La fabbricazione e il funzionamento di un sistema di micro-elettroporazione a flusso continuo con rilevamento di permeabilizzazione

Sommario

Questo protocollo descrive le tecniche di microfabbricazione necessarie per costruire un dispositivo di elettroporazione microfluidica lab-on-a-chip. La configurazione sperimentale esegue trasfezioni controllate a livello di singola cellula in un flusso continuo e può essere estesa a portate più elevate con controllo basato sulla popolazione. Viene fornita un'analisi che mostra la capacità di monitorare elettricamente il grado di permeabilizzazione della membrana cellulare in tempo reale.

Abstract

Le attuali innovazioni terapeutiche, come la terapia cellulare CAR-T, dipendono fortemente dalla somministrazione genica mediata da virus. Sebbene efficiente, questa tecnica è accompagnata da elevati costi di produzione, che hanno suscitato un interesse nell'utilizzo di metodi alternativi per la consegna genica. L'elettroporazione è un approccio elettrofisico non virale per la consegna intracellulare di geni e altri materiali esogeni. Dopo l'applicazione di un campo elettrico, la membrana cellulare consente temporaneamente la consegna molecolare nella cellula. Tipicamente, l'elettroporazione viene eseguita su macroscala per elaborare un gran numero di cellule. Tuttavia, questo approccio richiede un ampio sviluppo di protocolli empirici, che è costoso quando si lavora con tipi di cellule primarie e difficili da trasfettare. Il lungo sviluppo del protocollo, insieme alla necessità di grandi tensioni per ottenere sufficienti intensità di campo elettrico per permeabilizzare le celle, ha portato allo sviluppo di dispositivi di elettroporazione su microscala. Questi dispositivi di micro-elettroporazione sono fabbricati utilizzando tecniche di microfabbricazione comuni e consentono un maggiore controllo sperimentale con il potenziale di mantenere elevate capacità di produttività. Questo lavoro si basa su una tecnologia di elettroporazione microfluidica in grado di rilevare il livello di permeabilizzazione della membrana cellulare a livello di singola cellula in un flusso continuo. Tuttavia, questa tecnologia è stata limitata a 4 celle elaborate al secondo, e quindi un nuovo approccio per aumentare il throughput del sistema è proposto e presentato qui. Questa nuova tecnica, indicata come controllo di feedback basato sulla popolazione cellulare, considera la risposta di permeabilizzazione cellulare a una varietà di condizioni di impulso dell'elettroporazione e determina le condizioni di impulso di elettroporazione più adatte per il tipo di cellula in esame. Viene quindi utilizzata una modalità a throughput più elevato, in cui questo impulso "ottimale" viene applicato alla sospensione cellulare in transito. I passaggi per fabbricare il dispositivo, impostare e gestire gli esperimenti microfluidici e analizzare i risultati sono presentati in dettaglio. Infine, questa tecnologia di micro-elettroporazione è dimostrata fornendo un plasmide del DNA che codifica per la proteina fluorescente verde (GFP) nelle cellule HEK293.

Introduzione

Le attuali innovazioni terapeutiche nella ricerca biomedica, come la terapia cellulare CAR-T (Chimeric Antigen Receptor Engineered T cell) e l'editing genetico utilizzando CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeat DNA sequences) / Cas9, si basano fortemente sulla capacità di fornire materiale esogeno sia con successo che in modo efficiente nello spazio intracellulare¹. Nella terapia CAR-T, il gold standard per eseguire la fase di consegna genica nella produzione di terapia cellulare è l'utilizzo di vettori virali². Sebbene la consegna genica mediata da virus sia una modalità di consegna efficiente,....

Protocollo

NOTA: gli utenti devono esaminare tutte le schede di sicurezza per i materiali e i materiali di consumo utilizzati in questo protocollo. In ogni fase devono essere indossati DPI appropriati e durante la sperimentazione deve essere utilizzata una tecnica sterile. Le sezioni 1-7 illustrano la fabbricazione del dispositivo.

1. Fabbricazione del dispositivo - Design della maschera

NOTA: Fare riferimento alla Figura 2 per un'illustrazione del processo di microfabbricazione. Le fasi di microfabbricazione devono essere eseguite in un ambiente di camera bianca. Sono necessari ....

Risultati

La figura 4 evidenzia i principi operativi alla base del rilevamento della permeabilizzazione della membrana a livello di singola cellula per un'ampiezza di impulso singolo. Dopo l'avvio dell'esperimento di elettroporazione, l'algoritmo di rilevamento cellulare determina una soglia ottimale per il rilevamento delle cellule tramite un metodo di rilevamento punto per punto, basato sulla pendenza. Il sistema monitora quindi continuamente (1) una variazione negativa significativa della corrente .......

