Modellazione di microrganismi e microparticelle attraverso l'assemblaggio sequenziale assistito da capillarità

Summary

Presentiamo una tecnologia che utilizza l'assemblaggio assistito dalla capillarità in una piattaforma microfluidica per modellare oggetti di dimensioni micro sospesi in un liquido, come batteri e colloidi, in matrici prescritte su un substrato di polidimetilsilossano.

Abstract

La modellazione controllata dei microrganismi in disposizioni spaziali definite offre possibilità uniche per una vasta gamma di applicazioni biologiche, compresi studi di fisiologia microbica e interazioni. Al livello più semplice, un accurato pattern spaziale dei microrganismi consentirebbe l'imaging affidabile e a lungo termine di un gran numero di singole cellule e trasformerebbe la capacità di studiare quantitativamente le interazioni microbo-microbo dipendenti dalla distanza. Più unicamente, l'accoppiamento di modelli spaziali accurati e il pieno controllo sulle condizioni ambientali, come offerto dalla tecnologia microfluidica, fornirebbe una piattaforma potente e versatile per studi su singole cellule in ecologia microbica.

Questo documento presenta una piattaforma microfluidica per produrre modelli versatili e definiti dall'utente di microrganismi all'interno di un canale microfluidico, consentendo un accesso ottico completo per il monitoraggio a lungo termine e ad alta produttività. Questa nuova tecnologia microfluidica si basa sull'assemblaggio di particelle assistito dalla capillarità e sfrutta le forze capillari derivanti dal movimento controllato di una sospensione evaporante all'interno di un canale microfluidico per depositare singoli oggetti di dimensioni micrometriche in una serie di trappole microfabbricate su un substrato di polidimetilsilossano (PDMS). Le deposizioni sequenziali generano il layout spaziale desiderato di singoli o più tipi di oggetti di dimensioni micro, dettato esclusivamente dalla geometria delle trappole e dalla sequenza di riempimento.

La piattaforma è stata calibrata utilizzando particelle colloidali di diverse dimensioni e materiali: ha dimostrato di essere un potente strumento per generare diversi modelli colloidali ed eseguire la funzionalizzazione superficiale delle particelle intrappolate. Inoltre, la piattaforma è stata testata su cellule microbiche, utilizzando cellule di Escherichia coli come batterio modello. Migliaia di singole cellule sono state modellate sulla superficie e la loro crescita è stata monitorata nel tempo. In questa piattaforma, l'accoppiamento della deposizione monocellulare e della tecnologia microfluidica consente sia la modellazione geometrica dei microrganismi che il controllo preciso delle condizioni ambientali. Apre così una finestra sulla fisiologia dei singoli microbi e sull'ecologia delle interazioni microbo-microbo, come dimostrato da esperimenti preliminari.

Introduction

La modellazione spaziale di singoli microrganismi, in particolare all'interno di arene sperimentali che consentono il pieno controllo sulle condizioni ambientali, come i dispositivi microfluidici, è altamente auspicabile in una vasta gamma di contesti. Ad esempio, organizzare i microrganismi in array regolari consentirebbe l'imaging accurato di un gran numero di singole cellule e lo studio della loro crescita, fisiologia, espressione genica in risposta a stimoli ambientali e suscettibilità ai farmaci. Consentirebbe inoltre di studiare le interazioni cellula-cellula di particolare interesse nella ricerca sulla comunicazione cellulare (ad esempio, quorum sensing), cross....

Protocol

1. Preparazione del master del silicio

NOTA: I modelli PDMS con le trappole microfabbricate che formano il modello per il pattern colloidale e microbico sono stati fabbricati secondo il metodo introdotto da Geissler et al. ¹⁷. Il master in silicio è stato preparato con la litografia convenzionale in una camera bianca. Vedere i seguenti passaggi per la procedura e la tabella dei materiali per l'apparecchiatura.

1. Progettare le funzionalità utilizzando il software CAD (Computer-Aided Design).
2. Preparare la maschera in vetro cromato con uno strato di f....

Results

È stata sviluppata una piattaforma microfluidica che sfrutta l'assemblaggio assistito dalla capillarità per modellare particelle colloidali e batteri in trappole microfabbricate su un modello PDMS. Due diverse geometrie di canale sono state progettate per ottimizzare il pattern di colloidi e batteri attraverso l'assemblaggio assistito dalla capillarità. La geometria del primo canale (Figura 1B) è costituita da tre sezioni parallele lunghe 23 mm senza barriere fisiche tra di loro. Le due sezi.......

