendo la pelle, i muscoli e i piedi, quindi fissare il campione di ciascun topo in un tubo da 50 ml con 20 ml di soluzione di formalina (10%) per 24 ore, seguito da decalcificazione in soluzione di EDTA al 10% per 14 giorni con occasionale cambio tampone.
- Incorporare il campione in paraffina e preparare sezioni per l'esame istologico a seguito del lavoro precedentemente pubblicato25.
- Separare delicatamente i polmoni e metterli in un tubo da 50 ml riempito con 20 ml di soluzione di formalina (10%). Dopo 24 ore, trasferire i polmoni di ciascun topo in un tubo da 15 ml con etanolo al 70%. Incorporare i polmoni nella paraffina per la colorazione di ematossilina ed eosina (H & E) e il test immunoistochimico25.
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Risultati
Il successo dell'osteosarcoma ortotopico (primario) e dei modelli polmonari metastatici dipendono dall'accurata iniezione ortotopica delle cellule dell'osteosarcoma. Qui, è stato sviluppato con successo un modello di osteosarcoma ortotopico (primario) tramite iniezione intratibiale di cellule di osteosarcoma. La Figura 3A mostra un osteosarcoma ortotopico (primario) rappresentativo del topo e la Figura 3B mostra un osteosarcoma ortotopico (primario) iso...
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Discussione
L'iniezione ortotopica di cellule di osteosarcoma è un modello ideale per studiare la funzione e il meccanismo di fattori specifici nella carcinogenesi dell'osteosarcoma e nello sviluppo per valutare l'efficacia terapeutica. Per evitare differenze nella crescita del tumore, la maggior parte delle cellule di osteosarcoma attive all'80% -90% confluenti con lo stesso numero vengono accuratamente iniettate nella tibia di ciascun topo e il tempo di tripsinizzazione cellulare è strettamente controllato senza influire sulla vit...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo studio è stato supportato da sovvenzioni di (1) National Key R&D Program of China (2018YFC1704300 e 2020YFE0201600), (2) National Nature Science Foundation (81973877 e 82174408).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Contatore automatico di cellule | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Conteggio delle cellule |
| Macchina per anestesia | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | R500IP | L'attrezzatura dei topi per anestesia |
| BALB/c topi atimici | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd. | / | animale |
| Matrice della membrana basale | Shanghai Uning Bioscience Technology Co., Ltd | 356234, BD, Matrigel | ri-sospendere le cellule |
| Sistema di imaging a bioluminescenza | Shanghai Baitai Technology Co., Ltd | Vieworks | che monitora la crescita del tumore e le metastasi polmonari, se la cellula di iniezione è marcata dalla luciferasi |
| Provetta da centrifuga (15 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuga le cellule |
| isoflurano | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | VETEASY | Anestesia topi MEM |
| media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Mezzo di coltura cellulare |
| Siringa per micro-volume Shanghai | alta industria e commercio Co., Ltd | 0-50 μ L | Iniettare cellule precise nella tibia |
| Soluzione salina tamponata con fosfato | Beyotime Biotechnology | ST447 | lavare le cellule dell'osteosarcoma umano |
| Siringhe da 1 ml | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd | 20200411 | perforazione |
| cellulare 143B | ATCC | CRL-8303 | cellulare per osteosarcoma |
| Tripsina (0,25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, trattamento con | tripsina Gibco delle cellule |
| Trypan blue | Beyotime Biotechnology | ST798 | Colorazione delle cellule per valutare il vettore di attività |
| (pLV-luciferasi) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | VL3613 | Lipofectamina plasmidica |
| 2000 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 11668027, Thermo fisher | Reagente di trasfezione plasmidica |
| Imaging a raggi X Brook | (Beijing) Technology Co., Ltd | Le | immagini a raggi X FX PRO sono state ottenute per rilevare la crescita del tumore |
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Ristampe e permessi