Discussione

La metodologia presentata all'interno di questo protocollo si concentra principalmente sulla microfabbricazione di un dispositivo microfluidico che viene poi integrato in una configurazione sperimentale di elettroporazione specializzata. Il termine "ricetta", che viene spesso utilizzato quando si descrivono le specifiche del processo di microfabbricazione, suggerisce l'importanza di seguire / ottimizzare ogni fase per fabbricare con successo un dispositivo funzionante. Tuttavia, alcune fasi critiche all'interno del proce.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastre di Petri da 150 mm di diametro	VWR	25384-326	passaggio 6.1.1 per fissare il wafer
Piastre per coltura tissutale a 24 pozzetti	VWR	10062-896	passaggio 10.3.6 per piastra di celle elettroporate
33220A Generatore di forme d'onda/funzioni	Agilent		passo 9.2.3
'' Si-wafers	University Wafer		sottosezione 2.1 per la fabbricazione di canali microfluidici piastre
coltura tissutale a 6 pozzetti	VWR	10062-892	passaggio 8.1.8 per piastre
di cellule Acetone	Fisher Scientific	A18-4	passaggio 2.1.2 per la pulizia e  passaggio 5.1 photoresist lift-off
Allegra X-22R Centrifuga	Beckman Coulter		passaggi 8.1.4 , 8.3.2. e 8.3.3. per far girare le cellule
AutoCAD 2018	Autodesk		sottosezione 1.1. per progettare maschere di trasparenza
Mordenzante all'ossido tamponato 10:1	VWR	901621-1L	sottosezione 3.1 per incisione HF
CCD Fotocamera per microscopio monocromatica	Hamamatsu	Orca 285 C4742-96-12G04	passaggio 11.2.3. per la fotocamera CMOS per imaging
- Sensicam QE 1.4MP	PCO		sottosezione 9.3 parte della configurazione sperimentale
Epossidica	conduttivaCircuitWorks	CW2400	sottosezione 7.6. per l'attacco del filo
Provette per centrifuga conica, 15 mL	Fisher Scientific	14-959-70C	passo 8.1.4. per la centrifugazione cellulare
Dektak 3ST Profilometro di superficie	Veeco (Sloan/Dektak)		passo 2.1.15 e 5.4 per profilometria
di superficie Punzone per biopsia monouso, 0,75 mm	Robbins Instruments	RBP075	passo 6.2.3 per l'accesso all'ingresso
Punzone per biopsia monouso, 3 mm	Robbins Instruments	RBP30P	passo 6.2.3 per accesso all'uscita
DRAQ5	abcam	ab108410	passo 11.2.2. per colorazione di cellule vive
Dulbecco' s Aquila modificata' s Medium	ThermoFisher Scientific	11885084	passaggio 8.1.2. parte della composizione del supporto
E3631A Alimentatore bipolare a tripla CC	Passaggio Agilent		9.2.1.-9.2.2.parte della configurazione sperimentale
Eclipse TE2000-U Invertito  Microscopio	Nikon		sottosezione 9.3. parte della configurazione sperimentale
EVG620 Sistema di litografia UV	EVG		Passaggio 2.1.9. e 2.2.7. per l'esposizione ai raggi UV
Siero fetale bovino	Neuromics	FBS001	passaggio 8.1.2. parte della composizione del terreno
FS20 Pulitore a ultrasuoni	Fisher Scientific		sottosezione 5.1. per il sollevamento
fotoresist Flacone di terreno in vetro con tappo, 100 ml	Fisher Scientific	FB800100	passaggio 8.2.1. per la conservazione del tampone
Flacone per terreno di coltura in vetro con tappo, 500 ml	Fisher Scientific	FB800500	passaggio 8.1.2.per la conservazione dei terreni
Linea cellulare HEK-293	ATCC	CRL-1573	sottosezione 8.1 per la coltura cellulare
tampone HEPES	Sigma Aldrich	83264-100ML-F	passaggio 8.2.1 parte della composizione del tampone per elettroporazione
Esametiltililazano	Sigma Aldrich	379212-25ML	passaggio 2.2.3 promotore di adesione
HF2LI Lock-in Amplifier	Zurigo Strumenti		sottosezione 9.2 parte della configurazione sperimentale
HF2TA Amplificatore di corrente	Zurich Instruments		sottosezione 9.2 parte della configurazione sperimentale
