Method Article

Colonne di cromatografia di affinità della membrana cellulare per identificare metaboliti vegetali specializzati che interagiscono con il recettore della tropomiosina chinasi B immobilizzato

DOI:

10.3791/63118

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January 19th, 2022

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1Department of Biological Sciences, The University of Alabama, 2Department of Pharmaceutical Botany, Faculty of Pharmacy, Hacettepe University

In This Article

Summary

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Il protocollo descrive la preparazione di colonne di cromatografia di affinità della membrana cellulare (CMAC) con frammenti di membrana cellulare immobilizzata contenenti proteine B funzionali del recettore B della tropomiosina chinasi transmembrana. Viene inoltre spiegato l'uso di colonne CMAC nell'identificazione di metaboliti vegetali specializzati che interagiscono con questi recettori e presenti in miscele naturali complesse.

Abstract

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Le sostanze chimiche sintetizzate da piante, funghi, batteri e invertebrati marini sono state una ricca fonte di nuovi colpi di droga e piombo. Farmaci come statine, penicillina, paclitaxel, rapamicina o artemisinina, comunemente usati nella pratica medica, sono stati identificati e isolati per la prima volta dai prodotti naturali. Tuttavia, l'identificazione e l'isolamento di metaboliti specializzati biologicamente attivi da fonti naturali è un processo impegnativo e dispendioso in termini di tempo. Tradizionalmente, i singoli metaboliti vengono isolati e purificati da miscele complesse, in seguito all'estrazione della biomassa. Successivamente, le molecole isolate vengono testate in saggi funzionali per verificarne l'attività biologica. Qui presentiamo l'uso delle colonne di cromatografia di affinità di membrana cellulare (CMAC) per identificare composti biologicamente attivi direttamente da miscele complesse. Le colonne CMAC consentono l'identificazione di composti che interagiscono con proteine transmembrana funzionali immobilizzate (TMP) incorporate nel loro ambiente nativo di fosfolipidi a doppio strato. Si tratta di un approccio mirato, che richiede la conoscenza del TMP la cui attività si intende modulare con il candidato farmaco a piccola molecola appena identificato. In questo protocollo, presentiamo un approccio per preparare colonne CMAC con recettore immobilizzato della tropomiosina chinasi B (TrkB), che è emerso come un bersaglio praticabile per la scoperta di farmaci per numerosi disturbi del sistema nervoso. In questo articolo, forniamo un protocollo dettagliato per assemblare la colonna CMAC con recettori TrkB immobilizzati utilizzando linee cellulari di neuroblastoma che sovraesprimono i recettori TrkB. Presentiamo inoltre l'approccio per studiare la funzionalità della colonna e il suo utilizzo nell'identificazione di metaboliti vegetali specializzati che interagiscono con i recettori TrkB.

Introduction

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Le miscele botaniche sono ricche di composti farmacologicamente attivi1, che fungono da buona fonte per l'identificazione di nuovi colpi di farmaci e conduce 2,3,4,5. La scoperta di nuovi farmaci da prodotti naturali è stato un approccio fruttuoso e molti farmaci attualmente approvati hanno avuto origine da composti identificati per la prima volta in natura. La diversità chimica dei composti naturali è difficile da eguagliare nelle librerie artificiali di molecole sintetizzate chimicamente. Molti composti naturali interagiscono e modulano bersagli proteici umani e possono essere considerati molecole simili a farmaci ottimizzate evolutivamente6. Questi composti naturali sono particolarmente adatti per l'identificazione del piombo farmacologico da utilizzare nei disturbi neurologici6. Due dei farmaci attualmente approvati dalla FDA per la gestione della malattia di Alzheimer (AD) sono derivati da alcaloidi naturali, vale a dire: galantamina e rivastigmina (un derivato della fisostigmina)6. L-DOPA, attualmente il farmaco più comunemente prescritto per il morbo di Parkinson, è stato identificato per la prima volta dalla fava (Vicia faba L.) 7. Pergolide e lisuride, agonisti del recettore dopaminergico sono i derivati degli alcaloidi naturali della segale cornuta dal fungo parassita Claviceps purpurea8. Reserpina, un alcaloide isolato dalla radice di serpente indiana (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz) è stato uno dei primi farmaci antipsicotici9. Recentemente, la risposta immunitaria disregolata e l'infiammazione sistemica sono state collegate allo sviluppo di numerosi disturbi neurologici, come il disturbo depressivo maggiore o le malattie neurodegenerative10. Una dieta a base vegetale insieme ad altri interventi sullo stile di vita è stata trovata per migliorare le capacità cognitive e funzionali negli anziani 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Alcune molecole elettrofile appartenenti a triterpeni e polifenoli sono state trovate per modulare le risposte infiammatorie sia in vitro che in vivo modelli12. Ad esempio, i composti naturali contenenti α.β-insaturo carbonile (ad esempio, curcumina, cinnamaldeide) o gruppo isotiocianato (ad esempio, sulforafano) interferiscono con la dimerizzazione del recettore Toll-like-4 (TLR4) inibendo la sintesi a valle di citochine pro-infiammatorie in una linea cellulare pro-B murina interleuchina-3 dipendente12,22 . Le evidenze epidemiologiche indicano fortemente che i fitochimici dietetici, presenti in matrici alimentari complesse, possono anche costituire una valida fonte di nuovi lead farmacologici6.

