Method Article

Elaborazione dei campioni di Shotgun Proteomics automatizzata da un robot da laboratorio open source

DOI:

10.3791/63092

⸱

October 28th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine-Cardiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Department of Biochemistry & Molecular Genetics, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 3Consortium for Fibrosis Research & Translation, School of Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protocollo dettagliato e tre script Python sono forniti per il funzionamento di un sistema di gestione dei liquidi robotico open source per eseguire la preparazione semi-automatizzata di campioni proteici per esperimenti di spettrometria di massa, che coprono la rimozione del detergente, la digestione delle proteine e le fasi di desalinizzazione dei peptidi.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli esperimenti di proteomica a fucile basati sulla spettrometria di massa richiedono più fasi di preparazione del campione, tra cui la digestione e la pulizia enzimatica delle proteine, che possono richiedere significative ore di lavoro al banco e presentare una fonte di variabilità da lotto a lotto. L'automazione di laboratorio con robot di pipettaggio può ridurre il lavoro manuale, massimizzare la produttività e aumentare la riproducibilità della ricerca. Tuttavia, i prezzi di partenza elevati delle stazioni di automazione standard le rendono inaccessibili per molti laboratori accademici. Questo articolo descrive un flusso di lavoro di preparazione dei campioni di proteomica utilizzando un conveniente sistema di automazione open source (The Opentrons OT-2), comprese le istruzioni per l'impostazione di passaggi semi-automatizzati di riduzione delle proteine, alchilazione, digestione e pulizia; così come gli script Python open source di accompagnamento per programmare il sistema OT-2 attraverso la sua interfaccia di programmazione delle applicazioni.

Introduction

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La proteomica del fucile a pompa basata sulla spettrometria di massa è un potente strumento per misurare l'abbondanza di molte proteine in campioni biologici contemporaneamente. Gli esperimenti di proteomica con l'analisi bioinformatica sono abitualmente impiegati per identificare i biomarcatori e scoprire complessi biologici associati e percorsi alla base dei meccanismi patologici. Con la sua elevata specificità analitica e la potenziale accuratezza quantitativa, la proteomica del fucile da caccia ha anche un eccellente potenziale per essere adottata da strutture di ricerca e laboratori diagnostici per l'analisi di campioni clinici senza la necessità di fare affidamento sugli anticorpi1,2.

Per preparare campioni proteici per l'analisi proteomica shotgun, le proteine estratte da campioni biologici (ad esempio, cellule e tessuti) in genere devono prima essere elaborate utilizzando protocolli lunghi, tra cui la misurazione della concentrazione proteica del campione, la riduzione delle proteine e l'alchilazione e la digestione enzimatica in peptidi. Inoltre, le proteine estratte in comuni tamponi di lisi contenenti detergenti spesso richiedono ulteriori fasi di scambio tampone o rimozione del detergente prima dell'analisi perché il detergente può interferire con la digestione della tripsina e degradare significativamente le prestazioni dell'analisi a valle della cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS)3. I peptidi sono in genere ulteriormente dissalati, essiccati e ricostituiti in solventi compatibili LC-MS/MS dopo la digestione enzimatica. Queste procedure di biochimica delle proteine possono essere laboriose e dispendiose in termini di tempo. Pertanto, continuano a limitare il throughput dei flussi di lavoro di proteomica e contribuiscono alla variabilità dei dati acquisiti4,5. Gli errori e i pregiudizi umani sono stati riconosciuti come fattori cruciali che influenzano la varianza e la riproducibilità dei dati6,7. Per ridurre al minimo gli errori umani nei flussi di lavoro di preparazione dei campioni di spettrometria di massa, sono stati utilizzati sistemi robotici di pipettaggio automatizzati per migliorare la produttività e la riproducibilità dell'identificazione e della quantificazione delle proteine dalla proteomica shotgun e dall'analisi mirata della spettrometria di massa, dove tali progressi sono stati salutati come strumentali per continuare la spinta verso l'adozione diffusa di tecnologie proteomiche nella ricerca critica e in contesti clinici8, 9,10,11,12,13. Tuttavia, la maggior parte dei protocolli esistenti utilizza piattaforme robotiche di gestione dei liquidi che richiedono investimenti e formazione sostanziali, limitando la loro utilità in molti laboratori in ambiente accademico o altrimenti con un budget limitato.

Questo articolo descrive un protocollo che utilizza un sistema di gestione dei liquidi robotico open source a basso costo, l'OT-2, per semi-automatizzare un tipico flusso di lavoro di preparazione dei campioni di proteomica del fucile. L'OT-2 ha un costo inferiore rispetto a molti altri sistemi robotici di gestione dei liquidi e, al momento della scrittura, costa circa $ 5.000 dollari USA. Quando si tiene conto dei prezzi di diversi moduli e labware, il costo totale per impostare esperimenti in questo protocollo al momento della scrittura è di circa $ 10.000, il che lo rende più conveniente per un insieme considerevolmente più ampio di laboratori rispetto a opzioni più costose. L'OT-2 è compatibile con la programmazione open source tramite script Python e offre grandi flessibilità nella progettazione di protocolli fai-da-te definiti dall'utente. Utilizzando tre script sviluppati internamente, i protocolli sottostanti coprono l'esecuzione di un tipico flusso di lavoro di preparazione del campione di proteomica shotgun sulla stazione OT-2 con uno standard proteico archetipico (albumina sierica bovina; BSA) e un campione proteico complesso di un normale lisato cardiaco umano (Figura 1). Le procedure per l'elaborazione (1) di un campione BSA e (2) di un campione complesso di lisato cardiaco sono dettagliate rispettivamente nelle sezioni 1, 2, 5, 6 e 3, 4, 5, 6 del protocollo. Le perle magnetiche modificate con carbossilato Di Sera-Mag sono utilizzate nella preparazione di campioni a fase solida (SP3) a vaso singolo per rimuovere detergenti e sali nei campioni di proteine e peptidi. I digest triptici dell'albumina sierica bovina e delle proteine cardiache umane vengono ulteriormente puliti dalle perline SP3 e sottoposti all'analisi LC-MS/MS. Gli spettri di massa vengono quindi analizzati utilizzando il software MaxQuant per l'identificazione di peptidi e proteine. I risultati rappresentativi da noi eseguiti mostrano che il protocollo raggiunge eccellenti coefficienti tecnici di variazione (CV) risparmiando tempo al banco ed è non inferiore alla digestione manuale.

