Questo documento descrive un metodo basato su colture di espianto per l'isolamento e la coltura di cellule muscolari lisce aortiche umane primarie e specifiche per il paziente e fibroblasti dermici. Inoltre, viene presentato un nuovo metodo per misurare la contrazione cellulare e la successiva analisi, che può essere utilizzato per studiare le differenze specifiche del paziente in queste cellule.
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Articolo metodologico
Isolamento delle cellule muscolari lisce aortiche primarie specifiche del paziente e misurazioni semiquantitative di contrazione in tempo reale in vitro
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule muscolari lisce (SMC) sono il tipo di cellula predominante nel mezzo aortico. Il loro meccanismo contrattile è importante per la trasmissione della forza nell'aorta e regola la vasocostrizione e la vasodilatazione. Le mutazioni nei geni che codificano per le proteine dell'apparato contrattile SMC sono associate a malattie aortiche, come gli aneurismi dell'aorta toracica. Misurare la contrazione SMC in vitro è impegnativo, specialmente in modo ad alta produttività, che è essenziale per lo screening del materiale del paziente. I metodi attualmente disponibili non sono adatti a questo scopo. Questo documento presenta un nuovo metodo basato sul rilevamento dell'impedenza del substrato elettrico della cellula (ECIS). In primo luogo, viene descritto un protocollo di espianto per isolare le SMC primarie umane specifiche del paziente dalle biopsie aortiche e dai fibroblasti dermici primari umani specifici del paziente per lo studio degli aneurismi aortici. Successivamente, viene fornita una descrizione dettagliata di un nuovo metodo di contrazione per misurare la risposta contrattile di queste cellule, compresa la successiva analisi e il suggerimento per confrontare diversi gruppi. Questo metodo può essere utilizzato per studiare la contrazione delle cellule aderenti nel contesto di studi traslazionali (cardiovascolari) e studi di screening di pazienti e farmaci.
Introduzione
Le cellule muscolari lisce (SMC) sono il tipo di cellula predominante nello strato mediale aortico, lo strato più spesso dell'aorta. All'interno della parete, sono orientati radialmente e sono coinvolti, tra le altre funzioni, nella vasocostrizione e nella vasodilatazione1. Il macchinario contrattile SMC è coinvolto nella trasmissione della forza nell'aorta attraverso il collegamento funzionale con la matrice extracellulare2. Mutazioni in geni che codificano per le proteine dell'apparato contrattile SMC, come la catena pesante della miosina muscolare liscia (MYH11) e l'actina della muscolatura liscia (ACTA2<....
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Protocollo
NOTA: Le biopsie aortiche sono state ottenute durante la riparazione dell'aneurisma aperto nei centri medici dell'Università di Amsterdam, nel centro medico dell'Università VU, Amsterdam, Zaans Medisch Centrum, Zaandam e l'ospedale Dijklander, Hoorn, Paesi Bassi. Il tessuto aortico di controllo è stato ottenuto dal pezzo dell'aorta attaccato all'arteria renale raccolta per i trapianti di rene. Sono stati inclusi solo i pazienti di età superiore ai 18 anni e tutti i pazienti hanno dato il loro consenso informato a partecipare allo studio. Tutto il materiale è stato raccolto in conformità con i regolamenti della Dichiarazione WMA di Helsinki e le linee guida istituziona....
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Risultati
Per testare la riproducibilità di questo metodo, il metodo è stato prima convalidato utilizzando solo SMC di controllo. Per determinare la riproducibilità della misurazione interesperimentale, due misurazioni indipendenti di tutte le linee cellulari di controllo e paziente incluse sono state tracciate come un grafico Bland-Altman (Figura 3B). Il grafico ha dimostrato che questo metodo non mostra variabilità al di fuori dell'intervallo di confidenza, ad eccezione di una linea cellulare anomal.......
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Discussione
Questo documento presenta un metodo per misurare la contrazione SMC in vitro, basato sui cambiamenti nell'impedenza e nell'occupazione della superficie. In primo luogo, viene descritto l'isolamento, la coltura e l'espansione delle SMC umane primarie specifiche del paziente e dei fibroblasti cutanei, seguite da come usarle per le misurazioni della contrazione.
Una limitazione dello studio è legata all'ottenimento delle cellule attraverso un protocollo di espianto. Le cellule che proli.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare Tara van Merrienboer, Albert van Wijk, Jolanda van der Velden, Jan D. Blankensteijn, Lan Tran, Peter L. Hordijk, il team PAREL-AAA e tutti i chirurghi vascolari dell'ospedale UMC di Amsterdam, Zaans Medisch Centrum e Dijklander per aver fornito materiali e supporto per questo studio.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Array a 96 pozzetti | Applied Biophysics | 96W10idf PET | Array utilizzato per misurare la contrazione nella configurazione ECIS |
| Custodiol | Dr. Franz Hö hler Chemie GmbH | RVG 12801 | Soluzione utilizzata per trasferire il tessuto dalla sala operatoria al laboratorio |
| Dimetilsolfossido | Sigma-Aldrich | Soluzione 472301 | utilizzata per diluire la ionomicina |
| Siero fetale bovino | Gibco | 26140079 | Aggiunta al terreno di coltura cellulare |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Gibco | 11550043 | Medium utilizzato per la coltura di fibroblasti cutanei |
| Terreno basale per cellule muscolari lisce vascolari umane (precedentemente ''Medium 231'') | Gibco | M231500 | Medium utilizzato per la coltura di cellule muscolari lisce |
| Invitrogen countess II | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | Contatore di cellule automatizzato |
| Sale di calcio ionomicina da Streptomyces conglobatus | Sigma-Aldrich | I0634-1MG | Composto utilizzato per la stimolazione della contrazione |
| NaCl 0,9% | Fresenius Kabi | B230561 | Soluzione utilizzata per trasferire il tessuto dalla sala operatoria al laboratorio |
| Penicillina-Streptomicina | Gibco | 15140122 | Antibiotici utilizzati per il terreno di coltura cellulare |
| Soluzione salina tamponata con fospatia | Gibco | 10010023 | Utilizzato per lavare le cellule |
| Kit Miniprep Quick-RNA | Zymo Research | R1055 | Kit utilizzato per l'isolamento dell'RNA |
| Integratore per la crescita della muscolatura liscia (SMGS) | Gibco | S00725 | Integratore che viene aggiunto al terreno di coltura di cellule muscolari lisce |
| Kit di sintesi del cDNA SuperScript VILO | di 11754250 | Thermo Fisher Scientific | utilizzato per la sintesi del cDNA |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | Reagente per qPCR |
| Tripsina-EDTA | Gibco | 15400-054 | Utilizzato per tripsinizzare cellule |
| ZTheta | Biofisica Applicata | ZTheta | ECIS strumento utilizzato per la misurazione della contrazione |
Riferimenti
- Milewicz, D. M., et al. Genetic basis of thoracic aortic aneurysms and dissections: focus on smooth muscle cell contractile dysfunction. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 9, 283-302 (2008).
- Milewicz, D. M., et al.
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Ristampe e permessi