Uno dei maggiori ostacoli nell'identificazione di molecole biologicamente attive presenti negli estratti vegetali, compresi gli alimenti a base vegetale, è la complessità dei campioni indagati. Tradizionalmente, i singoli composti vengono isolati, purificati e successivamente testati per l'attività biologica. Questo approccio di solito porta all'identificazione dei composti più abbondanti e ben caratterizzati. Gli approcci fenotipici alla scoperta di farmaci senza un bersaglio molecolare definito si basano sul frazionamento bioguidato di miscele complesse23. In questo approccio, un estratto viene frazionato in sottofrazioni meno complesse che vengono successivamente testate in saggi fenotipici. L'isolamento e la purificazione dei composti attivi sono guidati dall'attività biologica verificata nel test. La conoscenza dell'identità di un bersaglio farmacologico specifico può accelerare significativamente l'identificazione di composti farmacologicamente attivi presenti in miscele complesse. Questi approcci sono solitamente basati sull'immobilizzazione del bersaglio molecolare, ad esempio un enzima, su una superficie solida, come le perle magnetiche23. I bersagli immobilizzati vengono successivamente utilizzati negli esperimenti di screening con conseguente isolamento di composti che interagiscono con il bersaglio. Mentre questo approccio è stato ampiamente utilizzato nell'identificazione di composti mirati alle proteine citosoliche, è stato applicato meno comunemente nell'identificazione di sostanze chimiche che interagiscono con le proteine transmembrana (TMP)23. Un'ulteriore sfida nell'immobilizzazione dei TMP deriva dal fatto che l'attività della proteina dipende dalla sua interazione con i fosfolipidi della membrana cellulare e altre molecole nel doppio strato come il colesterolo23,24. È importante preservare queste sottili interazioni tra le proteine e il loro ambiente nativo fosfolipidico a doppio strato quando si tenta di immobilizzare il bersaglio transmembrana.

Nella cromatografia di affinità di membrana cellulare (CMAC) i frammenti di membrana cellulare, e non le proteine purificate, sono immobilizzati sulla membrana artificiale (IAM) particelle di fase stazionaria23. Le fasi stazionarie IAM sono preparate legando covalentemente gli analoghi della fosfatidilcolina sulla silice. Recentemente sono state sviluppate nuove classi di fasi stazionarie IAM in cui i gruppi di ammine e silanoli liberi sono end-capped (IAM. PC. Particelle DD2). Durante la preparazione delle colonne CMAC i frammenti di membrana cellulare vengono immobilizzati sulla superficie delle particelle IAM attraverso l'adsorbimento.

Le colonne CMAC sono state utilizzate fino ad oggi per immobilizzare diverse classi di TMP, inclusi i canali ionici (ad esempio, recettori nicotinici), GPCR (ad esempio, recettori oppioidi), trasportatori di proteine (ad esempio, p-glicoproteina), ecc.24. I bersagli proteici immobilizzati sono stati utilizzati nella caratterizzazione della farmacodinamica (ad esempio, costante di dissociazione, Kd) o nella determinazione della cinetica di legame (kon e koff) di ligandi di piccole molecole che interagiscono con il bersaglio, nonché nel processo di identificazione di potenziali nuovi lead farmacologici presenti in matrici complesse24 . Qui presentiamo la preparazione di colonne CMAC con il recettore immobilizzato della tropomiosina chinasi B (TrkB), che è emerso come un bersaglio praticabile per la scoperta di farmaci per numerosi disturbi del sistema nervoso.