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Protocol

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Gli script Python sviluppati sono stati depositati su GitHub all'indirizzo: https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons. Una copia degli script è fornita nel file supplementare 1. Fare riferimento al repository GitHub per le versioni più recenti.

1. Preparazioni sperimentali

  1. Controllare l'hardware richiesto prima di avviare il protocollo.
    NOTA: sono necessari i seguenti componenti hardware: pipette OT-2, punte per pipette, set di rack per tubi 4 in 1, set di blocchi di alluminio, modulo magnetico, modulo di temperatura, piastre per pozzi profondi 2 ml a 96 pozzetti (vedere Tabella dei materiali).

2. Preparazione del campione di spettrometria di massa (MS) con una singola proteina di albumina sierica bovina (BSA)

  1. Aprire lo script NoSP3_digestion.py in un editor di testo e specificare le variabili specifiche dell'esperimento in base alle esigenze nella sezione PERSONALIZZA SOLO QUI.
    NOTA: le variabili specifiche dell'esperimento includono il numero di campioni e la replica; la concentrazione del campione; il volume dei reagenti ditiotreitolo - DTT, iodoacetammide - IAA e tripsina; il tempo di incubazione DTT e IAA e la punta di partenza per le pipette P20/P50 e P300).
    1. Apri l'app Opentrons e carica lo script nella scheda PROTOCOLLO nell'app Opentrons.
      NOTA: l'app Opentrons può essere scaricata da Reference14 su un computer locale. Al momento della scrittura, la pipetta elettronica Opentrons P50 non è disponibile per l'acquisto nel negozio Opentrons. È stato sostituito con la pipetta elettronica monocanale P20 compatibile con i volumi specificati nel protocollo. Note e istruzioni sono state fatte nello script per sostituire la pipetta P50 con la pipetta P20. Gli utenti potrebbero dover testare e verificare la compatibilità della pipetta con questo protocollo seguendo le istruzioni dell'API Opentrons.
  2. Apri la scheda ROBOT ed esegui la calibrazione del deck del robot Calibrate Deck nella scheda ROBOT seguendo le istruzioni dettagliate sullo schermo nell'app Opentrons.
    NOTA: questo passaggio è necessario solo se non è stato implementato in precedenza o se il robot è stato traslocato di recente.
  3. Fare clic sul pulsante GESTISCI PIPETTE per eseguire la calibrazione della lunghezza della punta, seguita dalla calibrazione dell'offset della pipetta per calibrare la posizione predefinita della combinazione di punta e pipetta.
    NOTA: questo passaggio è necessario se si utilizza una pipetta per la prima volta.
  4. Posizionare il labware e le pipette necessari nella posizione corrispondente nel deck OT-2 specificato nello script Python (Figura 2).
    NOTA: assicurarsi che il modulo di temperatura sia collegato e acceso e che il blocco di alluminio sia posizionato sopra il modulo di temperatura.
  5. Aprire la scheda CALIBRATE ed eseguire la calibrazione per la combinazione di labware e pipette richiesta in questo script python.
    NOTA: l'app Opentrons registrerà i parametri di calibrazione, che non sono necessari per le applicazioni future con lo stesso labware e pipette.
  6. Preparare 5 mL di soluzione di bicarbonato di ammonio (ABC) da 100 mM (pH ~8,0) sciogliendo 39,53 mg di ABC in acqua di grado spettrometrico di massa per un volume totale di 5 mL in un tubo conico da 15 mL. Posizionare il tampone in bicarbonato di ammonio nel pozzetto A1 del portatubi 4 in 1 con il supporto per tubi da 15 ml + 50 ml.
  7. Preparare 1 mL di proteina dell'albumina sierica bovina (BSA) in un tubo a basso legame proteico da 2,0 ml (vedere Tabella dei materiali). Posizionare il campione nel pozzetto A1 del rack per tubi 4 in 1 con supporto per tubi da 2 ml.
  8. Posizionare manualmente tubi a basso legame proteico da 2,0 ml nei pozzetti di A1, B1, C1, D1, E1, F1, A2, ecc. nel blocco di alluminio sulla parte superiore del modulo di temperatura.
    NOTA: la pipetta robotizzata erogherà campioni in ordine verticale a partire da A1 (primo campione) fino all'ultimo campione per impostazione predefinita. È possibile specificare l'erogazione orizzontale. Fare riferimento a15 per i dettagli. Il numero totale di provette che devono essere preparate dovrebbe essere uguale al numero totale di campioni (cioè il numero di campioni biologici moltiplicato per il numero di repliche tecniche per campione).
  9. Preparare 1 mL di DTT da 60 mM sciogliendo 9,26 mg di solidi DTT in acqua di grado spettrometrico di massa per un volume totale di 1 mL. Posizionare il DTT nel pozzetto A6 del portatubi 4 in 1 con la parte superiore portatubi da 2 ml.
    ATTENZIONE: la DTT è dannosa per gli occhi umani, la pelle e il sistema respiratorio. Indossare DPI e maneggiarli sotto un cappuccio chimico. Fare riferimento alla scheda di dati di sicurezza del produttore per le procedure appropriate.