Alcool isopropilico	Fisher Scientific	A459-1	passaggio 2.1.2 per la pulizia, passaggio 2.1.14 per il risciacquo del wafer dopo lo sviluppo dell'SU-8 e passaggio 6.3.1 per la pulizia
PDMS IX81 microscopio a fluorescenza	Olympus		passaggio 11.2.3 per l'imaging
Soluzione di L-glutammina	Sigma Aldrich	G7513-20ML	passaggio 8.1.2. parte della composizione del supporto
M16878/1BFA filo calibro 22 AWC		B22-1	sottosezione 7.5 per la fabbricazione del dispositivo
Cloruro di magnesio	Sigma Aldrich	208337-100G	passaggio 8.1.2 parte della composizione del tampone di elettroporazione
MF 319 Sviluppatore	Kayaku Materiali avanzati	10018042	passaggio 2.2.9. rivelatore di fotoresist
Microposit S1818 fotoresist	Kayaku Advanced Materials	1136925	passaggio 2.2.4 fotoresist positivo per la modellazione degli elettrodi
Vetrini per microscopio, 75 x 25 mm	VWR	16004-422	passaggio 2.2.1 substrato di vetro sodo-calcico dell'elettrodo
Modello 2350 Amplificatore ad alta tensione	TEGAM	2350	passaggio 9.2.5. parte della configurazione sperimentale
National Instruments LabVIEW	acquisizione dati	National Instruments
, 30G x 1 in	BD Scientific	305128	passaggio 10.1.1. parte del sistema di priming
PA90 IC OPAMP Circuito di alimentazione	Digi-key	598-1330-ND	Parte del circuito personalizzato
Penicillina-Streptomicina	Sigma Aldrich	P4458-20ML	passo 8.1.2. Parte della composizione multimediale
Plasmide pMAX-GFP	Lonza	VCA-1003	passo 8.3.4. per la somministrazione intracellulare
Tubo di plastica, 0,010'' x 0,030"	VWR	89404-300	passo 10.1.2. per l'adescamento del sistema
Bersagli di platino	Kurt J. Lesker		sottosezione 4.2. per la deposizione fisica da vapore
Cloruro di potassio	Sigma Aldrich	P9333-500G	Passaggio 8.2.1. parte della composizione del tampone per elettroporazione
Pompa 11 Pompa a siringa microfluidica PicoPlus	Apparecchio Harvard	MA1 70-2213	fase 10.1.4. per l'adescamento del sistema
PVD75 Sistema di deposizione fisica da vapore	Kurt J. Lesker		sottosezione 4.1. per la deposizione fisica da vapore
PWM32 Sistema spinner	Headway Fasi di ricerca		2.1.6 e 2.2.2. per il rivestimento del substrato con fotoresist
PX-250 Sistema di trattamento al plasma	March Instruments		sottosezione 7.2 per PDMS e legame di substrati di vetro
SDG1025 Generatore di funzioni/forme d'onda	Passaggio significativo		9.2.2. parte della configurazione sperimentale
Idrossido di sodio	Sigma	Aldrich S8045-500G	passaggio 8.2.1. parte della composizione del tampone di elettroporazione
SU-8 2010 fotoresist negativo	Kayaku Materiali avanzati	Y111053	passaggio 2.1.7. per la modellazione di canali microfluidici
Sviluppatore SU-8	Microchem	Y010200	passaggio 2.1.12. per lo sviluppo di fotoresist
Sucrose	Sigma	Aldrich S7903-1KG	passaggio 8.2.1. parte della composizione del tampone di elettroporazione
Kit elastomero Sylgard 184	Dow Corning	3097358-1004	passaggio 6.2.1  10 : 1 miscela di polimero PDMS e agente indurente
Siringa, 1 ml	BD Scientific	309628	passaggio 8.3.4. parte del sistema di priming
SZ61 Stereomicroscopio Sistema	Olympus		sottosezione 7.3. per l'allineamento di canali ed elettrodi
Fiasche T25 trattate con coltura tissutale	Falcon	353108	passaggio 8.1.2 per la coltura cellulare
Bersagli in titanio	Kurt J. Lesker		sottosezione 4.2. per la deposizione fisica da vapore
Maschere di trasparenza	CAD/ART Servizi		fasi 2.1.9. e 2.2.7. per fotolitografia
Tricloro(1H,1H,2H,2H-perfluoroottil)silano	Sigma Aldrich	448931-10G	passo 6.1.2. per silanizzazione wafer
Soluzione tripsina-EDTA	Sigma Aldrich	T4049-100ML	fasi 8.1.3. e 8.3.1. per la raccolta di cellule