Studi precedenti hanno dimostrato che l'attivazione del fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF)/TrkB è associata al miglioramento di alcuni disturbi neurologici, come l'AD o il disturbo depressivo maggiore 25,26,27,28. È stato riportato che i livelli di BDNF e il suo recettore TrkB di espressione diminuiscono nell'AD e riduzioni simili compromettono la funzione dell'ippocampo in modelli animali di AD29. Livelli ridotti di BDNF sono stati riportati nel siero e nel cervello dei pazienti con AD 30,31,32. La sovraespressione di Tau o l'iperfosforilazione sono state trovate per down-regolare l'espressione di BDNF nei neuroni primari e modelli animali di AD 33,34,35. Inoltre, è stato segnalato che il BDNF ha effetti protettivi sulla neurotossicità indotta da β-amiloide in vitro e in vivo36. La somministrazione diretta di BDNF nel cervello del ratto ha dimostrato di aumentare l'apprendimento e la memoria negli animali cognitivamente compromessi37. BDNF / TrkB è emerso come un obiettivo valido per migliorare i disturbi neurologici e psichiatrici tra cui AD28,38. Prendere di mira la via di segnalazione BDNF / TrkB per lo sviluppo di terapie nell'AD migliorerà potenzialmente la nostra comprensione della malattia39. Sfortunatamente, il BDNF stesso non può essere usato come trattamento a causa delle sue scarse proprietà farmacocinetiche e degli effetti collaterali avversi40. Gli attivatori di piccole molecole delle vie TrkB/BDNF sono stati esplorati come potenziali ligandi TrkB 41,42,43. Tra gli agonisti di piccole molecole testati, il 7,8-diidrossiflavone (7,8-DHF), ha dimostrato di attivare la via BDNF/TrkB 41,44,45,46. Un derivato del 7,8-DHF (R13; 4-Oxo-2-fenil-4H-cromone-7,8-diil bis(metilcarbammato)) è attualmente in esame come possibile farmaco per l'AD47. Recentemente, è stato dimostrato che diversi antidepressivi agiscono attraverso il legame diretto al TrkB e la promozione della segnalazione BDNF, sottolineando ulteriormente l'importanza di perseguire TrkB come obiettivo valido per il trattamento di vari disturbi neurologici48.

Il protocollo descrive il processo di assemblaggio della colonna TrkB funzionale e della colonna di controllo negativo TrkB-NULL. Le colonne sono caratterizzate utilizzando un noto prodotto naturale legante molecolare piccolo: 7,8-DHF. Inoltre, descriviamo il processo di screening di matrici complesse, utilizzando l'estratto vegetale come esempio, per l'identificazione di composti che interagiscono con TrkB.

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Protocol

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1. Coltura cellulare di cellule di neuroblastoma SH-SY5Y (linee cellulari TrkB e TrkB-NULL (parentali))

NOTA: Le linee cellulari (SH-SY5Y Cell Line (TrkB, BR6) e SH-SY5Y Parental Cell Line (TrkB NULL))49,50 sono state acquistate da Kerafast. Le cellule coltivate sono utilizzate come fonte dei recettori transmembrana da immobilizzare per la preparazione delle colonne CMAC. I seguenti passaggi descrivono come ottenere frammenti di membrana cellulare e assemblare colonne CMAC funzionali.

  1. Far crescere le cellule in un terreno di coltura cellulare preparato mescolando 450 mL di mezzi RPMI, 50 mL di FBS, 5 mL di soluzione di penicillina/streptomicina e 0,3 mg/mL di geneticina (G418) in una piattaforma di coltura cellulare da 150 mm a 37 °C in atmosfera umida con il 5% di CO2.

2. Raccolta delle cellule

  1. Confermare la confluenza cellulare (80%-90%) utilizzando un microscopio, raggiunto dopo 3-4 giorni dal passaggio cellulare.
  2. Aspirare il terreno di coltura cellulare da sopra le cellule e lavare le cellule due volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, 1x, pH 7,4). Rimuovere PBS e aggiungere 2 ml di tripsina a bassa concentrazione (0,25%) per staccare le cellule.
  3. Ruotare delicatamente la piastra per coprire uniformemente tutte le cellule con soluzione di tripsina e incubare le cellule per circa 2 minuti a 37 °C in un'atmosfera umida con il 5% di CO2. Aggiungere 8 mL di terreno di coltura cellulare alle cellule staccanti e trasferire le cellule staccate in un tubo conico da 50 mL e posizionarlo sul ghiaccio.
  4. Utilizzare un emocitometro per stimare il numero di cellule (circa 3 x 107 cellule). Mescolare la sospensione cellulare mediante pipettaggio su e giù per ottenere una densità cellulare uniforme nella miscela. Posizionare 10 μL di sospensione cellulare sotto il coverslip e contare le cellule al microscopio utilizzando un obiettivo 40x.