  10. Osservare mentre il robot trasferisce un volume appropriato di buffer ABC alle provette campione nel blocco di alluminio.
    NOTA: il volume totale di ABC e mix proteico in ciascun tubo è di 100 μL e il volume del tampone ABC è calcolato nello script (V = 100 μL meno il volume di 100 μg di campione proteico).
  11. Assicurarsi che il robot trasferisca 100 μg di proteina BSA a ciascun tubo con tampone ABC.
    NOTA: Un esperimento tipico può utilizzare fino a 100 μg di proteine per la digestione delle proteine, cioè 50 μL di 2,0 μg/μL per questo campione BSA.
  12. Verificare manualmente che il programma robot sia in pausa e visualizzi il messaggio: assicurarsi che il DTT sia stato caricato in A6 del rack per tubi da 2 ml situato nello slot 4 prima di riprendere il protocollo. Assicurarsi che un tubo DTT sia posizionato nel pozzetto A6 e aprire il cappuccio. Fai clic sul pulsante Riprendi nell'app Opentrons per continuare. Assicurarsi che il robot trasferisca 10 μL di soluzione DTT a ciascun pozzo campione, seguito da cinque cicli di miscelazione.
  13. Verificare che il programma robot sia in pausa e visualizzi il messaggio: Assicurarsi di chiudere i tappi sulle provette campione. Chiudere manualmente i tappi dei tubi e fare clic su Riprendi per continuare. Attendere che il modulo di temperatura del robot inizi a riscaldare il blocco di alluminio fino a quando la temperatura raggiunge i 55 °C, seguita da un'incubazione di 5 minuti per consentire ai campioni di arrivare a 55 °C.
    NOTA: Il robot manterrà la temperatura a 55 °C per 30 minuti per consentire la riduzione delle proteine da parte della DTT durante l'incubazione.
  14. Durante i 30 minuti di incubazione DTT, preparare 1 mL di 187,5 mM di Iodoacetamide (IAA) sciogliendo 34,68 mg di IAA nel tampone ABC per un volume totale di 1 mL. Avvolgere manualmente la soluzione IAA con un foglio di alluminio per evitare l'esposizione alla luce.
    ATTENZIONE: IAA può causare gravi irritazioni oculari e respiratorie. Maneggialo sotto un cappuccio chimico indossando DPI adeguati.
  15. Assicurarsi che il modulo di temperatura del robot si raffreddi al termine della fase di incubazione DTT di 30 minuti.
    NOTA: Dopo che la temperatura del modulo raggiunge i 22 °C, il modulo mantiene la temperatura per 5 minuti per consentire ai campioni di raffreddarsi completamente.
  16. Aprire le provette quando il programma del robot è in pausa e visualizzare il messaggio di avviso: Assicurarsi di aprire i tappi sulle provette campione. Clicca su Riprendi per continuare.
  17. Verificare manualmente che il programma del robot sia messo in pausa con un messaggio di avviso: assicurarsi che l'IAA sia stato caricato nel B6 del rack tubolare da 2 ml situato nello slot 4 prima di riprendere il protocollo. Confermare la posizione del rack del tubo IAA e aprire il tappo del tubo. Clicca su Riprendi per continuare. Assicurarsi che il robot trasferisca 10 μL di IAA a ciascuna provetta del campione seguita da cinque cicli di miscelazione.
  18. Tappare le provette quando il programma del robot è in pausa e visualizzare il messaggio: chiudere i tappi sulle provette del campione e coprire le provette con un foglio. Coprire l'intero blocco di alluminio con un foglio pulito. Clicca su Riprendi per continuare. Attendere che i campioni siano incubati a 22 °C per 30 minuti. Assicurarsi che il modulo di temperatura del robot si disattivi al termine dell'incubazione IAA.
  19. Preparare una miscela di soluzione di tripsina durante l'incubazione IAA (fase 2.19) alla concentrazione finale di 0,2 μg/μL: sciogliere 20 μg di spettrometria di massa/tripsina di grado sequenziale in 100 μL di acqua di grado MS.
  20. Posizionare la soluzione di tripsina nel pozzetto C6 del rack tubolare da 2 ml con il tappo del tubo aperto quando il programma del robot è in pausa e visualizza il messaggio di avviso: Assicurarsi che la tripsina sia stata caricata in C6 del rack tubolare da 2 ml situato nello slot 4 prima di riprendere il protocollo. Clicca su Riprendi per continuare.
  21. Verificare che il programma del robot sia in pausa e visualizzi il messaggio di avviso: Apri i tappi sulle provette del campione sul modulo di temperatura. Decap le provette campione e fai clic su Riprendi per continuare. Stare a guardare mentre il robot trasferisce 10 μL di tripsina a ciascuna provetta del campione seguita da cinque cicli di miscelazione.
  22. Avvolgere i tappi della provetta del campione con pellicola di paraffina, trasferire tutti i campioni in un miscelatore a temperatura controllata e incubare a 37 °C per 16-20 ore con scuotimento a 600 giri/min.
    NOTA: La digestione della tripsina può essere eseguita anche direttamente sul modulo di temperatura a 37 °C.

