Method Article

Elaborazione dei campioni di Shotgun Proteomics automatizzata da un robot da laboratorio open source

DOI:

10.3791/63092

⸱

October 28th, 2021

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1Department of Medicine-Cardiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Department of Biochemistry & Molecular Genetics, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 3Consortium for Fibrosis Research & Translation, School of Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

In This Article

Summary

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Protocollo dettagliato e tre script Python sono forniti per il funzionamento di un sistema di gestione dei liquidi robotico open source per eseguire la preparazione semi-automatizzata di campioni proteici per esperimenti di spettrometria di massa, che coprono la rimozione del detergente, la digestione delle proteine e le fasi di desalinizzazione dei peptidi.

Abstract

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Gli esperimenti di proteomica a fucile basati sulla spettrometria di massa richiedono più fasi di preparazione del campione, tra cui la digestione e la pulizia enzimatica delle proteine, che possono richiedere significative ore di lavoro al banco e presentare una fonte di variabilità da lotto a lotto. L'automazione di laboratorio con robot di pipettaggio può ridurre il lavoro manuale, massimizzare la produttività e aumentare la riproducibilità della ricerca. Tuttavia, i prezzi di partenza elevati delle stazioni di automazione standard le rendono inaccessibili per molti laboratori accademici. Questo articolo descrive un flusso di lavoro di preparazione dei campioni di proteomica utilizzando un conveniente sistema di automazione open source (The Opentrons OT-2), comprese le istruzioni per l'impostazione di passaggi semi-automatizzati di riduzione delle proteine, alchilazione, digestione e pulizia; così come gli script Python open source di accompagnamento per programmare il sistema OT-2 attraverso la sua interfaccia di programmazione delle applicazioni.

Introduction

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La proteomica del fucile a pompa basata sulla spettrometria di massa è un potente strumento per misurare l'abbondanza di molte proteine in campioni biologici contemporaneamente. Gli esperimenti di proteomica con l'analisi bioinformatica sono abitualmente impiegati per identificare i biomarcatori e scoprire complessi biologici associati e percorsi alla base dei meccanismi patologici. Con la sua elevata specificità analitica e la potenziale accuratezza quantitativa, la proteomica del fucile da caccia ha anche un eccellente potenziale per essere adottata da strutture di ricerca e laboratori diagnostici per l'analisi di campioni clinici senza la necessità di fare affidame....

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Protocol

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Gli script Python sviluppati sono stati depositati su GitHub all'indirizzo: https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons. Una copia degli script è fornita nel file supplementare 1. Fare riferimento al repository GitHub per le versioni più recenti.

1. Preparazioni sperimentali

  1. Controllare l'hardware richiesto prima di avviare il protocollo.
    NOTA: sono necessari i seguenti componenti hardware: pipette OT-2, punte per pipette, set di rack per tubi 4 in 1, set di blocchi di alluminio, modulo magnetico, modulo di temperatura, piastre per pozzi profondi 2 ml a 96 pozzetti (vedere

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Results

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Qui vengono forniti tre script Python compatibili con il robot OT-2 e che eseguono la preparazione del campione per la proteomica della spettrometria di massa con una singola proteina standard di albumina sierica bovina (replica tecnicamente n = 5 digestioni) e un campione di lisato cardiaco umano contenente detergente (n = 5 digestioni). Ogni prodotto digestivo è suddiviso in due reazioni di pulizia peptidica. Il numero di corrispondenze peptidiche-spettro (PSM), peptidi e proteine identificati in ogni serie di campioni.......

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Discussion

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Passaggi critici all'interno del protocollo
Per ottenere le migliori prestazioni, è necessario utilizzare labware, moduli e materiali di consumo compatibili con OT-2 verificati da Opentrons. Il labware personalizzato può essere creato seguendo le istruzioni di Opentrons su Reference14. Assicurarsi di calibrare il deck OT-2, le pipette e il labware quando vengono utilizzati per la prima volta. È anche fondamentale seguire le linee guida del produttore di perline SP3 per preparar.......

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Disclosures

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Gli autori non hanno conflitti da dichiarare.

Acknowledgements

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Questo lavoro è stato supportato in parte dai premi NIH F32-HL149191 a YH; R00-HL144829 a EL; R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278 a MPL. La Figura 1, la Figura 2, la Figura 3 vengono create con l'ausilio di uno strumento di illustrazione scientifica basato sul Web, BioRender.com.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
300 µ SetOpentrons Opentrons
4 in 1OpentronsOgni set include 2 supporti di base e 4 parti superiori del supporto per provette da 1,5 ml, 2 ml, 15 ml + 50 ml, 15 ml e 50 ml. In questo studio utilizziamo 2 ml e 15 ml + 50 ml di top.
Colonna HPLC Acclaim PepMap 100 C18Thermo Scientific#1645683 μ particella m; 100 & Aring; poro; 75 μ m x 150 mm
Acetonitrile LC-MS gradoVWR#JT9829
Set di blocchi in alluminioOpentronsQuesto set di blocchi include 3 tappi compatibili con provette da 96 pozzetti da 2,0 mL e una striscia PCR da utilizzare con il modulo di temperatura OT-2. In questo manoscritto utilizziamo il supporto per provette da 2,0 ml.
Bicarbonato di ammonioSigma-Aldrich# A6141
Albumina sierica bovina standard, 2 mg/mLThermo Scientific#23210
Dimetilsolfossido (DMSO) grado LC-MSThermo Scientific#85190
DitiotreitoloSigma-Aldrich#D5545
EASY-Spray Colonne HPLCThermo Scientific#ES800A
EasynLC 1200 Nano LCThermo Scientific#LC140
Prova di etanolo 195-200Fisher#04-355-720
Acido formico grado LC-MS ThermoScientific#85178
Lisato di cuore umanoNovus BiologicalsNB820-59217
IodoacetamideSigma-Aldrich#I1149
Rackmagnetico per tubiThermo Scientific#MR02
MAXQuant v.1.6.10.43Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/)
mySPIN 6 Mini centrifugaThermo Scientific#75004061mini centrifuga da banco per una rotazione rapida
NEST 2 mL 96-Well Deep Well PlateOpentrons
GEN1
Pipetta monocanale OT-2 P300OpentronsGEN1
OT-2 P50 pipetta monocanaleOpentronsGEN1
Modulo di temperatura OT-2
Pierce Quantitative Colorimetric PeptideAssay Thermo Scientific#23275
Provette Protein LoBind 2.0 mLEppendorf#022431102
Database di sequenze proteicheUniProt/SwissProthttps://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640%
20recensito:sì
Particelle magnetiche modificate con carbossilato Sera-Mag SpeedBead, Particelle magnetiche modificate con carbossilato Sera-MagCytiva#65152105050250
Sera-Mag SpeedBead, IdrofiloCytiva#45152105050250
SpeedVacThermo ScientificEvaporatore sottovuoto
Thermo Q Spettrometro di massa HF esattivoThermo Scientific#IQLAAEGAAPFALGMBFZ
Tripsina MS GradeThermo Scientific#90057
Acqua LC-MS gradoVWR#BDH83645.400
di rack per provette modulo magnetico OT-2 con fondo V Opentrons OT-2 robot di pipettaggio Opentrons OT-2Opentrons GEN1

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Geyer, P. E., et al. Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics. Molecular Systems Biology. 13 (9), 942(2017).
  2. Coscia, F., et al. A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue anal....

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