3. Omogeneizzazione cellulare

  1. Preparare soluzioni stock dei seguenti inibitori della proteasi: benzamidina (200 mM), fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF, 10 mM) e cocktail di inibitori della proteasi disponibili in commercio (concentrazione 100x) contenente 4-(2-amminoetil)benzenesulfonilfluoruro cloridrato (AEBSF), proteponina, bestatina e leupeptina.
    ATTENZIONE: il PMSF deve essere maneggiato solo all'interno della cappa aspirante.
    1. Preparare la soluzione madre di benzamidina (200 mM) sciogliendo 120 mg di benzamidina in 5 ml di acqua deionizzata ultrapura. Conservare a 4 °C e utilizzare entro un giorno. Preparare la soluzione appena prima di ogni utilizzo (consigliato).
    2. Preparare la soluzione madre PMSF (10 mM) sciogliendo 0,017 g di PMSF in 10 ml di etanolo. Conservare a - 20 °C.
    3. Preparare il cocktail inibitore della proteasi (100x) sciogliendo la miscela di inibitori della proteasi disponibile in commercio in 1 mL di acqua deionizzata ultrapura. Mescolare accuratamente e aliquota 200-300 μL del cocktail e conservare a - 20 °C prima dell'uso.
  2. Preparare la soluzione madre di ATP (100 mM) sciogliendo 55,114 mg di IDRATO DI SALE DISODICO ATP in 1 mL di acqua ultrapura deionizzata. Miscelare accuratamente e aliquota 100 μL della miscela e conservare a - 20 °C prima dell'uso.
  3. Preparare il tampone sciogliendo 3,03 g di tris(idrossimetil)aminometano cloridrato (Tris-HCl, 50 mM), 2,9 g di cloruro di sodio (NaCl, 100 mM), 0,22 g di cloruro di calcio anidro (CaCl2, 3 mM), 0,2 g di cloruro di magnesio esaidrato (MgCl2, 2 mM) e 0,19 di cloruro di potassio (KCl, 5 mM) in 500 mL di acqua deionizzata ultrapura.
  4. Preparare il tampone di omogeneizzazione mescolando 17,3 mL del tampone preparato nella fase 3.3 con 0,3 mL (3 mM) di soluzione madre di benzamidina, 0,2 mL (0,1 mM) di soluzione madre PMSF, 0,2 mL di miscela cocktail inibitore della proteasi, 20 μL (100 μM) di soluzione madre di ATP, 2 ml (10%) di glicerolo e 0,029 g (5mM) di EDTA (Tabella 1). Regolare il pH a 7,4 utilizzando la soluzione di acido cloridrico.
  5. Girare le cellule raccolte nel passaggio 2.3 a 4 °C per 5 minuti a 400 x g. Rimuovere il surnatante e lavare il pellet cellulare rimanente con 10 ml di PBS ghiacciato (1x, pH 7,4). Far girare nuovamente le celle a 4 °C per 5 minuti a 400 x g.
  6. Scartare il surnatante e sostituirlo con 20 ml di tampone di omogeneizzazione preparato al punto 3.4. Posizionare il tubo conico sul ghiaccio.
  7. Trasferire la sospensione cellulare in una smerigliatrice di tessuto omogeneizzatore Dounce da 40 ml e metterla sul ghiaccio. Omogeneizzare la sospensione manualmente, su ghiaccio, utilizzando 40 colpi di pestello su e giù. Trasferire la sospensione cellulare omogeneizzata in un tubo conico da 50 ml.
  8. Centrifugare l'omogeneizzato a 4 °C per 7 min a 400 x g. Scartare il pellet e trasferire il surnatante in un nuovo tubo conico e centrifugarlo a 4 °C per 30 minuti a 47900 x g. Salvare il pellet di membrana cellulare ed eliminare il surnatante.

4. Solubilizzazione della membrana cellulare

  1. Preparare il tampone di solubilizzazione mescolando 8,7 mL della soluzione tampone prodotta nella fase 3.3 con 0,1 mL (0,1 mM) di soluzione madre pmSF, 0,15 mL (3 mM) di soluzione madre di benzamidina, 0,1 mL di cocktail inibitore della proteasi, 10 μL (100 μM) di soluzione madre di ATP, 1 mL (10%) di glicerolo e 0,2 g (2%) di colato di sodio (Tabella 2).
  2. Trasferire il tampone di solubilizzazione nel tubo conico con i frammenti di membrana cellulare ottenuti nella fase 3.8 e risospendere il pellet. Ruotare la miscela risultante a 150 giri/min a 4 °C per 18 ore.
    NOTA: A questo punto, l'esperimento può essere sospeso per la solubilizzazione notturna del pellet di membrana cellulare.