3. Pulizia dei peptidi utilizzando perline paramagnetiche SP3

  1. Il giorno successivo, dopo la digestione notturna della tripsina, ruotare brevemente i campioni utilizzando una microcentrifuga da banco (≤2.000 x g) (vedi Tabella dei materiali) e posizionare i campioni su un rack magnetico. Lasciare riposare i campioni per 2 minuti.
    1. Trasferire il surnatante con attenzione con una pipetta in un nuovo set di tubi microcentrifuga proteici a basso legame. Conservare i campioni in frigorifero e procedere ai passaggi 3.2-3.9.
      NOTA: per la conservazione a lungo termine, conservare i campioni a -80 °C.
  2. Aprire lo script Python SP3_peptide_cleanup.py in un editor di testo e specificare se necessario nella sezione PERSONALIZZA SOLO QUI.
    NOTA: Le variabili specifiche dell'esperimento includono il numero di campioni e repliche, il volume di peptidi da trasferire, il volume di reagenti (perline, acetonitrile, DMSO), la punta di partenza per le pipette P20/P50 e P300 e l'inizio bene nella piastra del pozzo profondo sul modulo magnetico. Ogni campione di digest BSA contiene circa 120 μL di volume di digestione, che sarà aliquotato in due repliche tecniche con 55 μL in ogni replica. Per pulire solo metà del digest, modificare la variabile del numero di replica su 1.
  3. Carica lo script nella scheda PROTOCOLLO nell'app Opentrons .
  4. Posizionare il labware e le pipette necessari nella posizione corrispondente nel deck OT-2 specificato nello script Python (Figura 3). Assicurarsi che il modulo magnetico sia acceso e collegato al robot. Posizionare una nuova piastra profonda 2 mL a 96 pozzetti (vedere Tabella dei materiali) sulla parte superiore del modulo magnetico.
  5. Aprire la scheda CALIBRATE ed eseguire la calibrazione per la combinazione di labware e pipette richiesta in questo script Python.
    NOTA: la calibrazione per le stesse combinazioni di labware e pipette deve essere eseguita una sola volta e l'app Opentrons registrerà i parametri di calibrazione.
  6. Posizionare i campioni digeriti (surnatante raccolto al punto 3.1) sul rack tubolare da 2,0 ml nell'ordine verticale nei pozzetti A1, B1....
  7. Preparare 15 mL di acetonitrile compatibile con LC-MS/MS in un tubo conico da 50 mL e posizionare il tubo nel pozzetto A3 nel rack per tubi 4 in 1 con la parte superiore del portatubi da 15 mL + 50 mL.
  8. Preparare 5 mL di DMSO al 2% aggiungendo 100 μL dmSO con 4,9 mL di acqua di grado spettrometrico di massa in un tubo conico da 15 mL. Posizionare il tubo nel pozzo A1 nel rack tubo da 15 ml + 50 ml.
  9. Etichettare un tubo conico vuoto da 50 mL come Rifiuto e posizionarlo nel pozzo B3 nel rack tubolare da 15 ml + 50 ml.
  10. Preparare le perline SP3 seguendo Reference16.
    1. Preparare una quantità appropriata di perline miste in un tubo microcentrifuga da 2,0 ml.
      NOTA: Ogni reazione di pulizia peptidica richiede 10 μL di perline miste. Ad esempio, preparare un minimo di 40 μL di perline miste per quattro reazioni di pulizia.
    2. Lasciare riposare la miscela di perline sul supporto magnetico per 2 minuti. Rimuovere accuratamente il surnatante con una pipetta e misurare il volume del surnatante con una pipetta.
    3. Calcola il volume rimanente di perline e aggiungi 5-10 volte l'acqua di grado spettrometrico di massa (ad esempio, 100-200 μL di acqua per 20 μL di perline) e vortice (velocità 10) per 10 s. Siediti le perline sul supporto magnetico per 2 minuti.
    4. Ripetere i passaggi di lavaggio con acqua per un totale di tre lavaggi.
    5. Sospendere le perline finali in acqua di grado MS a una concentrazione finale di 50 μg/μL. Posizionare le perle magnetiche lavate nel pozzetto A6 nel portatubi da 2,0 mL.
      NOTA: si consiglia di risospendare le perline ad una concentrazione di 10 μg/μL16. Nell'attuale sforzo di ottimizzazione, la concentrazione finale è stata modificata a 50 μg/μL per ridurre al minimo il volume totale della miscela perline-peptide-acetonitrile.
  11. Assicurarsi che il robot trasferisca 55 μL dei campioni digeriti ai pozzetti nelle piastre dei pozzi profondi sul modulo magnetico.
  12. Verificare che il protocollo del robot sia in pausa e visualizzi il messaggio: assicurarsi che le perline preparate siano state caricate in A6 del rack per tubi da 2 ml situato nello slot 4 prima di riprendere il protocollo. Ruotare le perline, quindi ruotare brevemente verso il basso per 5 s su una mini centrifuga da banco e posizionare le perline nel pozzetto A6 del rack tubolare da 2 ml con il tappo aperto. Resta a guardare mentre il robot mescola le perline 10 volte per cinque colpi pipettando su e giù.
