Questo articolo descrive un protocollo per determinare le differenze nello stato redox basale e le risposte redox alle perturbazioni acute nei neuroni primari dell'ippocampo e corticale utilizzando la microscopia confocale dal vivo. Il protocollo può essere applicato ad altri tipi di cellule e microscopi con modifiche minime.
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Articolo metodologico
Imaging dal vivo dello stato redox del glutatione mitocondriale nei neuroni primari utilizzando un indicatore raziometrico
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'omeostasi redox mitocondriale è importante per la vitalità e la funzione neuronale. Sebbene i mitocondri contengano diversi sistemi redox, il glutatione tampone redox tiolo-disolfuro altamente abbondante è considerato un attore centrale nelle difese antiossidanti. Pertanto, la misurazione del potenziale redox del glutatione mitocondriale fornisce informazioni utili sullo stato redox mitocondriale e sullo stress ossidativo. La glutaredossina1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) è un indicatore raziometrico basato su proteine fluorescenti verdi (GFP) geneticamente codificate del potenziale redox del glutatione che ha due picchi di eccitazione sensibili allo stato redox a 400 nm e 490 nm con un singolo picco di emissione a 510 nm. Questo articolo descrive come eseguire la microscopia confocale dal vivo di Grx1-roGFP2 mirato ai mitocondri nei neuroni primari dell'ippocampo e corticale. Descrive come valutare il potenziale redox del glutatione mitocondriale allo stato stazionario (ad esempio, per confrontare stati patologici o trattamenti a lungo termine) e come misurare i cambiamenti redox sui trattamenti acuti (usando il farmaco eccitotossico N-metil-D-aspartato (NMDA) come esempio). Inoltre, l'articolo presenta la co-imaging di Grx1-roGFP2 e l'indicatore del potenziale di membrana mitocondriale, tetrametilrodramina, estere etilico (TMRE), per dimostrare come Grx1-roGPF2 può essere multiplexato con indicatori aggiuntivi per analisi multiparametriche. Questo protocollo fornisce una descrizione dettagliata di come (i) ottimizzare le impostazioni del microscopio a scansione laser confocale, (ii) applicare farmaci per la stimolazione seguiti dalla calibrazione del sensore con diammide e ditiotreitolo e (iii) analizzare i dati con ImageJ / FIJI.
Introduzione
Diversi importanti enzimi mitocondriali e molecole di segnalazione sono soggetti alla regolazione redox del tiolo1. Inoltre, i mitocondri sono una delle principali fonti cellulari di specie reattive dell'ossigeno e sono selettivamente vulnerabili al danno ossidativo2. Di conseguenza, il potenziale redox mitocondriale influenza direttamente la bioenergetica, la segnalazione cellulare, la funzione mitocondriale e, infine, la vitalità cellulare3,4. La matrice mitocondriale contiene elevate quantità (1-15 mM) del glutatione tampone redox tiolo-disolfuro (GSH) per man....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali erano conformi alle linee guida nazionali e istituzionali, compresa la direttiva 2010/63/UE del Parlamento europeo del Consiglio, e avevano la piena approvazione etica del Ministero degli Interni (Ufficio per il benessere degli animali dell'Università di Heidelberg e Regierungspraesidium Karlsruhe, licenze T14/21 e T13/21). I neuroni primari dell'ippocampo e corticale sono stati preparati da cuccioli di topo o ratto appena nati secondo procedure standard e sono stati mantenuti per 12-14 giorni come descritto in precedenza13.
1. Preparazione delle soluzioni
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Risultati
Quantificazione delle differenze nello stato redox mitocondriale allo stato stazionario dopo la sospensione del fattore di crescita
Per dimostrare la quantificazione delle differenze allo stato stazionario nello stato redox mitocondriale, i neuroni primari cresciuti in mezzo standard sono stati confrontati con i neuroni coltivati senza fattori di crescita per 48 ore prima dell'imaging. L'astinenza del fattore di crescita provoca la morte delle cellule neuronali apoptotiche dopo 72 h1.......
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Discussione
Le misurazioni quantitative e dinamiche dello stato redox mitocondriale forniscono importanti informazioni sulla fisiologia mitocondriale e cellulare. Sono disponibili diverse sonde chimiche fluorogeniche che rilevano specie reattive dell'ossigeno, "stress redox" o "stress ossidativo". Tuttavia, questi ultimi termini non sono ben definiti e spesso mancano di specificità9,17,18. Rispetto ai coloranti chimici, Grx1-roGFP2 offre di.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (BA 3679/5-1; PER 2289: BA 3679/4-2). A.K. è supportato da una borsa di studio ERASMUS+. Ringraziamo Iris Bünzli-Ehret, Rita Rosner e Andrea Schlicksupp per la preparazione dei neuroni primari. Ringraziamo il Dr. Tobias Dick per aver fornito pLPCX-mito-Grx1-roGFP2. Gli esperimenti mostrati nella Figura 4 sono stati eseguiti presso il Nikon Imaging Center, Università di Heidelberg. La figura 2 è stata preparata con BioRender.com.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| forti | |||
| Cloruro di calcio (CaCl2· 2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Diamide (DA) | Sigma-Aldrich | D3648 | |
| Ditiotreitolo (DTT) | Carl Roth GmbH | 6908.1 | |
| Glucosio (2,5 M soluzione madre) | Sigma-Aldrich | G8769 | |
| Glucosio | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Glicina | neoFroxx GmbH | LC-4522.2 | |
| HEPES (1 soluzione madre M) | Sigma-Aldrich | 15630-080 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Cloruro di magnesio (MgCl2· 6H2O) | Sigma-Aldrich | 442611-M | |
| N-metil-D-aspartato (NMDA) | Sigma-Aldrich | M3262 | |
| Cloruro di potassio (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Cloruro di sodio (NaCl) | neoFroxx GmbH | LC-5932.1 | |
| Piruvato di sodio (0,1 M soluzione madre) | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Piruvato di sodio | Sigma-Aldrich | P8574 | |
| Saccarosio | Carl Roth GmbH | 4621.1 | |
| Perclorato di estere etilico tetrametilrodamina (TMRE) | Sigma-Aldrich | 87917 | |
| equipment | |||
| imaging chamber | Life Imaging Services (Basilea, Svizzera) | 10920 | Camera Ludin Tipo 3 per & Oslash; Vetrini coprioggetti da 12 mm |
| , microscopio Confocale a scansione laser | Leica | DMI6000 | |
| , unità di scansione, | VWR | ||
| PP1080 181-4001 | |||
| microscopio confocale a disco rotante | Hamamatsu | C9100-02, EMCCD | |
| , microscopio confocale a disco rotante, sistema di incubazione | TokaiHit | INU-ZILCF-F1 | |
| microscopio a disco rotante, microscopio, | microscopio | Nikon | |
| , microscopio confocale a disco rotante, unità di scansione | Yokagawa | CSU-X1 | |
| software | |||
| FIJI | https://fiji.sc | ||
| StackReg plugin | |||
| Plug-in | https://github.com/fiji-BIG/TurboReg/blob/master/src/main/java/TurboReg_.java |
Riferimenti
- Roede, J. R., Go, Y. M., Jones, D. P. Redox equivalents and mitochondrial bioenergetics. Methods in Molecular Biology. 810, 249-280 (2012).
- Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. Journal of Physiology. 552, Pt 2 335-344 (2003).
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Ristampe e permessi