5. Immobilizzazione della membrana cellulare su IAM. PC. Particelle DD2

  1. Dopo 18 ore, centrifugare la miscela di solubilizzazione a 4 °C per 30 minuti a 47900 x g.
  2. Conservare il surnatante ed scartare il pellet. Aggiungere 100 mg di IAM. PC. Le particelle DD2, al surnatante, ruotano e ruotano la miscela di sospensione risultante a 150 giri/min a 4 °C per 1 ora.
  3. Facilitare l'immobilizzazione dei frammenti di membrana cellulare sullo IAM. PC. Le particelle DD2 procedono alla fase di dialisi come descritto di seguito.
    1. Preparare il tampone di dialisi in 4 L di acqua deionizzata ultrapura aggiungendo 24 g di tris-HCl (50 mM), 23,4 g di NaCl (100 mM), 0,06 g di CaCl2 (0,1 mM), 5,85 g di EDTA (5 mM) e 0,07 g di PMSF (0,1 mM; Tabella 3).
      NOTA: il PMSF non è solubile in acqua, quindi scioglierlo prima in piccoli volumi di etanolo e poi aggiungere lentamente nel becher con il tampone.
    2. Regolare il pH a 7,4 con soluzione di acido cloridrico. Posizionare il tampone a 4 °C per un minimo di 1 ora prima di procedere alla fase di dialisi.
    3. Preparare il tubo di dialisi tagliando 10 cm di tubo di dialisi a membrana di cellulosa (10 K MWCO, 35 mm) e trasferire la sospensione contenente IAM. PC. Particelle DD2 e frammenti di membrana cellulare nel tubo di dialisi. Utilizzare clip per tubi per dialisi per chiudere entrambe le estremità del tubo di dialisi.
    4. Posizionare il tubo di dialisi contenente lo IAM. PC. DD2 fase stazionaria nel tampone dialitico e dializzare a 4 °C per 24 ore mescolando delicatamente.
    5. Dopo 24 ore, posizionare il tubo di dialisi nel tampone di dialisi appena preparato e continuare la dialisi per altre 24 ore.

6. Imballaggio della colonna CMAC

  1. Preparare il tampone di acetato di ammonio (10 mM, pH 7,4) che verrà utilizzato per lavare lo IAM. PC. Particelle DD2 e esperimenti di caratterizzazione in colonna sciogliendo 0,7708 g di acetato di ammonio in 1 L di acqua deionizzata ultrapura. Regolare il pH a 7,4 con soluzione di acido cloridrico.
  2. Dopo 48 ore di dialisi, rimuovere il tubo di dialisi dal tampone di dialisi e trasferire il contenuto del tubo di dialisi in un tubo conico da 15 ml.
  3. Centrifugare la miscela a 4 °C per 5 minuti a 400 x g. Scartare il surnatante e lavare il pellet rimanente tre volte con 10 ml di tampone di acetato di ammonio, centrifugando la miscela a 4 °C per 5 minuti a 400 x g, dopo ogni lavaggio.
  4. Dopo il terzo lavaggio, risospese il pellet rimanente in 1 mL di tampone di acetato di ammonio. Mescolare accuratamente e utilizzare il liquame risultante per imballare la colonna di vetro 5/20 per produrre la colonna di cromatografia CMAC.
  5. Per imballare la colonna, posizionare prima un filtro inferiore precedentemente imbevuto di tampone di acetato di ammonio, nel portafiltro. Montare il portafiltro nella colonna di vetro e avvitare il cappuccio della colonna per fissare la posizione del supporto. Posizionare la colonna verticalmente in un morsetto per le dita e fissarla nel supporto del laboratorio. Posiziona un becher sotto la colonna.
  6. Utilizzando un pipettor a canale singolo trasferire un piccolo volume del liquame ottenuto al punto 6.4 nella colonna di vetro. Versare il materiale lentamente, tenendo la punta della pipetta contro la parete della colonna di vetro. Lasciare depositare il materiale di imballaggio prima di versare un altro volume di liquame.
  7. Per accelerare il processo di imballaggio, rimuovere il tampone dall'alto del letto fisso utilizzando una micropipetta tra ogni passaggio. Ripetere questi passaggi fino a quando 1 mL di liquame è imballato.
  8. Posizionare un filtro superiore e avvitare l'unità adattatore in modo che non vi sia alcun buffer residuo al di sopra della fase stazionaria, come illustrato nella Figura 1. Fissare la posizione dell'unità adattatore con il blocco dell'adattatore.
  9. Collegare la colonna a una pompa per cromatografia liquida (HPLC) ad alte prestazioni, impostare la portata su 0,2 ml/min e lavare la colonna durante la notte con tampone di acetato di ammonio. La colonna è ora pronta per la fase di caratterizzazione. Conservare la colonna a 4 °C fino all'uso.
    NOTA: per una conservazione più lunga (colonna non utilizzata per più di una settimana) eseguire la colonna con una soluzione di azide di sodio allo 0,05% in tampone di acetato di ammonio e conservare a 4 °C.
    ATTENZIONE: L'azide di sodio è altamente tossico se ingerito per via orale o assorbito attraverso la pelle; dovrebbe essere maneggiato solo sotto la cappa aspirante. Assicurarsi di indossare un camice da laboratorio, occhiali di sicurezza e guanti (nitrile preferito) quando si lavora con azide di sodio.