    NOTA: il robot trasferisce 10 μL di perline a ciascun campione digerito nelle piastre del pozzo profondo seguite da cinque volte di miscelazione.
  13. Assicurarsi che il robot trasferisca 1.292 μL di acetonitrile a ciascun pozzetto e si mescoli immediatamente 10 volte pipettando su e giù per facilitare il legame di peptidi e perline.
    NOTA: ogni trasferimento viene completato su più giri perché la pipetta P300 può trasferire solo fino a 300 μL alla volta.
  14. Assicurarsi che il robot mescoli tutti i campioni cinque volte pipettando su e giù nella piastra del pozzo profondo.
  15. Attendere che il modulo magnetico sia inserito e che i campioni vengano incubati sul modulo per 2 minuti.
  16. Stare in attesa mentre le velocità di aspirazione e erogazione del pipettaggio sono impostate per rallentare a 25 μL/s dal valore predefinito di 150 μL/s.
    NOTA: Il robot rimuove lentamente il surnatante da ciascun pozzo e lo scarta nel tubo di scarico mentre il modulo magnetico è inserito.
  17. Attendere che l'aspirazione del pipettaggio e le velocità di erogazione tornino all'impostazione predefinita. Osservare che il modulo magnetico si disinnesta.
  18. Verifica che il programma del robot sia in pausa e visualizzi il messaggio: assicurati che il tappo del tubo ACN sia spento. Scomporre manualmente il tubo di acetonitrile e riposizionarlo nel rack del tubo. Clicca su Riprendi per continuare. Assicurarsi che il robot trasferisca 1 mL di acetonitrile per lavare ogni campione e mescoli immediatamente 10 volte.
  19. Assicurarsi che il robot mescoli tutti i campioni 10 volte per lavare i campioni.
  20. Stare in attesa mentre il modulo magnetico è inserito e incuba i campioni per 2 minuti.
  21. Attendere che il robot cambi la velocità di aspirazione del pipettaggio per rallentare e rimuove lentamente il surnatante e lo eroga nel tubo di scarico.
  22. Osservare mentre il robot incuba i campioni sul modulo magnetico per 60 s per consentire all'acetonitrile residuo di evaporare, quindi cambia le velocità di aspirazione del pipettaggio di nuovo al default. Osservare che il modulo magnetico si disimpegna.
  23. Verificare che il programma del robot sia in pausa e visualizzi nuovamente il messaggio: Vortex DMSO e tappi aperti. Ruotare manualmente il DMSO al 2% per 10 s e riposizionarlo nel pozzetto A1 nel rack tubolare da 15 mL-50 mL. Clicca su Riprendi per continuare.
  24. Assicurarsi che il robot trasferisca 80 μL di DMSO al 2% in ciascun pozzetto e si mescoli immediatamente 10 volte.
  25. Assicurarsi che il robot mescoli tutti i campioni 10 volte per altri cinque round.
  26. Stare in attesa mentre il modulo magnetico è inserito e incuba i campioni per 2 minuti.
  27. Osservare mentre il robot cambia la velocità di aspirazione della pipetta in lento (25 μL/s) e trasferisce lentamente il surnatante in pozzi vuoti nella piastra del pozzo profondo.
  28. Attendere che il robot incuba i campioni sul modulo magnetico per 2 minuti per rimuovere le perline residue nei campioni.
  29. Verificare che il programma del robot sia in pausa e visualizzi il messaggio: Posizionare nuovi tubi da 2 ml nel rack del tubo da 2 ml e assicurarsi che il numero di tubi corrisponda al numero totale di campioni.
  30. Posizionare il primo tubo di microcentrifuga da 2 ml nel pozzetto direttamente dopo il campione finale di digest BSA. Clicca su Riprendi per continuare.
    NOTA: ad esempio, i sei campioni di digest BSA testati in questo protocollo si trovano nei pozzetti A1, B1, C1, D1, A2 e B2. Pertanto, il nuovo set di tubi da 2,0 ml è collocato nei pozzi B3, C3, D3, ... E così via.
  31. Osservare mentre il robot trasferisce 88 μL di campioni dai pozzetti nella piastra del pozzo profondo al nuovo set di tubi da 2,0 ml.
    NOTA: il volume trasferito (1,1 x 80 μL) nel protocollo è ottimizzato per garantire che l'intero volume del campione sia aspirato nelle punte delle pipette.
  32. Stare in attesa mentre il robot cambia la velocità di aspirazione della pipetta in default e disinnesta il modulo magnetico.
  33. Asciugare manualmente i peptidi puliti in un evaporatore sotto vuoto (vedere Tabella dei materiali) e procedere al paragrafo 5 o conservare i campioni essiccati a -20 °C.

