Questo protocollo descrive la dinamica delle infezioni virali utilizzando la luciferasi e la fluorescenza che esprimono la ricombinante (r)SARS-CoV-2 e un sistema di imaging in vivo (IVIS) in topi transgenici K18 hACE2 per superare la necessità di approcci secondari necessari per studiare le infezioni da SARS-CoV-2 in vivo.
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Articolo metodologico
Imaging dal vivo e quantificazione dell'infezione virale in topi transgenici K18 hACE2 utilizzando SARS-CoV-2 ricombinante che esprime reporter
In questo articolo
Sommario
Abstract
La pandemia di coronavirus 2019 (COVID-19) è stata causata dalla sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Ad oggi, SARS-CoV-2 è stato responsabile di oltre 242 milioni di infezioni e più di 4,9 milioni di morti in tutto il mondo. Analogamente ad altri virus, lo studio del SARS-CoV-2 richiede l'uso di metodi sperimentali per rilevare la presenza di virus in cellule infette e/o in modelli animali. Per superare questa limitazione, abbiamo generato una ricombinante (r)SARS-CoV-2 competente per la replicazione che esprime proteine bioluminescenti (nanoluciferasi, Nluc) o fluorescenti (Venus). Questi rSARS-CoV-2 che esprimono reporter consentono di tracciare le infezioni virali in vitro e in vivo sulla base dell'espressione dei geni reporter Nluc e Venus. Qui lo studio descrive l'uso di rSARS-CoV-2 / Nluc e rSARS-CoV-2 / Venere per rilevare e tracciare l'infezione da SARS-CoV-2 nell'enzima murino transgenico K18 K18 umano di conversione dell'angiotensina 2 (hACE2) precedentemente descritto utilizzando sistemi di imaging in vivo (IVIS). Questo rSARS-CoV-2/Nluc e rSARS-CoV-2/Venus mostrano patogenicità rSARS-CoV-2/WT-like e replicazione virale in vivo. È importante sottolineare che l'espressione di Nluc e Venere ci consente di tracciare direttamente le infezioni virali in vivo ed ex vivo, nei topi infetti. Questi rSARS-CoV-2/Nluc e rSARS-CoV-2/Venus rappresentano un'opzione eccellente per studiare la biologia di SARS-CoV-2 in vivo, per comprendere l'infezione virale e la malattia COVID-19 associata e per identificare efficaci trattamenti profilattici e / o terapeutici per combattere l'infezione da SARS-CoV-2.
Introduzione
La sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) è un virus a RNA avvolto, a senso positivo, a singolo filamento che appartiene al lignaggio Betacoronavirus della famiglia Coronaviridae 1. Questa famiglia virale è divisa in Alpha-, Beta-, Gamma-, e Delta-coronavirus1. Gli alfa e i betacoronavirus infettano principalmente i mammiferi, mentre il gamma e il deltacoronavirus infettano quasi esclusivamente gli uccelli2. Ad oggi, sette coronavirus (CoV) hanno attraversato le barriere delle specie ed sono emersi come coronavirus umani (HCoV): due alfa-CoV (HCoV-229E e HCoV-NL63) e....
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Protocollo
I protocolli che coinvolgono topi transgenici K18 hACE2 sono stati approvati dal Texas Biomedical Research Institute (TBRI) Institutional Biosafety Committee (IBC) e dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Tutti gli esperimenti seguono le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio del Consiglio Nazionale delleRicerche 40. Il dispositivo di protezione individuale (DPI) appropriato è necessario quando si lavora con i topi.
1. Uso di topi transgenici K18 hACE2
- Acquistare e mantenere topi femmina di 4-6 settimane B6.Cg-Tg (K18-ACE2) ....
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Risultati
Infezione da rSARS-CoV-2/Nluc in topi transgenici K18 hACE2 (Figure 1 e 2)
La Figura 1A mostra una rappresentazione schematica di rSARS-CoV-2/WT (in alto) e rSARS-CoV-2/Nluc (in basso) utilizzati per valutare le infezioni in vivo. La Figura 1B mostra il diagramma di flusso schematico applicato per valutare la dinamica dell'infezione da rSARS-CoV-2/Nluc nei topi transgenici K18 hACE2. Top.......