7. Caratterizzazione della colonna CMAC

  1. Microscopia confocale e legame BDNF
    1. Preparare IAM. Pcc. DD2 particelle in fase stazionaria con frammenti di membrana cellulare immobilizzati ottenuti separatamente dalle cellule di neuroblastoma SH-SY5Y sovraesprimendo le cellule TrkB e SH-SY5Y TrkB-NULL seguendo le istruzioni dal passo 1 al passo 6.4.
    2. Per i campioni che saranno incubati con BDNF prima della colorazione degli anticorpi, preparare la soluzione madre BDNF sciogliendo 10 μg di BDNF in 100 μL di acqua deionizzata ultrapura. Conservare la soluzione a -20 °C.
      1. Trasferimento in tubi microcentrifuga separati da 1,5 mL, aliquota 100 μL di IAM. PC. Materiale di imballaggio della colonna DD2 con cellule di neuroblastoma SH-SY5Y immobilizzate che sovraesprimono TrkB e aliquote 100 μL di IAM. PC. Materiale di imballaggio della colonna DD2 con celle TrkB-NULL SH-SY5Y immobilizzate sospese in tampone di acetato di ammonio.
      2. Aggiungere 390 μL di tampone di acetato di ammonio, 10 μL di soluzione madre BDNF e 0,5 μL di soluzione madre di ATP (preparata al punto 3.2) in ciascun tubo e incubare per 1 ora a temperatura ambiente con dondolo.
    3. Per i campioni che non saranno incubati con BDNF prima della colorazione degli anticorpi, trasferire un'aliquota di 100 μL di IAM. PC. Materiale di imballaggio della colonna DD2 con cellule di neuroblastoma SH-SY5Y immobilizzate che sovraesprimono TrkB sospeso in acetato di ammonio in tubi microcentrifuga da 1,5 mL.
    4. Aggiungere 400 μL di tampone di acetato di ammonio e 0,5 μL di soluzione madre di ATP (preparata nella fase 3.2) in ciascun tubo e incubare per 1 ora a temperatura ambiente con dondolo.
    5. Ruotare i campioni preparati nei passaggi 7.1.2 e 7.1.4 a 4 °C per 1 minuto a 10.000 x g ed eliminare il surnatante.
    6. Lavare i pellet risultanti con 500 μL di tampone di acetato di ammonio per 10 minuti e girare nuovamente a 4 °C per 1 minuto a 10.000 x g ed eliminare il surnatante.
    7. A ciascuno dei pellet, aggiungere 220 μL di tampone di acetato di ammonio, 25 μL di siero di capra normale al 10% e 5 μL di anticorpo anti-BDNF primario. Incubare in una cella frigorifera (4 °C) durante la notte con dondolo.
    8. Al termine della fase di incubazione, far girare la miscela per 1 minuto a 10.000 x g a 4 °C ed eliminare il surnatante.
    9. Lavare il pellet risultante 3 volte con tampone di acetato di ammonio contenente l'1% di detergente delicato (ad esempio, colato di sodio) per 10 minuti e girare le miscele per 1 minuto a 10.000 x g a 4 °C ed eliminare il surnatante.
    10. Preparare la soluzione anticorpale secondaria mescolando 900 μL di tampone di acetato di ammonio, 100 μL di siero di capra normale al 10% e 1 μL di anticorpo secondario coniugato con fluoroforo (diluizione 1:1.000). Aggiungere 300 μL di soluzione anticorpale secondaria a ciascuno dei pellet ottenuti al punto 7.1.9. e incubare durante la notte a 4 °C con dondolo.
    11. Girare la miscela a 10.000 x g per 1 minuto a 4 °C ed eliminare il surnatante.
    12. Lavare il pellet risultante 3 volte con tampone di acetato di ammonio contenente l'1% di detergente delicato (ad esempio, colato di sodio) per 10 minuti e girare la miscela per 1 minuto a 10.000 x g a 4 °C ed eliminare il surnatante.
    13. Risospesso i pellet risultanti in 50 μL di tampone di acetato di ammonio. Posizionare 20 μL di ciascuna delle miscele su una diapositiva e coprire con una copertina.
    14. Immagina l'IAM. PC. Particelle DD2 con frammenti di membrana cellulare immobilizzata utilizzando un microscopio a scansione laser confocale con eccitazione a 488 nm ed emissione a 520 nm generata utilizzando un sistema laser a stato solido. Utilizzare un obiettivo 20x con un NA di 0,75 e WD di 0,35 mm.
  2. Cromatografia ad affinità frontale utilizzando 7,8-DHF come ligando marcatore
    1. Collegare una colonna CMAC a un sistema HPLC con un rivelatore a matrice di diodi e/o uno spettrometro di massa.
    2. Preparare 500 mL di 1 mM di soluzione di 7,8-DHF in tampone di acetato di ammonio contenente metanolo al 5%.
    3. Pompare una concentrazione costante del ligando marcatore (1 mM) attraverso la colonna CMAC a una portata di 0,4 ml/min a temperatura ambiente. Monitorare il profilo di eluizione utilizzando un rilevatore dad (diod array detection) (lunghezza d'onda 254 nm) o uno spettrometro di massa (utilizzare la modalità di monitoraggio a ioni singoli; m/z 253 in modalità di ionizzazione negativa).
    4. Dopo il completamento della corsa eseguire il lavaggio notturno facendo scorrere il tampone di acetato di ammonio attraverso la colonna.
    5. Ripetere i passaggi 7.2.2. - 7.2.4. utilizzando diverse concentrazioni del ligando marcatore (750 nM, 500 nM, 300 nM), lavando le colonne durante la notte dopo ogni corsa. Utilizzare la cromatografia di affinità frontale per calcolare il ligando Kd, come esaminato in dettaglio, altrove. 24.51
  3. Studi di spostamento con Centella asiatica (L.) Urb. Estratto di (gotu kola)
    1. Preparare 500 mL di soluzione da 500 nM di 7,8-DHF in tampone di acetato di ammonio contenente il 5% di metanolo e lo 0,2% di estratto acquoso di gotu kola (10 mg/mL).
    2. Pompare concentrazione costante del ligando marcatore (500 nM) con l'estratto attraverso la colonna a 0,4 ml/min di portata a temperatura ambiente. Monitorare il profilo di eluizione utilizzando un rivelatore DAD (lunghezza d'onda 254 nm) o uno spettrometro di massa (utilizzare la modalità di monitoraggio a ione singolo; m/z 253 in modalità di ionizzazione negativa).
    3. Dopo il completamento della corsa eseguire il lavaggio notturno facendo scorrere il tampone di acetato di ammonio attraverso la colonna.
    4. Tracciare i profili di eluizione per 500 nM 7,8-DHF e quello ottenuto dopo aver eseguito la soluzione con estratto di cola di gotu per ispezionare lo spostamento del ligando marcatore.