Discussion

La piattaforma microfluidica qui descritta consente la modellazione di oggetti di dimensioni micro, come colloidi e batteri, in disposizioni spaziali prescritte su un substrato PDMS. Il pieno controllo sulle condizioni ambientali offerto dalla microfluidica e la capacità di modellare le cellule con precisione micrometrica garantita dalla tecnologia sCAPA lo rendono una piattaforma molto promettente per futuri studi di fisiologia ed ecologia.

Negli esperimenti presentati in questo lavoro, il ma.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcatel AMS 200SE I-Speeder	Alcatel Micro Machining System		Sistema di scambio ionico reattivo profondo Detergente
Alconox
Sviluppatore AZ400K	Microchemicals	AZ400K
BD Siringa da 10 ml (Luer-Lock)	BD	300912	utilizzato per lavare il brodo di lisogenia fresco nel canale microfluidico
Box Incubator	Life Servizi		di imaging utilizzati per garantire una temperatura uniforme e costante nel canale
Centrifuga	Eppendorf	5424R	utilizzata per sostituire il terreno notturno con un terreno minimo fresco
Fiala da centrifuga	Eppendorf	30120086	1,5 mL
CETONI Base 120 CETONI GmbH			Pompa a siringa
Particelle fluorescenti PS di diametro 0,98 &; m (red)	microParticles GmbH	PS-FluoRed-Fi267
Particelle PS fluorescenti di diametro 1,08 &; m (green)	microParticles GmbH	PS-FluoGreen-Fi182
Particelle PS fluorescenti di diametro 2.07 &; m (green)	microParticles GmbH	PS-FluoGreen-Fi183
Particelle PS fluorescenti di diametro 2.08 &; micro; m (rosso)	microParticles GmbH	PS-FluoRed-Fi180
Gigabatch 310 M	PVA TePla		utilizzato per il trattamento al plasma di un wafer di silicio da 10 cm
H401-T-CONTROLLER	Okolab		controller della lastra di vetro riscaldata
H601-NIKON-TS2R-GLASS	Lastra di vetro riscaldata	Okolab
Heidelberg DWL 2000	Heidelberg Instruments		Laser diretto UV siringhe
insulina, U 100, con luer	Codan Medical ApS	CODA621640	siringa da 1 mL utilizzata per prelevare la sospensione liquida durante il processo di patterning
Klayout	Opensource		utilizzato per progettare le caratteristiche sul master del silicio
LB Broth, Miller (Luria-Bertani)	Fisher Scientific	244610	Brodo di lisogenesi scaricato nel canale microfluidico
Masterflex tubo di trasferimento	Masterflex	HV-06419-05	0.020'' ID, 0.06'' OD
MOPS (10x)	Teknova	M2101	diluito dieci volte con acqua milliQ e utilizzato per sostituire il mezzo notturno
Nikon Eclipse Ti2	Nikon Instruments
microscopio openSCAD	Opensource		utilizzato per progettare lo stampo
OPTIspin SB20	ATM gruppo	51-0002-01-00	spin developer
Camera al plasma Zepto	Diener Electronic	ZEPTO-1	utilizzato per trattare al plasma il modello e il microcanale per legarli
Fotoresist positivo AZ1505	MicroChemicals	AZ1505
Fosfato di potassio bibasico	Sigma Aldrich	P3786	aggiunto a MOPS 1x
Macchina per la polimerizzazione e il lavaggio Prusa CW1S	Prusa		utilizzato per garantire che tutto il polimero sia polimerizzato e il polimero non polimerizzato venga rimosso dallo stampo
Resina Prusa - Tough	Prusa Research a.s.		Resina liquida UV fotosensibile da 405 nm per la stampa 3D
Stampante 3D Prusa SL1	Prusa		utilizzata per stampare lo stampo
Bilancia	VWR-CH	611-2605	utilizzata per pesare la miscela PDMS
Wafer di silicio (10 cm)	Silicon Materials Inc.		N/Phos < 100> 1-10 e Omega; cm
Sü ss MA6 Allineatore	maschera SUSS MicroTec Group		utilizzato per allineare la maschera di cromo-vetro e il substrato ed esporre il substrato
Sylgard 184	Dow Corning	kit di elastomero siliconico
Techni Etch Cr01	Technic		mordenzante al cromo
tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroottil) silano	Sigma Aldrich	448931	utilizzato per silianizzare lo stampo stampato in 3D
TWEEN 20	Sigma Aldrich	P1379	utilizzato per garantire un angolo di contatto di allontanamento ottimale durante il processo di modellatura
Veeco Dektak 6 M	Veeco		profilometro
VTC-100 Vacuum Spin Coater	MTI corporation		spin coater sottovuoto