4. Preparazione del campione di SM con lisato proteico del cuore umano (5 mg/mL) con perline paramagnetiche SP3

  1. Aprire lo script Python SP3_digestion.py e specificare i valori delle variabili nella sezione CUSTOMIZE HERE ONLY.
    NOTA: Le variabili includono il numero di campioni e replica, la concentrazione del campione, il volume dei reagenti (DTT, IAA, tripsina, perline, etanolo al 100% e all'80%), il tempo di incubazione DTT e IAA, la punta iniziale per le pipette P20 / P50 e P300 e l'inizio bene nella piastra del pozzo profondo sul modulo magnetico.
  2. Seguire i passaggi 2.2-2.23 del paragrafo 2 per la preparazione del campione di SM con una singola proteina di albumina sierica bovina per l'incubazione DTT e IAA. Fare riferimento alla Figura 1 per la configurazione del deck del robot in questi passaggi.
  3. Preparare una miscela di perline SP3 fresche (20 μL di perle per reazione di pulizia) per la pulizia delle proteine (come specificato nella fase 3.10) durante le fasi di incubazione DTT e IAA (fasi 2.15 e 2.19). Posizionare le perline nel pozzetto D6 sul portatubi da 2 ml.
  4. Verificare che il programma del robot sia in pausa con il messaggio: Apri tappi tubolari. Scomporre manualmente le provette campione nel blocco di alluminio sulla parte superiore del modulo di temperatura e fare clic su Riprendi per continuare.
  5. Assicurarsi che il robot trasferisca tutti i campioni da tubi da 2,0 ml a una nuova piastra a pozzo profondo sulla parte superiore del modulo magnetico.
  6. Verificare che il programma del robot sia in pausa e visualizzi il messaggio: assicurarsi che le perline preparate siano state caricate nel D6 del rack tubolare da 2 ml situato nello slot 4 prima di riprendere il protocollo. Apri il tappo del tubo delle perline e fai clic su Riprendi per continuare.
  7. Osservare mentre il robot trasferisce 20 μL di perline a ciascun pozzetto nella piastra del pozzo profondo con cinque cicli di miscelazione delle perline e cinque cicli di miscelazione della miscela campione-perline.
  8. Verificare che il programma del robot sia in pausa e visualizzi il messaggio: assicurarsi che l'etanolo al 100% sia stato caricato in A3 del rack tubolare da 15 ml-50 ml situato nello slot 5 prima di riprendere il protocollo. Preparare 10-20 ml di etanolo al 100% (cioè etanolo a prova di 200, vedere Tabella dei materiali) in un tubo conico da 50 ml e posizionarlo nel pozzetto A3 del rack. Clicca su Riprendi per continuare.
  9. Stare a guardare mentre il robot trasferisce 140 μL di etanolo al 100% a ciascun pozzetto nella piastra immediatamente seguito da 10 cicli di miscelazione per facilitare il legame dei peptidi alle perline.
  10. Assicurarsi che il robot mescoli ogni campione tubando su e giù 10 volte ogni round per un totale di cinque cicli di miscelazione.
  11. Stare in attesa mentre il modulo magnetico è inserito e incuba i campioni sul modulo per 2 minuti.
  12. Osservare mentre il robot cambia la velocità di pipettaggio in lento (25 μL/s) e aspira il surnatante da ciascun pozzo e lo eroga nel tubo di scarico.
  13. Attendere che il robot riporti la velocità di pipettaggio ai valori predefiniti e disinnesti il modulo magnetico.
  14. Verificare che il programma del robot sia in pausa e visualizzi il messaggio: assicurarsi che l'80% di etanolo sia stato caricato in A4 del rack tubolare da 15 ml-50 ml situato nello slot 5 prima di riprendere il protocollo. Preparare manualmente 20 mL di etanolo all'80% mescolando 4 mL di acqua di grado MS con 16 mL di etanolo al 100% (cioè 200 proof). Posizionare l'etanolo all'80% nel pozzetto A4 nel rack del tubo. Clicca su Riprendi per continuare. Assicurarsi che il robot trasferisca 1 ml di etanolo all'80% in ciascun pozzo e si mescoli immediatamente 10 volte.
  15. Osservare mentre il robot cambia la velocità di pipettaggio in lento (25 μL/s), aspira il surnatante da ciascun pozzo ed eroga nel tubo di scarico. Attendere che il robot riporti la velocità di pipettaggio ai valori predefiniti e disinnesti il modulo magnetico.
  16. Aprire il tappo della soluzione ABC quando il programma del robot è in pausa e viene visualizzato il messaggio: Apri il tappo sul tubo ABC. Clicca su Riprendi per continuare. Stare in attesa mentre il robot disinnesta il modulo magnetico, trasferisce 250 μL di ABC a ciascun pozzo e si mescola immediatamente per 10 volte.
    NOTA: questo passaggio consiste nel lavare i campioni con ABC.
  17. Assicurarsi che il robot innesti il modulo magnetico e incuba i campioni sul modulo per 2 minuti.
  18. Osservare mentre il robot cambia la velocità di pipettaggio in lento (25 μL/s) e trasferisce il surnatante da ciascun pozzo al tubo di scarico. Attendere che il robot trasferisca 100 μL di buffer ABC a ciascun pozzetto e si mescoli immediatamente per 10 volte.
  19. Verificare che il programma del robot sia in pausa e visualizzi il messaggio: assicurarsi che i nuovi tubi di raccolta siano stati collocati in un blocco di alluminio da 2,0 ml prima di riprendere il protocollo. Posizionare un nuovo set di tubi microcentrifuga a bassa ritenzione proteica nel blocco di alluminio immediatamente dopo l'ultima provetta campione inizialmente nel blocco. Clicca su Riprendi per continuare. Stare in attesa mentre il robot trasferisce ogni campione nel buffer ABC ai nuovi tubi da 2,0 ml.
    NOTA: Esaminare i pozzetti e trasferire manualmente qualsiasi campione residuo alle provette, se necessario.
  20. Preparare una quantità appropriata di tripsina di grado MS (10 μL per campione) sciogliendo 20 μg di tripsina di grado MS in acqua di grado MS a una concentrazione finale di 0,2 μg/μL quando il programma del robot è in pausa e visualizza il messaggio: Assicurarsi che la tripsina (0,2 μg/μL) sia stata caricata in C6 del rack tubolare da 2 mL situato nello slot 4 prima di riprendere il protocollo. Assicurarsi che il robot trasferisca 10 μL di tripsina a ciascuna provetta campione, seguita da cinque cicli di miscelazione.
  21. Avvolgere i tappi della provetta con pellicola di paraffina, trasferire tutti i campioni in un miscelatore a temperatura controllata e incubare a 37 °C per 16-20 ore con scuotimento a 1.000 giri/min.
    NOTA: Si consiglia di eseguire la digestione con scuotimento a 1.000 giri / min per ridurre al minimo le precipitazioni delle perline durante l'incubazione notturna.