8. Approccio cromatografico di picco mancante per identificare potenziali leganti TrkB dall'estratto di cola di gotu

  1. Frazionamento dell'estratto di cola di gotu su colonne CMAC
    1. Collegare separatamente le colonne CMAC TrkB e TrkB-NULL a un sistema HPLC e iniettare 50 μL dell'estratto acquoso di gotu kola (10 mg/mL) su ciascuna delle colonne. Tampone di acetato di ammonio della pompa (10 mM, pH 7,4) contenente il 5% di metanolo attraverso la colonna a una portata di 0,4 ml/min a temperatura ambiente.
    2. Raccogliere le frazioni separatamente dalle colonne CMAC TrkB e TrkB-NULL come segue: 0-5 min, 5-10 min, 10-15 min, 15-20 min, 20-25 min, 25-30 min, 30-35 min, 35-40 min, 40-45 min, 45-50 min, 50-55 min, 55-60 min.
    3. Congelare e liofilizzare le frazioni ottenute. Risospese le frazioni liofilizzate in 50 μL di metanolo prima di procedere alla cromatografia liquida ultra-performante e all'analisi della spettrometria di massa.
  2. Cromatografia liquida ad alte prestazioni con spettrometria di massa a tempo di volo a quattro poli (UPLC-QTOF-MS) di frazioni CMAC di cola di gotu
    1. Analizzare tutte le frazioni ottenute al punto 8.1.3. utilizzando uno spettrometro di massa accoppiato con un sistema UPLC (modalità di analisi UPLC-MSE ). Analizzare le frazioni utilizzando una colonna C18 (2,1 x 50 mm, 1,7 μm) con una precolonna C18 VanGuard (2,1 mm x 5 mm, 1,7 μm).
    2. Eluire la colonna utilizzando le seguenti soluzioni gradientiche ad una portata di 0,3 mL/min con fase mobile A (acqua con acido formico allo 0,1%) e B (acetonitrile con acido formico allo 0,1%): 0,0 min 99% A 1% B, 1,5 min 84% A 16% B, 5,0 min 80% A 20% B, 7,0 min 75% A 25% B, 10,0 min 65% A 35% B, 20,0-24,0 min 1% A 99% B, 25,0-29,0 min 99% A 1% B.
    3. Impostare il volume di iniezione per ciascun campione su 3 μL. Eseguire MSE in modalità di ioni positivi e negativi di risoluzione, con energia di collisione a 4 V per bassa energia e 20-35 V per alta energia.
    4. Utilizzare le seguenti condizioni della sorgente ESI in modalità di ionizzazione positiva: tensione capillare 1,5 kV, cono di campionamento 40 V, offset sorgente 80, temperatura sorgente 100 °C, temperatura di desolvazione 350 °C, flusso gas cono 38,0 L/h, gas di desolvazione 400 L/h.
    5. Utilizzare le seguenti condizioni della sorgente ESI in modalità di ionizzazione negativa: tensione capillare 1,45 kV, cono di campionamento 40 V, offset sorgente 80, temperatura sorgente 110 °C, temperatura di desolvazione 300 °C, flusso gas cono 50,0 L/h, flusso gas di desolvazione 652 L/h.