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Discussione
Questo protocollo dimostra la fattibilità dell'utilizzo di questi geni reporter che esprimono rSARS-CoV-2 per monitorare le infezioni virali in vivo. Entrambi i virus ricombinanti che esprimono reporter forniscono uno strumento eccellente per studiare le infezioni da SARS-CoV-2 in vivo. I sistemi di imaging ex vivo (rSARS-CoV-2/Venus) e in vivo (rSARS-CoV-2/Nluc) descritti rappresentano un'ottima opzione per comprendere le dinamiche dell'infezione da SARS-CoV-2, la patogenesi virale e .......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di qualsiasi conflitto di interessi commerciale, finanziario e non finanziario o personale in relazione al lavoro descritto.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare i membri del nostro istituto (Texas Biomedical Research Institute) per i loro sforzi nel mantenere le nostre strutture pienamente operative e sicure durante la pandemia di COVID-19. Vorremmo anche ringraziare il nostro Comitato istituzionale per la biosicurezza (IBC) e spell (IACUC) per aver rivisto i nostri protocolli in modo efficiente in termini di tempo. Ringraziamo il Dr. Thomas Moran della Icahn School of Medicine del Mount Sinai per aver fornito l'anticorpo monoclonale della proteina nucleocapsside (N) cross-reattivo 1C7C7 SARS-CoV. La ricerca SARS-CoV-2 nel laboratorio di Martinez-Sobrido è attualmente supportata dalle sovvenzioni NIAID / ....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,5% Triton X-100 | J.T.Baker | X198-07 | Conservare a temperatura ambiente (RT) |
| 1% DEAE-Dextran | MP Biomedicals | 195133 | |
| 10% Soluzione di formalina, tamponato neutro | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Agar | Oxoid | LP0028 | |
| Piastra per coltura cellulare a 24 pozzetti | Greiner Bio-one | 662160 | |
| Bicarbonato di sodio al 5% | Sigma Aldrich | S-5761 | |
| Piastra per colture cellulari a 6 pozzetti | Greiner Bio-one | 657160 | |
| Piastra per colture cellulari a 96 pozzetti | Greiner Bio-one | 655-180 | |
| Cellule epiteliali renali di scimmia verde africana (Vero E6) | ATCC | CRL-1586 | |
| Ami HT | Spectral Instruments Imaging | ||
| Aura Software di imaging 3.2.0 | Spectral Instruments Software | analisi delle immagini | |
| Albumina sierica bovina (BSA), 35% | Sigma-Aldrich | A9647 | Negozio a 4 ° C |
| Acqua per colture cellulari | Corning | 25-055-CV | |
| Dulbecco' s Eagle modificato' s medio (DMEM) | Corning Cellgro | 15-013-CV | Negozio a 4 ° C |
| Macchina per anestesia a gas | Veterinary Anesthesia Systems, Inc. | VAS 2001R | |
| Siero Fetale Bovino (FBS) | Seradigm | 1500-050 | Conservare a -20 ° C |
| Topi transgenici K18-hACE2 femmina di età compresa | The Jackson Laboratory | 34860 | |
| Graphpad Prism Versione 9.1.0 | GraphPad | ||
| Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Negozio presso RT |
| MARS Software di analisi dati | BMG LABTECH | ||
| MB10 compresse | QUIP Laboratories | MBTAB1.5 | Negozio su RT |
| Reagente per il saggio della luciferasi nano-Glo | Promega | N1110 | Questo reagente viene utilizzato per misurare l'attività di Nluc. Conservare a -20 ° C |
| Nunc MicroWell Micropiastre a 96 pozzetti | ThermoFisher Scientific | 269620 | |
| Nunc MicroWell Micropiastre a 96 pozzetti | ThermoFisher Scientific | 269620 | |
| Penicillina/Streptomicina/L-glutammina (PSG) 100x | Corning | 30-009-CI | Conservare a -20 ° C |
| PHERAstar FSX | BMG LABTECH | PHERAstar FSX | |
| Precelleys Omogeneizzatore Evolution | Bertin Instruments | P000062-PEVO0-A Omogeneizzante | |
| per tessuti molli CK14 - 7 mL | Bertin Instruments | P000940-LYSK0-A | |
| T75 EasYFlask | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| VECTASTAIN ABC-HRP Kit, perossidasi | Kit | PK-4002 | e kit substrato DAB perossidasi |
Riferimenti
- V'Kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H., Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 155-170 (2021).
- Pal, M., Berhanu, G., Desalegn, C., Kandi, V. Severe acute respiratory syndrome cor....
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Ristampe e permessi