5. Pulizia dei peptidi con perline paramagnetiche SP3

  1. Seguire le istruzioni graduali nel passaggio 2, Pulizia dei peptidi utilizzando perline paramagnetiche SP3.

6. Cromatografia liquida e spettrometria di massa

  1. Sospendere i peptidi BSA (fasi 2-3) e lisato cardiaco (fase 4) in acido formico allo 0,1% aggiungendo 1 mL di acido formico di grado LC-MS al 99% in acqua MS per un volume totale di 1 L.
    ATTENZIONE: L'acido formico è un acido forte. È altamente corrosivo per gli occhi, la pelle e il sistema respiratorio. Maneggiare con cura sotto un cappuccio chimico indossando DPI.
  2. Quantificare la concentrazione peptidica post-digest utilizzando un kit di analisi peptidica quantitativa17 e iniettare 0,5 μg di digest BSA e 1,5 μg di digest cardiaco per l'analisi LC-MS/MS.
  3. Impostare il programma di cromatografia liquida per l'analisi LC-MS/MS.
    NOTA: In una configurazione tipica, i digest peptidici possono essere caricati su una colonna C18 a fase inversa (particella da 3 μm; poro 100 Å; 75 μm x 150 mm; vedere Tabella dei materiali) utilizzando i parametri forniti nel file supplementare 2.
  4. Acquisire i dati di proteomica del fucile utilizzando uno spettrometro di massa (vedere Tabella dei materiali) utilizzando i parametri forniti nel file supplementare 3.
  5. Cerca nel database delle proteine per l'identificazione delle proteine.
    1. Scarica e installa il software richiesto, MaxQuant.
      NOTA: il software MaxQuant (v.1.6.10.43) è stato utilizzato qui per i seguenti passaggi (vedere Tabella dei materiali).
    2. Scaricate il database curato del proteoma umano da un database di sequenze proteiche di alta qualità (UniProt/SwissProt) (vedi Tabella dei materiali). Fare clic sul pulsante Download e scegliere FASTA (canonico).
      NOTA: Facoltativamente, scaricare FASTA (non canonico) per includere le isoforme proteiche di ciascun gene nel database, se lo si desidera.
    3. Nell'interfaccia software MaxQuant, specificare il file FASTA da utilizzare come database di proteine accedendo al pannello Parametri globali e facendo clic sulla scheda Sequenze ; quindi, fare clic sul pulsante Aggiungi per specificare il percorso del file FASTA.
    4. Nell'interfaccia software MaxQuant, specificare i file dello spettro di massa grezza acquisiti da analizzare accedendo al pannello Dati grezzi e facendo clic sul pulsante Carica e selezionando i file raw.
    5. Impostare i parametri di ricerca come illustrato nella Tabella 1. Abilitare la quantificazione senza etichette (LFQ) se necessario.
    6. Attendere il completamento della ricerca e individuare il numero di corrispondenze dello spettro peptidico (PSM) che superano le soglie FDR dell'1% nel file msms.txt nella cartella /combined/txt.
      NOTA: Nei confronti eseguiti qui per la sezione dei risultati rappresentativi, i PSM mappati su più proteine sono stati filtrati e i PSM mappati su una proteina unica sono stati mantenuti per contare il numero di PSM, peptidi e proteine (Figura 4 e Figura 5).