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Results

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Seguendo il protocollo, sono state assemblate due colonne cromatografiche CMAC: una con i frammenti immobilizzati della membrana cellulare del neuroblastoma SH-SY5Y con TrkB sovraespresso e una con frammenti di membrana cellulare SH-SY5Y TrkB-NULL. La colonna CMAC correttamente assemblata è presentata in Figura 1 e le fasi coinvolte nell'immobilizzazione del frammento di membrana cellulare sono presentate in Figura 2.

Dall'immobilizza...

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Discussion

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L'identificazione di composti attivi presenti in miscele complesse di metaboliti specializzati è un compito molto impegnativo23. Tradizionalmente, i singoli composti sono isolati e la loro attività viene testata in diversi saggi. Questo approccio è dispendioso in termini di tempo e denaro e spesso porta all'isolamento e all'identificazione dei composti più abbondanti e ben caratterizzati23. I saggi di screening ad alto rendimento attualmente utilizzati si basano fortemente ...

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Disclosures

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Lukasz Ciesla collabora con Regis Technologies, il fornitore dello IAM. PC. Particelle DD2.

Acknowledgements

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Z.C.A. è stato supportato dal Consiglio di ricerca scientifica e tecnologica della Turchia (TUBITAK) 2219- International Postdoctoral Research Fellowship Program. La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata supportata dal National Center for Complimentary and Integrative Medicine del National Institutes of Health con il numero di premio 1R41AT011716-01. Questo lavoro è stato anche parzialmente supportato dall'American Society of Pharmacognosy Research Starter Grant, dalla sovvenzione Regis Technologies a L.C. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del National Institutes of Health.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
7-8 Diidrossiflavone idratoSigma-AldrichD5446-10 mg≥ 98% (HPLC)
Adenosina 5'-trifosfato (ATP) sale disodico idratoSigma-AldrichA2383-1 g
Acetato di ammonioVWR Chemicals BDHBDH9204-500 g
Anticorpo BDNFInvitrogenPA5-15198-400 μ LAnticorpo primario; 2 mg/mL di concentrazione
Benzamidina cloridrato idratoSigma-AldrichB6506-25 g
Fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF) umanoSigma-AldrichB3795-10 μ gRicombinante, espresso in E. coli, polvere liofilizzata, adatto per colture cellulari
Cloruro di calcioVWR AnaliticoBDH9224-1 kg
Acido colico sale sodicoAlfa AesarJ62050-100 g
Omogeneizzatore a discaVWR71000-51640 mL, 285 mm (lunghezza totale), 32 x 140 mm (O.D. x H)
EtanoloSigma-Aldrich493511
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)VWR AnalyticalBDH-9232-500 g
Siero fetale bovinoSigma-AldrichF2442-500 mLfiltrato in modo sterile, adatto per colture cellulari
G418 soluzione salina di disolfatoSigma-AldrichG8168-100 mL50 mg/mL in H2O, 0,1 μ m filtrato, adatto per colture cellulari
GliceroloVWR Life ScienceE520-100 mL
Membrana artificiale immobilizzata (IAM. PC. DD2)Regis Technologies, Inc.1-771050-500
Cloruro di magnesio esaidratoVWR AnaliticoBDH9244-500 mL
MetanoloSigma-Aldrich322425
Nikon C2 DUVbMicroscopio a scansione laser confocaleNikon
Siero di capra normale (10%)Life Technologies50197Z
Penicillina-StreptomicinaSigma-AldrichP4333-100 mL
Fenilmetanosulfonilfluoruro (PMSF)Thermo Scientific36978-5 g
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)VWR Life ScienceK812-500 mL1x
Cloruro di potassioVWR Chemicals BDH0395-1 kg
Cocktail di inibitori della proteasiVWR Life Science AmbresoM221-1 mLGrado proteomico, contenente 50 mM AEBSF, 30 µ M aprotonina, 1 mM di bestatina, 1 mM di E-64 e 1 mM di leupeptina
RPMI-1640 mediumSigma-AldrichR8758-500 mLcon L-glutammina e bicarbonato di sodio, liquido, filtrato sterile, adatto per colture cellulari
Anticorpo secondario capra anti-coniglio IgG (H+L)Invitrogen Alexa Flour Plus 488A32731
SH-SY5Y Linee cellulari di neuroblastoma che esprimono Trk-BKerafastECP007
SH-SY5Y Linea cellulare Trk-NULLKerafastECP005
Tubo per dialisi a pelle di serpenteThermo Scientific8824510K MWCO, 35 mm ID a secco
Sodio azideSigma-AldrichS2002
Cloruro di sodioBDH VWR AnaliticoBDH9286-2,5 kg
Tricorno 5/20 colonnaGE Healthcare24-4064-08
Tris-HClVWR Life Science0497-1 kg
Soluzione di tripsina-EDTASigma-AldrichT4049-500 mL0,25%, filtrato sterile, adatto per colture cellulari, 2,5 g di tripsina suina e 0,2  g EDTA

References

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