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui vengono forniti tre script Python compatibili con il robot OT-2 e che eseguono la preparazione del campione per la proteomica della spettrometria di massa con una singola proteina standard di albumina sierica bovina (replica tecnicamente n = 5 digestioni) e un campione di lisato cardiaco umano contenente detergente (n = 5 digestioni). Ogni prodotto digestivo è suddiviso in due reazioni di pulizia peptidica. Il numero di corrispondenze peptidiche-spettro (PSM), peptidi e proteine identificati in ogni serie di campioni...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Passaggi critici all'interno del protocollo
Per ottenere le migliori prestazioni, è necessario utilizzare labware, moduli e materiali di consumo compatibili con OT-2 verificati da Opentrons. Il labware personalizzato può essere creato seguendo le istruzioni di Opentrons su Reference14. Assicurarsi di calibrare il deck OT-2, le pipette e il labware quando vengono utilizzati per la prima volta. È anche fondamentale seguire le linee guida del produttore di perline SP3 per preparar...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno conflitti da dichiarare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato supportato in parte dai premi NIH F32-HL149191 a YH; R00-HL144829 a EL; R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278 a MPL. La Figura 1, la Figura 2, la Figura 3 vengono create con l'ausilio di uno strumento di illustrazione scientifica basato sul Web, BioRender.com.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
300 µ SetOpentrons Opentrons
4 in 1OpentronsOgni set include 2 supporti di base e 4 parti superiori del supporto per provette da 1,5 ml, 2 ml, 15 ml + 50 ml, 15 ml e 50 ml. In questo studio utilizziamo 2 ml e 15 ml + 50 ml di top.
Colonna HPLC Acclaim PepMap 100 C18Thermo Scientific#1645683 μ particella m; 100 & Aring; poro; 75 μ m x 150 mm
Acetonitrile LC-MS gradoVWR#JT9829
Set di blocchi in alluminioOpentronsQuesto set di blocchi include 3 tappi compatibili con provette da 96 pozzetti da 2,0 mL e una striscia PCR da utilizzare con il modulo di temperatura OT-2. In questo manoscritto utilizziamo il supporto per provette da 2,0 ml.
Bicarbonato di ammonioSigma-Aldrich# A6141
Albumina sierica bovina standard, 2 mg/mLThermo Scientific#23210
Dimetilsolfossido (DMSO) grado LC-MSThermo Scientific#85190
DitiotreitoloSigma-Aldrich#D5545
EASY-Spray Colonne HPLCThermo Scientific#ES800A
EasynLC 1200 Nano LCThermo Scientific#LC140
Prova di etanolo 195-200Fisher#04-355-720
Acido formico grado LC-MS ThermoScientific#85178
Lisato di cuore umanoNovus BiologicalsNB820-59217
IodoacetamideSigma-Aldrich#I1149
Rackmagnetico per tubiThermo Scientific#MR02
MAXQuant v.1.6.10.43Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/)
mySPIN 6 Mini centrifugaThermo Scientific#75004061mini centrifuga da banco per una rotazione rapida
NEST 2 mL 96-Well Deep Well PlateOpentrons
GEN1
Pipetta monocanale OT-2 P300OpentronsGEN1
OT-2 P50 pipetta monocanaleOpentronsGEN1
Modulo di temperatura OT-2
Pierce Quantitative Colorimetric PeptideAssay Thermo Scientific#23275
Provette Protein LoBind 2.0 mLEppendorf#022431102
Database di sequenze proteicheUniProt/SwissProthttps://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640%
20recensito:sì
Particelle magnetiche modificate con carbossilato Sera-Mag SpeedBead, Particelle magnetiche modificate con carbossilato Sera-MagCytiva#65152105050250
Sera-Mag SpeedBead, IdrofiloCytiva#45152105050250
SpeedVacThermo ScientificEvaporatore sottovuoto
Thermo Q Spettrometro di massa HF esattivoThermo Scientific#IQLAAEGAAPFALGMBFZ
Tripsina MS GradeThermo Scientific#90057
Acqua LC-MS gradoVWR#BDH83645.400
di rack per provette modulo magnetico OT-2 con fondo V Opentrons OT-2 robot di pipettaggio Opentrons OT-2Opentrons GEN1

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Geyer, P. E., et al. Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics. Molecular Systems Biology. 13 (9), 942(2017).
  2. Coscia, F., et al. A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue analysis. The Journal of Pathology. 251 (1), 100-112 (2020).
  3. Yeung, Y. -G., Neives, E., Angeletti, R., Stanley, E. R., et al. Removal of detergents from protein digests for mass spectrometry analysis. Analytical Biochemistry. 382 (2), 135-137 (2008).
  4. Addona, T. A., et al. Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma. Nature Biotechnology. 27 (7), 633-641 (2009).
  5. Lowenthal, M. S., Liang, Y., Phinney, K. W., Stein, S. E. Quantitative bottom-up proteomics depends on digestion conditions. Analytical Chemistry. 86 (1), 551-558 (2014).
  6. Elliott, K. C., Resnik, D. B. Scientific reproducibility, human error, and public policy. Bioscience. 65 (1), 5-6 (2015).
  7. Brown, A. W., Kaiser, K. A., Allison, D. B. Issues with data and analyses: Errors, underlying themes, and potential solutions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (11), 2563-2570 (2018).
  8. van den Broek, I., et al. Automated multiplex LC-MS/MS assay for quantifying serum apolipoproteins A-I, B, C-I, C-II, C-III, and E with qualitative apolipoprotein E phenotypic. Clinical Chemistry. 62 (1), 188-197 (2016).
  9. Müller, T., et al. Automated sample preparation with SP3 for low-input clinical proteomics. Molecular Systems Biology. 16 (1), 9111(2020).
  10. Fu, Q., et al. Highly reproducible automated proteomics sample preparation workflow for quantitative mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).
  11. Liu, X., Gygi, S. P., Paulo, J. A. A semiautomated paramagnetic bead-based platform for isobaric tag sample preparation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (6), 1519-1529 (2021).
  12. Poulsen, K. M., Pho, T., Champion, J. A., Payne, C. K. Automation and low-cost proteomics for characterization of the protein corona: experimental methods for big data. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 6543-6551 (2020).
  13. Liang, Y., et al. Fully automated sample processing and analysis workflow for low-input proteome profiling. Analytical Chemistry. 93 (3), 1658-1666 (2021).
  14. Web URL. , Available from: https://opentrons.com/ot-app/ (2021).
  15. Web URL. , Available from: https://docs.opentrons.com/v2/ (2021).
  16. Web URL. , Available from: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry (2021).
  17. Web URL. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275 (2021).
  18. Han, Y., Wright, J. M., Lau, E., Lam, M. P. Y. Determining alternative protein isoform expression using RNA sequencing and mass spectrometry. STAR Protocols. 1 (3), 100138(2020).

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